付 旭， 張 璐， 姜志強， 韓雨哲，張德洪， 王武剛， 尹 恒， 米海峰

（1.通威農業(yè)發(fā)展有限公司水產研究所，四川 成都 610093；2.大連海洋大學，遼寧 大連 116023；3.農業(yè)農村部水產畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖重點實驗室，四川 成都 610093；4.水產健康養(yǎng)殖四川省重點實驗室，四川 成都 610093）

葉黃素分子式為C40H56O2， 又稱植物黃體素， 是由8 個異戊二烯為單位所組成的含有2 個羥基的共軛烯烴，是一種無維生素A 活性的類胡蘿卜素（孟哲和劉紅云，2007）。

王軍波等（2004）在葉黃素與免疫功能的研究中提出， 葉黃素可以促進抗原刺激后的淋巴細胞的增殖，并且影響細胞表面分子的功能性表達，來達到促進細胞免疫的效果； 葉黃素還可以通過增加B 細胞亞群數(shù)量、增強抗體反應以及促進血漿免疫球蛋白水平的形式來增強體液免疫反應；葉黃素可以增強氧化酶的活性和巨噬細胞細胞色素氧化酶，并對巨噬細胞活性也具有促進作用，由此可以增強巨噬細胞突發(fā)性呼吸作用， 使巨噬細胞可以更有效的對微生物和外源性抗原物質起到殺滅作用， 從而達到增強生物體非特異性免疫的作用；在亞細胞結構中，葉黃素的存在可以防止免疫細胞被氧化損傷，以保證完好的細胞功能，使其更好的發(fā)揮免疫功能，此外，葉黃素還可以通過調節(jié)細胞間通訊和細胞膜流動性來影響免疫功能。 孫振等（2005）在收集充分的試驗實例得出結論顯示葉黃素具有抗癌的作用。 Aman 等（2005）發(fā)現(xiàn)，葉黃素分布在視網膜黃斑部和晶狀體中，具有光保護性和抗氧化性，吸收大量藍光，通過物理或化學淬滅作用滅活單線態(tài)氧， 清除自由基來保護視神經，對視網膜功能起到決定性作用。

淡黑鑷麗魚隸屬鱸形目，慈鯛科，鑷麗魚屬，又名非洲王子，體色為檸檬黃色，背鰭、胸鰭和臀鰭邊緣有一條黑色的條帶， 其野生屬身上會帶有部分黑色雜斑。 淡黑鑷麗魚最大體長為8 ～10 cm，最長壽命7 ～10 年，最適水溫為23 ～28 ℃，最適水體pH 為7.5 ～8（城市漁夫和諾言，2006）。淡黑鑷麗魚屬于觀賞價值較高的觀賞魚， 目前鮮有針對淡黑鑷麗魚的各方面研究，需要進行拓充。本試驗將以淡黑鑷麗魚作為研究對象， 探討飼料中葉黃素水平對淡黑鑷麗魚消化酶、 抗氧化酶及免疫酶活力造成的影響， 為開發(fā)淡黑鑷麗魚人工養(yǎng)殖使用的配合飼料提供相關理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗所使用淡黑鑷麗魚為當?shù)仞B(yǎng)殖場自行繁育。 體長 （4.7±0.1）cm， 體質量（1.70±0.09）g。

1.2 試驗飼料的制備 試驗飼料原料由大連龍源海洋生物有限公司提供， 經過充分的粉碎、過篩、攪拌混合后，通過小型顆粒料制粒機制粒，置于60 ℃烘箱進行烘干， 成品于-20 ℃冰箱避光、真空密封保存。糖源由淀粉等物質提供，蛋白源由豆粕及魚粉提供，脂肪源由大豆油（益海嘉里食品營銷有限公司，上海）提供。 DZ（對照組）、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，6 組分別添加4%葉黃素（石家莊綠川生物有限公司）0、1、2、5、10、40 g/kg， 并用纖維素進行調平，纖維素添加量分別為175、145、115、83、5 g/kg，試驗飼料組成及營養(yǎng)成分含量見表1，混合維生素和混合礦物質配方參考王莉蘋等（2017）。

