來進成， 劉東花， 李潤樺， 劉 麗 ， 竇莉蓉， 羅 蘭

（1.甘肅省畜牧技術推廣總站，甘肅 蘭州 730000；2.山丹縣畜牧技術推廣站，甘肅 張掖 734000；3.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，新疆 烏魯木齊 830000）

牦牛是生活在青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山高寒地區(qū)的大型反芻家畜，是當地牧民重要的生產、生活資料，具有不可替代的生態(tài)和經濟學地位。對于牦牛養(yǎng)殖來說，精準的營養(yǎng)供給是提高生產性能、促進產業(yè)發(fā)展、增加牧民收入的重要策略。如何有效利用飼糧的營養(yǎng)水平調控牦牛瘤胃微生物區(qū)系，改善瘤胃內環(huán)境，進而提高飼料利用率和營養(yǎng)吸收率，是牦牛營養(yǎng)研究的一個重要方向。

瘤胃是反芻動物飼料發(fā)酵、 營養(yǎng)消化的重要場所， 可消化飼料中70% ～85%的可消化物和50%的粗纖維（潘美娟等，2012）。瘤胃功能的發(fā)揮主要依靠結構復雜和數量豐富的微生物群落，其中， 細菌在整個瘤胃微生物區(qū)系中約占95%；古細菌占比為2% ～4%；真核生物約占1%，主要由原生動物和真菌組成（Brulc 等，2009）。 瘤胃微生物之間相互協(xié)調、 相互制約共同維持著瘤胃內環(huán)境的平衡與穩(wěn)定， 通過厭氧發(fā)酵幫助宿主將自身難以利用的纖維素、半纖維素、木質素和非蛋白氮等物質轉化為可消化的化合物（韓旭峰，2015），為宿主提供65% ～75%的能量（郭紅等，2022）。 此外，微生物本身隨后在胃中被消化，并作為反芻動物的主要蛋白質來源。因此，建立穩(wěn)定良好的微生物區(qū)系對維持機體健康、提高動物生產性能、改善動物產品質量、 減少環(huán)境污染等方面具有重要的意義（崔浩然等，2021），相反，瘤胃微生物區(qū)系的紊亂會導致宿主免疫力降低、生產性能下降等（馬健等，2020）。因此，瘤胃微生物區(qū)系的研究一直是反芻動物研究的熱點領域。

研究證實， 飼糧的改變可使瘤胃微生物群落打破原來的穩(wěn)定微生態(tài)，建立新平衡，實現(xiàn)對微生物宿主的代謝調控， 進而影響生產性能 （唐鵬，2018）。粗蛋白質作為飼糧中僅次于能量的第二大營養(yǎng)源，是影響動物生長、發(fā)育、健康和環(huán)境的一個重要因素。 其含量變化會影響提供給反芻動物的氮源。 已有學者在肉牛、山羊、綿羊等反芻動物中進行了研究（李蔣偉等，2022；張春霞，2022；牛驍麟等，2020；唐鵬，2018；李秋鳳等，2015），分析不同粗蛋白質水平對生產性能或瘤胃微生物區(qū)系的影響，但在牦牛上相關報道有限。 因此，本試驗旨在研究飼糧不同蛋白水平對育肥牦牛生長性能、屠宰性能以及瘤胃微生物區(qū)系的影響，為牦牛養(yǎng)殖中合理調配飼糧蛋白水平， 進一步挖掘瘤胃微生物功能和調控機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理 試驗用育肥牦牛均來自張掖市肅南裕固族自治縣天然放牧的2.5 周歲左右牦牛， 于2021 年12 月收購運輸至民樂縣德華畜牧有限公司進行后續(xù)試驗。 選取體重［（190.88±5.97）kg］ 相近、 體況良好的公牦牛12頭，完全隨機平均分成2 組，分別飼喂粗蛋白質水平為13.53%（D 組）和16.20%（G 組）的全混合日糧。按照試驗設計，預飼期15 d，正飼期120 d。試驗用全混合日糧依據我國 《肉牛飼養(yǎng)標準》（NY/T815-2004） 的肉牛營養(yǎng)標準推薦值和飼養(yǎng)經驗進行配制。正式試驗開始前對試驗牛進行編號，每組單圈飼養(yǎng)。在牦牛熟悉并適應試驗料，采食量達到正常狀態(tài)（即體重的2%以上）正式開始試驗記錄。 每天9：00 和18:00 進行飼喂，自由采食，自由飲水，牦牛的管理按牛場常規(guī)要求進行，各組飼養(yǎng)管理條件保持一致。 全混合日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 全混合飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）

