檀茜倩,裴建博,崔方超,李秋瑩,呂欣然,孫 彤,勵(lì)建榮,*
(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 錦州 121013;2.渤海大學(xué)海洋研究院,遼寧 錦州 121013;3.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457)
水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)豐富,含有蛋白質(zhì)、必需氨基酸、生物活性肽、多不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但消費(fèi)者食用水產(chǎn)品也會(huì)面臨一些潛在風(fēng)險(xiǎn),主要包括物理因素(夾雜異物)、化學(xué)因素(重金屬、魚(yú)藥殘留、生物毒素)以及生物因素(細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng))[1-2]等。其中生物因素對(duì)消費(fèi)者健康和漁業(yè)經(jīng)濟(jì)影響更大。致病菌(副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌等)以及腐敗菌(假單胞菌、希瓦氏菌等)的存在可能引發(fā)食源性疾病或水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[3],影響消費(fèi)者身體健康,同時(shí)也會(huì)造成一定浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。因此如何保證水產(chǎn)品新鮮度以及微生物安全性是目前非常值得關(guān)注的問(wèn)題[4-5]。
研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌的某些生物行為受到信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)控[6],群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)就是其中之一。細(xì)菌的QS系統(tǒng)是指細(xì)菌通過(guò)感知信號(hào)分子(也叫做自誘導(dǎo)物(autoinducers,AIs))的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)菌群內(nèi)部和菌間的交流以及調(diào)控多種毒力行為的產(chǎn)生[7-8]。而以細(xì)菌QS系統(tǒng)為靶點(diǎn)的群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors,QSIs)可以起到阻斷或干擾QS系統(tǒng)的作用,且QSIs對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響較小,與抗生素等物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的抑制機(jī)制不同,因此使用QSIs抑制細(xì)菌QS系統(tǒng)毒力因子的產(chǎn)生,不僅能夠保證水產(chǎn)品食用的新鮮度和微生物安全性[9],也可以在一定程度上抑制細(xì)菌耐藥性形成[9]。為了更全面了解QSIs對(duì)水產(chǎn)品中細(xì)菌的控制作用,本文概述水產(chǎn)品中常見(jiàn)的幾種致病和腐敗菌QS系統(tǒng)的類(lèi)型及其對(duì)毒力因子的調(diào)控方式,著重介紹目前天然來(lái)源(微生物源、植物源、動(dòng)物源)以及人工合成QSIs的研究進(jìn)展,為水產(chǎn)品保鮮和安全控制技術(shù)開(kāi)發(fā)提供參考。
在細(xì)菌QS系統(tǒng)中,AIs對(duì)細(xì)菌的基因表達(dá)和毒力因子產(chǎn)生的調(diào)控起到了非常重要的作用[10]。常見(jiàn)的AIs主要分為三大類(lèi)(表1):第一類(lèi)為高絲氨酸內(nèi)酯(homoserine lactone,HSL)類(lèi)(AI-1),主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)中[11],其結(jié)構(gòu)因合成酶不同而有所差異,以N-?;?高絲氨酸內(nèi)酯類(lèi)(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)最常見(jiàn),其由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)通過(guò)LuxI合成酶產(chǎn)生,4~16 個(gè)C組成的脂肪酰鏈通過(guò)酰胺鍵連接到內(nèi)酯化的高絲氨酸上,通過(guò)與LuxR受體結(jié)合開(kāi)啟全局調(diào)控[12];第二類(lèi)為自誘導(dǎo)肽(autoinducing peptides,AIPs),主要存在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(G+)中,一般包含5~17 個(gè)氨基酸,AIPs由G+菌核糖體合成并完成對(duì)自身穩(wěn)定和功能的修飾后,通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)江h(huán)境中,當(dāng)環(huán)境中AIPs濃度超過(guò)一定閾值時(shí)會(huì)引起細(xì)菌基因表達(dá)改變并引發(fā)相應(yīng)生物行為[13];第三類(lèi)是AI-2,在G-和G+菌中均有存在,被認(rèn)為是細(xì)菌種間交流的一種通用信號(hào),S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl-homocystein,SAH)在S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶和LuxS酶的作用下轉(zhuǎn)化成高半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD),再經(jīng)DPD自發(fā)環(huán)化形成呋喃酮類(lèi)化合物[14]。