表1 試驗飼料營養(yǎng)成分含量（干物質基礎）

1.3 試驗設計及飼養(yǎng)管理 取狀態(tài)良好、體態(tài)差異小的淡黑鑷麗魚144 尾， 隨機平均分成6 個試驗梯度，即DZ（對照組）、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，分別投喂添加4%葉黃素（石家莊綠川生物有限公司）0、1、2、5、10、40 g/kg 的飼料， 對應實測葉黃素含量依次為20.57、58.68、86.04、167.72、310.60 mg/kg和1090.41 mg/kg，作為6 個試驗組，每個試驗組設計3 個平行組，各平行組放置8 尾試驗魚，整個試驗置于控溫循環(huán)水系統(tǒng)（大連匯新鈦有限責任公司，大連）中進行，循環(huán)水流量3 L/min，養(yǎng)殖水體體積30 L。 各組隨機布置于此系統(tǒng)中，共18 個循環(huán)水槽。 水溫恒定于25.0 ℃，每日分別于8：00和16：00 進行表觀飽食投喂， 投喂1 h 后清理糞便及雜質，每日18：00 換水，換水量為20%，保持水質良好穩(wěn)定，每日光照12 h。 氣泵充氣保持氧氣充足（DO≥7.0 mg/L）。 試驗共進行68 d。

1.4 試驗取樣以及方法 試驗取樣及方法參照付旭等（2017）操作方法。試驗期間觀察魚的生長、發(fā)育、攝食及死亡情況。 試驗結束并停食24 h 后，隨機于各平行組中取6 尾試驗魚， 至于冰袋上，紗布擦干體表水分后，使用無菌解剖工具解剖并取其完整的腸道及肝臟。將各平行組所取全部試驗魚的腸道樣品進行混樣處理用于檢測消化酶等相關指標，肝臟樣品進行混樣處理用于檢測抗氧化酶及免疫酶等相關指標，放入對應組別的離心管內，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱短暫儲存，樣品加入預冷的生理鹽水并于0 ℃無菌操作環(huán)境下充分勻漿制成20%的勻漿液， 于4 ℃、2500 r/min 離心10 min 后取上清，再稀釋成所檢測的不同種酶的最適檢測濃度進行測試。 勻漿液在8 h 內完成測試。

1.5 指標測定與計算 采用試劑盒（南京建成生物有限公司），對過氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、 谷胱甘肽過氧化物酶 （GSHPX）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）、淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶（PRS）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、乳酸脫氫酶（LDH）和溶菌酶（LZM）、谷丙轉氨酶（ALT/GPT）和谷草轉氨酶（AST/GOT）進行測定，并對結果進行分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 所得數(shù)據(jù)均采用 “平均值±標準誤”表示，并采用SPSS 20.0 分析軟件進行方差齊次檢驗和單因素方差分析 （One-Way ANOVA），并進行Duncan 氏多重比較， 顯著性水平設置為0.05。

2 結果

2.1 飼料中葉黃素含量對淡黑鑷麗魚消化能力的影響 如表2 所示， 伴隨淡黑鑷麗魚攝入的葉黃素的增加，AMS 活力試驗組均高于DZ 組，且除Y3 外其余各試驗組均與DZ 組有顯著差異 （P＜0.05），Y5 出現(xiàn)最大值；PRS 活力Y5 組顯著高于其他各試驗組和DZ 組（P＜0.05），除Y5 組外其他各組均無顯著差異（P＞0.05）；LPS 活力各組間均無顯著差異 （P＞0.05）， 其中Y2 組出現(xiàn)最低值，Y5 組出現(xiàn)最高值，且高于DZ 組兩倍。

表2 飼料葉黃素水平對淡黑鑷麗魚腸道消化酶活力的影響

2.2 飼料中葉黃素含量對淡黑鑷麗魚免疫能力的影響 如表3 所示， 伴隨淡黑鑷麗魚攝入葉黃素水平的提高，AKP 呈先升后降趨勢，除Y1 組和Y2 組外其余三組均低于DZ 組，且Y3 組和Y5 組顯著低于DZ 組、Y1 組和Y2 組 （P＜0.05）；ACP呈下降趨勢，ACP 各試驗組均低于DZ 組， 并且Y4 組達到最低值，且顯著低于DZ 組（P＜0.05）；LZM 各組之間均無顯著差異，各組之間數(shù)值較平穩(wěn)（P＞0.05）； LDH 各組間無顯著差異，且數(shù)值之間無規(guī)律（P＞0.05）。