1.2 樣品采集與處理 飼養(yǎng)試驗最后一天晨飼前，利用胃管式采樣器采集瘤胃液150 mL/頭，經4 層無菌紗布過濾，分裝至20 mL 離心管中，立即用液氮速凍后-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)分析（龐凱悅等，2022）。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 生長性能及屠宰性能測定 正式試驗第1天和第120 天對所有試驗牦牛進行空腹稱重，記錄初始體重和宰前活重， 計算總增重和平均日增重。 試驗結束當天，對所有牦牛進行屠宰，記錄胴體重并計算屠宰率。

1.3.2 瘤胃液微生物區(qū)系測定 將瘤胃液樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司， 根據E.Z.N.A.RsoilDNA Kit 試劑盒說明書提取12 個樣本的微生物群落基因組DNA。 使用引物338F （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對細菌16S rRNA V3 ～V4 區(qū)進行PCR 擴增， 通過Illumina Miseq PE300 型高通量測序儀進行測序。

1.4 數據統(tǒng)計與分析 生長性能、屠宰性能數據使用Excel 2010 軟件進行整理， 利用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析和T 檢驗，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著，結果均以“平均值±標準差”表示。

微生物數據分析在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺上進行，使用fastp 和FLASH 軟件根據overlap 關系對PE reads 進行拼接， 同時對序列質量進行質控和過濾，得到優(yōu)化序列。 利用Uparse軟件，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU 聚類， 在聚類過程中去除嵌合體， 得到OTU 的代表序列， 并對序列進行抽平處理。 由Mother 軟件計算α 多樣性指數。 采用RDP classifier 貝葉斯算法對OTU 代表序列進行分類學分析，通過與silva（Release138 http://www.arb-silva.de）數據庫比對，獲得各水平上的不同生物分類信息及其相對豐度信息，并分別在各個分類學水平統(tǒng)計群落物種組成。運用Wilcox 秩和檢驗比較兩組在門、屬水平上的菌落組成差異。分析結果以“平均值±標準差” 表示，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同粗蛋白質水平飼糧對育肥牦牛生產性能的影響 由表2 可知，飼糧不同粗蛋白質水平對牦牛宰前活重、 胴體重和屠宰率的影響差異不顯著，但D 組測定值均高于G 組（P＞0.05）。 隨著飼糧蛋白水平的降低，D 組牦牛的總增重和平均日增重較G 組分別增加7.03%和6.94%（P＜0.05）。

表2 不同粗蛋白質水平飼糧對育肥牦牛生產性能的影響

2.2 育肥牦牛瘤胃微生物菌群豐富度和多樣性分析 基于OTU 代表序列進行α 多樣性分析，計算細菌豐富度（Sobs、Chao 和Ace）指數、多樣性（Shannon 和Simpson）指數和覆蓋度（Coverage）指數。 由表3 可知，本次測序覆蓋率均達到98%以上，測序深度合理，測序范圍能涵蓋大部分區(qū)域。G 組和D 組牦牛微生物菌群在數量及結構上非常相似，D 組微生物豐富度和多樣性略高于G組，但兩組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 育肥牦牛瘤胃微生物菌群組成差異分析

2.3.1 門水平 在門水平上，兩組共有19 個菌門（圖1A）。 兩組瘤胃微生物相對豐度＞1%的優(yōu)勢菌門有擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、 變形菌門 （Proteobacteria）、 螺旋體門（Spirochaetota）（圖1B）。 擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度之和在各組中占比均高達92%以上，處于絕對優(yōu)勢地位。 在G 組樣本中，相對豐度較高的菌門有擬桿菌門和螺旋體門， 分別為62.08%和1.62%，較D 組分別高出3.20%和0.54%；厚壁菌門和變形菌門在D 組中相對豐度較高，分別高于G 組2.21%和1.81%。 D 組和G 組在門水平上差異不顯著（P＞0.05）（圖1C）。

圖1 不同蛋白組的牦牛瘤胃微生物組成（門水平）

2.3.2 屬水平 在屬水平上， 共鑒定出261 個菌屬，兩組共有237 個菌屬，G 組特有13 個菌屬，D組特有11 個菌屬（圖2A）。 在12 個樣本中，微生物相對豐度＞1%的優(yōu)勢菌屬有16 個， 其中，Prevotella （19.18% ）、norank_f__F082 （16.56% ） 和Rikenellaceae_RC9_gut_group（13.41%）的相對豐度高于10%， 其余13 個菌屬相對豐度低于5%（圖2B）。 運用Wilcox 秩和檢驗比較兩組在屬水平上的菌落組成差異。 在優(yōu)勢菌屬中，Rikenellaceae_RC9_gut_group 的相對豐度在D 組中顯著高于G 組（P＜0.05），UCG-002 的相對豐度在D組中極顯著高于G 組（P＜0.01），其他菌屬在兩組之間無顯著差異（圖2C）。

圖2 不同蛋白組的牦牛瘤胃微生物組成（屬水平）

3 討論

3.1 飼糧不同粗蛋白質水平對育肥牦牛生產性能的影響 蛋白質是配制日糧配方時的一項重要指標，不僅影響動物的生產性能，對機體健康、養(yǎng)殖效益以及生態(tài)環(huán)境都具有重要的作用。 飼喂過高的蛋白不僅會造成資源浪費，增加飼料成本，同時還會導致動物機體氮排泄增加，造成環(huán)境污染，此外， 還可能導致動物繁殖力下降 （韓旭峰，2015）。 而過低的蛋白質供應則無法滿足動物營養(yǎng)需要，可能會造成增重減慢、飼料轉化效率降低以及胴體質量下降等。因此，配制適宜蛋白水平的飼糧可最大限度地提高飼料利用效率， 促進牦牛的生長，改善胴體品質。 李秋鳳等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)肉牛適宜的蛋白水平為12.5% ～16.0%。張春霞（2022）使用不同蛋白水平日糧飼喂西門塔爾牛，結果顯示，隨著蛋白水平的提高，平均日增重呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢， 中蛋白組與低蛋白組差異顯著（P＜0.05），與高蛋白組差異不顯著。代正陽 （2018） 研究發(fā)現(xiàn)， 飼喂中蛋白水平（14.95%） 日糧的金華黃牛試驗組平均日增重高于飼喂高蛋白（16.6%）和低蛋白（13.45%）水平的兩個試驗組，但差異不顯著。李紅麗等（2022）利用3 個不同蛋白質水平 ［12%（低）、14%（中）、16%（高）］ 的全混合日糧分別飼喂3 組牦牛， 結果顯示，中蛋白組的終末體重、總增重和平均日增重顯著高于低蛋白質組（P＜0.05），同時也高于高蛋白組，但無顯著差異。本試驗結果與上述研究結果相似，13.53%蛋白組的總增重和平均日增重高于16.20%蛋白組，且差異達到顯著水平。 當飼糧能量水平基本一致的情況下， 牦牛的育肥營養(yǎng)水平主要取決于蛋白水平。 科學合理的能氮比可促進瘤胃重要微生物菌群的生長繁殖， 有利于瘤胃微生物蛋白的合成， 提高瘤胃對營養(yǎng)物質的消化與吸收。 本研究中，過高的蛋白水平（16.20%）可能造成了飼糧能氮水平失衡， 進而影響了牦牛的生長性能（付敏等，2022；陳偉健，2008）。

屠宰性能是判斷動物生產性能高低的重要指標，直接影響最終的經濟效益。 王巍等（2020）認為，在相同能量水平下，蛋白水平的提高對屠宰性能無顯著作用。張春霞（2022）研究表明，中蛋白組西門塔爾牛胴體重和屠宰率高于高蛋白組， 但差異不顯著。本試驗結果與上述研究結果相似，胴體重和屠宰率會隨著日糧蛋白水平的提高而降低，但兩處理組之間差異不顯著， 說明蛋白水平對屠宰性能影響較小。根據本研究可得出，在不影響牦牛生長的情況下，適當地降低飼糧粗蛋白質含量，可有效降低飼養(yǎng)成本，提高生產效益。

3.2 飼糧不同粗蛋白質水平對育肥牦牛瘤胃微生物菌群豐富度與多樣性的影響 α 多樣性指數是衡量微生物菌群豐富度和多樣性的綜合指標。α 多樣性越高，菌群組成越復雜、穩(wěn)定，增強了對外界干擾的抵抗力和適應性， 有利于宿主健康（Jiang 等，2021）。 以往的研究認為不同蛋白水平對瘤胃微生物豐富度有顯著影響， 但對多樣性影響不大， 菌群豐度與蛋白水平呈負相關。 郭凱等（2019）研究表明，飼喂低蛋白日糧（19%）的90 日齡犢牛瘤胃微生物群落的Chao 指數顯著高于高蛋白組（22%）（P＜0.05），兩處理組間的Shannon指數沒有顯著差異。 Zhang 等（2021）以2 歲母牦牛為研究對象，飼喂4 種不同蛋白水平（9.64%、11.25%、12.48%、13.87%）飼糧，結果發(fā)現(xiàn)蛋白水平最高組（13.87%）的瘤胃微生物群的Ace 指數顯著降低（P＜0.05），其他組之間差異不顯著，不同組Shannon 指數之間差異不顯著。 本研究結果發(fā)現(xiàn)牦牛瘤胃微生物菌群α 多樣性指數在不同蛋白組之間均差異不顯著， 但菌群多樣性和豐度會隨著飼糧蛋白水平的增高而降低， 與上述結果相似。說明在相同的食物成分下，改變粗蛋白質濃度并不足以引起瘤胃微生物群的強烈波動， 低蛋白組更有利于微生物繁殖。