表3 飼料葉黃素水平對淡黑鑷麗魚肝臟免疫酶活力的影響

2.3 飼料中葉黃素含量對淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響 如表4 所示， 伴隨淡黑鑷麗魚攝入葉黃素水平的提高，CAT、GSH-PX、T-SOD 和TAOC 均呈先升后降趨勢。 其中對T-AOC 活力的影響表現(xiàn)為所有組之間均無顯著差異， 但于Y2組出現(xiàn)最大值（P＞0.05）；對T-SOD 活力的影響表現(xiàn)為Y1 組出現(xiàn)最大值，并與除Y5 組外的所有組有顯著差異性 （P＜0.05），Y4、Y5 組顯著高于DZ 組（P＜0.05），并且所有試驗組均高于DZ 組；對CAT 活力的影響表現(xiàn)為Y3 組出現(xiàn)最高值并與Y4 組和Y5 組差異顯著（P＜0.05），Y5 組顯著低于Y2 組和Y3 組 （P＜0.05）， 各試驗組均與DZ組無顯著差異（P＞0.05）；對GSH-PX 活力的影響表現(xiàn)為Y1 組顯著高于其余各組（P＜0.05），除Y3 組與DZ 組無顯著差異外（P＞0.05），其余各組之間均存在顯著差異性（P＜0.05）；MDA 則呈先降后升并于Y3 組開始趨于平穩(wěn)的趨勢， 并且所有試驗組均低于DZ 組， 并于Y2 組出現(xiàn)最小值，且與Y3 組和DZ 組產生顯著差異（P＜0.05）。

表4 飼料葉黃素水平對淡黑鑷麗魚肝臟抗氧化酶活力的影響

3 討論

3.1 飼料葉黃素水平對淡黑鑷麗魚消化能力的影響 陳進樹等（2009）對魚類消化酶的研究中提出， 消化酶作為對食物分解吸收必不可少的酶，對魚類生長發(fā)育起關鍵作用。不同食性、品種以及處于不同發(fā)育時期的魚類的消化酶活力均有差異，生存環(huán)境如溫度、pH 等也會影響消化酶活力。 攝入餌料等外源物質同樣對消化酶有影響。消化酶活力反映了魚類對營養(yǎng)物質的消化吸收能力，從而決定了魚類生長發(fā)育的性能。目前，類胡蘿卜素對魚類消化酶影響的研究相對較少，其中張芬等（2017）對小丑魚（Amphiprioninae）的研究發(fā)現(xiàn)，小丑魚的胃腸部的消化酶活性受蝦青素的影響較為明顯，且在一定范圍內，隨著攝入蝦青素量的增加，其LPS、PRS 和AMS 的活力升高，且均高于對照組。本試驗所得結果表示，高葉黃素攝入對淡黑鑷麗魚的AMS 和PRS 起到了促進的作用。在攝入低濃度葉黃素時試驗組的PRS和LPS 與DZ 組均差異不顯著，但在最高葉黃素濃度組中，PRS、LPS 以及AMS 均與DZ 組相差較多，且PRS 與AMS 差異顯著，故試驗證明淡黑鑷麗魚大量攝入葉黃素（1090.41 mg/kg）時會促進PRS 與AMS 的活力。

3.2 飼料葉黃素水平對淡黑鑷麗魚免疫酶活力的影響 磷酸酶又稱為磷酸單酯水解酶， 是可催化各種含鱗化合物水解的酶類， 根據(jù)最適pH 分為AKP 和ACP。 唐林等（2006）提出，磷酸酶與動物機體的骨化作用有關。 詹付鳳等（2007）報道，AKP 通過調節(jié)體內磷鈣代謝從而影響魚類的生長發(fā)育，ACP 作為溶酶體的標志酶之一， 反映細胞消化過程。何海琪等（1992）提出，磷酸酶干預生物對營養(yǎng)物質的消化、吸收和轉運。本試驗以肝臟做勻漿測得的高濃度葉黃素攝入組的淡黑鑷麗魚，AKP 和ACP 顯著低于DZ 組， 肝臟具有解毒作用， 故表現(xiàn)為葉黃素攝入量過高會造成淡黑鑷麗魚肝臟受到損傷，使其解毒功能減弱，或影響其免疫能力。陳艷等（2009）闡述LZM 為正常機體免疫防御機制的組成部分， 其在機體內溶解體內細菌細胞壁，從而起到殺菌作用。本試驗結果表明淡黑鑷麗魚肝臟中的LZM 活力不受攝入葉黃素濃度的影響， 從而證明攝入葉黃素的量對抵抗體外入侵的細菌的能力沒有影響。 陳思翀等（2008）闡述LDH 是在細胞內催化乳酸氧化成丙酮酸，其組織中的濃度高于血液中的活力，當肝臟、腎臟以及肌肉組織中的細胞結構發(fā)生非正常大量破損時，其活力會受到影響。 本試驗隨著淡黑鑷麗魚攝入葉黃素量的增加，LDH 沒有改變， 說明體內沒有發(fā)生其所述的組織細胞大量破損。