3.3 不同粗蛋白質水平對牦牛瘤胃微生物菌群組成的影響 無論是品種、 飼養(yǎng)方式還是營養(yǎng)水平改變， 厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度都占據著反芻動物瘤胃微生物的主導地位， 其次還有少量的變形菌門、螺旋體菌門和軟壁菌門等（李蔣偉等，2022；姜君等，2021；譚子璇等，2020；馬力等，2019；Singh 等，2015）。 本研究結果與上述結論一致，在門水平下，兩組相對豐度高于1%的菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和螺旋體門，在不同蛋白處理組之間差異不顯著。 厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度在牦牛瘤胃中占據絕對優(yōu)勢地位，占比達到92%以上，對牦牛健康起著非常關鍵的作用。厚壁菌門促進食物中的纖維降解，將纖維素轉化為揮發(fā)性脂肪酸， 促進食物消化和生長發(fā)育； 擬桿菌門主要促進食物中蛋白質和碳水化合物的消化吸收， 從而促進胃腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育（Jiang 等，2021）。在本研究中，高蛋白組的擬桿菌門相對豐度高于低蛋白組， 以促進蛋白的消化利用。 變形菌門的相對豐度比擬桿菌門和厚壁菌門要低得多，但在瘤胃代謝中仍起著重要作用。變形菌門是細菌中最大的細菌門， 參與多種功能代謝，例如氮代謝等，此外，變形菌門還包括很多病原菌， 其數量的增加是生物失調和疾病風險的潛在診斷特征（Shin 等，2015）。 螺旋體門也同樣發(fā)揮著重要的作用，能有效降解纖維素、果膠和磷酸鹽，發(fā)酵形成揮發(fā)性脂肪酸，為反芻動物機體提供能量。以上研究說明，反芻動物都共享著一個核心瘤胃微生物菌群， 不會因飼糧中的一種營養(yǎng)成分的改變而引起厚壁菌門和擬桿菌門的優(yōu)勢地位發(fā)生改變。

許多微生物對飼料底物濃度比較敏感， 長時間飼喂不同營養(yǎng)水平的日糧，會使瘤胃菌群的數量和結構發(fā)生改變。 Henderson 等（2015）對水牛、野牛、綿羊、山羊、鹿、羊駝、大羊駝等32 個動物品種的瘤胃微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)飼糧改變會引起瘤胃中微生物菌屬的改變。本研究利用高通量測序技術分析發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，優(yōu)勢菌屬共有16 個，其中7 個屬于擬桿菌門，8 個屬于厚壁菌門，1 個屬于變形菌門。 相對豐度大于10%的菌屬有Prevotella、norank_f__F082 和Rikenellaceae_RC9_gut_group。Prevotella 屬于擬桿菌門，在瘤胃中一直處于優(yōu)勢地位，是瘤胃中主要蛋白降解菌屬之一，參與淀粉和蛋白質的分解， 蛋白濃度的增加會引發(fā)普雷沃氏菌屬數量增多（張潔等，2020）。 因此，本研究中高蛋白組的Prevotella 的相對豐度大幅度上升，成為瘤胃中占比最高的菌屬。 Rikenellaceae_RC9_gut_group 屬于擬桿菌門，可促進脂質代謝，參與短鏈脂肪酸，特別是丙酸的產生（Conte 等，2022）。Rikenellaceae_RC9_gut_group 還與宿主動物生長性能呈正相關， 其豐度在生長性能最好的動物中更高（Daghio 等，2021）。 本研究中，Rikenellaceae_RC9_gut_group 在低蛋白組的相對豐度顯著高于高蛋白組（P＜0.05），同時低蛋白組的平均日增重顯著高于高蛋白組 （P＜0.05）， 說明Rikenellaceae_RC9_gut_group 的數量會受到飼糧蛋白濃度的影響，同時其與生產性能可能成正相關，其是否影響反芻動物的生產性能還需進一步驗證。UCG-002 屬于厚壁菌門，在低蛋白組中相對豐度極顯著升高（P＜0.01）。 UCG-002 的相關報道較少，功能可能與脂質代謝相關。 綜上所述，飼糧蛋白水平的改變會對牦牛的瘤胃微生物組成產生一定影響。

4 結論

綜上所述， 與16.20%蛋白水平飼糧相比，13.53%蛋白水平的飼糧更有利于育肥牦牛的生長，總增重和日增重顯著增加。不同蛋白水平飼糧對瘤胃微生物α 多樣性無顯著影響，但對微生物優(yōu)勢菌屬組成產生一定影響，13.53%蛋白水平飼糧更有利于瘤胃微生物的繁殖。 本研究為提高牦牛育肥生產效率、 優(yōu)化瘤胃微生物區(qū)系提供重要參考。