3.3 飼料葉黃素水平對淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響 Chew 等（2004）表示，葉黃素是一種良好的抗氧化劑，可以捕獲自由基、猝滅單線態(tài)氧，防止自由基破壞生物膜。 Beckman 等（1997）同樣表示， 葉黃素發(fā)揮其生物活性的作用機理是通過猝滅活性氧族達到對活性氧自由基的活性抑制的作用， 從而起到保護正常細胞不被活性氧自由基破壞的效果。 蘇卿等（2014）在對葉黃素的研究中發(fā)現(xiàn)， 葉黃素因其抗氧化性能而被廣泛應用于各個領域，但葉黃素具有抗氧化和促氧化的雙重作用，其通過體外的化學方法和脫細胞彗星試驗表明葉黃素的含量過高或者過低時會表現(xiàn)出促氧化作用， 但在生物體內的抗氧化和促氧化作用未作研究。 故本試驗旨在探究葉黃素對淡黑鑷麗魚抗氧化能力的最適添加量。 水產動物肉質腐敗的主要原因是脂類物質的氧化，MDA 是脂類物質的氧化產物， 是衡量脂類氧化程度的重要指標（Scaife等，2015）。 本試驗的試驗組MDA 均低于DZ 組，說明葉黃素對淡黑鑷麗魚的脂類氧化起到了抑制作用， 故證明試驗中添加葉黃素對淡黑鑷麗魚體內產生了抗氧化作用。 在Zhang 等（2013）對虹鱒的研究中發(fā)現(xiàn)， 飼料中添加100 mg/kg 的蝦青素時，虹鱒血清中的CAT 和T-SOD 顯著降低，肌肉中的MDA 顯著降低，肝臟中的T-AOC 提高。 在趙鑫鑫等（2016）對虹鱒、金魚以及錦鯉受類胡蘿卜素影響的研究中得出，飼料中分別添加100 mg/kg的葉黃素、蝦青素、雨生紅球藻以及角黃素均使金魚肝臟中的T-AOC 升高，MDA 降低，得出這四種添加劑對金魚抗氧化酶活性有提升的作用。 在阿倫等（2009）于葉黃素對鵪鶉（Coturnix）的影響研究中發(fā)現(xiàn)， 飼料中添加葉黃素其子代鵪鶉血清的各個抗氧化酶活性于14 d 時均低于對照組，并差異顯著， 于21 d 測得則與對照組差異不顯著，其解釋為子代鵪鶉體內的葉黃素發(fā)揮抗氧化作用與抗氧化酶共同清除活性氧自由基， 從而使抗氧化酶活性降低，隨著母源性葉黃素被逐漸消耗，葉黃素起到的抗氧化作用比例降低， 使得自身的抗氧化酶活力恢復。結合以上試驗的結果，本試驗中添加少量葉黃素時對淡黑鑷麗魚自身的抗氧化酶活力起到促進作用，故各抗氧化酶活力高于DZ 組，MDA 低于DZ 組。 當葉黃素添加量繼續(xù)升高時抗氧化酶活力被促進的同時， 部分葉黃素開始協(xié)助抗氧化酶分解自由基，此時抗氧化酶活力高于DZ組， 但部分抗氧化酶活力較最高值降低，MDA 含量在此時含量達最低值。 當葉黃素添加量繼續(xù)升高時，葉黃素開始承擔大部分分解自由基的功能，使抗氧化酶活力顯著降低，但MDA 低于DZ 組并保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。

4 結論

本試驗結果表明， 黑鑷麗魚大量攝入葉黃素（1090.41 mg/kg） 時會促進PRS 與AMS 的活力。葉黃素攝入量≥167.72 mg/kg 時， 會降低磷酸酶活力，或為淡黑鑷麗魚肝臟受損所致，使其解毒功能減弱， 或影響其免疫能力。 適當攝入葉黃素（58.68 ～86.04）mg/kg 時，可以增加淡黑鑷麗魚的抗氧化能力。