表1 常見(jiàn)AIs類(lèi)型Table 1 Types of common autoinducers (AIs)
水產(chǎn)品中常見(jiàn)致病菌有金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、弧菌等。在G+菌中,S.aureus主要存在于冷凍水產(chǎn)品,其QS系統(tǒng)調(diào)控生物被膜和毒力因子的過(guò)程需要輔助基因調(diào)節(jié)(accessory gene regulator,Agr)系統(tǒng)參與,其中Agr系統(tǒng)中的agrB和agrD基因編碼跨膜蛋白和AgrD前肽,AgrB蛋白參與AgrD轉(zhuǎn)化為AIP并釋放的過(guò)程,agrC和agrA基因則用來(lái)編碼感應(yīng)激酶和對(duì)AgrC/AgrA兩組分系統(tǒng)做出應(yīng)答調(diào)控[15]。另一種常見(jiàn)的G+食源性細(xì)菌L.monocytogenes的QS系統(tǒng)與S.aureus類(lèi)似,雖然L.monocytogenes基因組中已被證實(shí)包含與AI-2有關(guān)的pfs和luxS基因,但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)AI-2并不是L.monocytogenes的AIs,L.monocytogenes的基因組中不含與誘導(dǎo)、跨膜蛋白和雙組分系統(tǒng)相關(guān)的comX、comQ和comP/comA基因,agrD基因比agrA基因?qū).monocytogenes致病和生物被膜形成等毒力行為的影響更大[16]。
在G-菌中,P.aeruginosa已經(jīng)被證實(shí)包含4 種QS系統(tǒng):LasI/LasR系統(tǒng)、RhlI/RhlR系統(tǒng)、PqsR參與的喹諾酮(Pseudomonasquinolone signal,PQS)系統(tǒng)以及在低磷酸鹽條件下起作用的2-(2-羥基苯基)-噻唑-4-甲醛(2-(2-hydroxyphenyl)-thiazole-4-carbaldehyde,IQS)系統(tǒng)[17],這4 個(gè)系統(tǒng)通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌毒力行為的調(diào)控。其中LasR位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游,可與特定AHLs結(jié)合,激活下游包括lasI、rhlI/R、pqsR和pqsABCDE在內(nèi)的大量基因表達(dá)[18]。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是另一種水產(chǎn)中比較常見(jiàn)G-弧菌,常污染牡蠣等貝類(lèi),未經(jīng)煮熟食用可引起胃腸炎和敗血癥等疾病,其為AI-2型QS系統(tǒng),低AIs濃度可促進(jìn)V.parahaemolyticus中aphA基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)其III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system,T3SS)分泌毒素,高AIs濃度時(shí)AI-2可與受體蛋白OpaR結(jié)合抑制T3SS1中轉(zhuǎn)錄激活蛋白ExsA的活性,降低V.parahaemolyticus生物被膜的形成、運(yùn)動(dòng)能力和毒素的分泌[19-20];哈維弧菌(Vibrio harveyi)同屬AI-2型QS系統(tǒng)[21]。
水產(chǎn)中的腐敗菌以G-菌居多,包括熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)在內(nèi)的多種假單胞菌、希瓦氏菌(Shewanella)和蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)等。其中P.fluorescens主要為AHLs型QS系統(tǒng),已發(fā)現(xiàn)LuxI/LuxR以及Pcol/PcoR兩種類(lèi)型[22]。Shewanella是魚(yú)和蝦等水產(chǎn)品冷藏過(guò)程中的特定腐敗菌[23],其QS系統(tǒng)主要包含AI-1和AI-2兩種信號(hào)分子,其產(chǎn)生的二酮哌嗪類(lèi)(diketopiperazines,DKPs)化合物可與LuxR結(jié)合通過(guò)上調(diào)torT和trxB基因表達(dá)增強(qiáng)致腐能力[24-25]。H.alvei則經(jīng)常引起真空包裝水產(chǎn)品的腐敗,并對(duì)低溫有較強(qiáng)適應(yīng)性,目前研究認(rèn)為H.alvei為AHLs型QS系統(tǒng),已發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子類(lèi)型有N-己酰-高絲氨酸內(nèi)酯(N-hexanoyl-homoserine lactone,C6-HSL)、N-氧代辛酰-高絲氨酸內(nèi)酯(N-octanoyl-homoserine lactone,OC8-HSL)[26]、N-丁酰-高絲氨酸內(nèi)酯(N-butyryl-homoserine lactone,C4-HSL)[27]等。
QSIs可以通過(guò)阻斷或干預(yù)QS系統(tǒng)抑制細(xì)菌毒力因子產(chǎn)生(圖1)。QSIs的作用機(jī)制主要包括以下幾種方式:抑制信號(hào)分子合成;酶解或清除信號(hào)分子;與信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體位點(diǎn);通過(guò)干擾信號(hào)分子和基因啟動(dòng)子結(jié)合影響基因表達(dá)等[28-31]。QSIs篩選需滿(mǎn)足以下幾個(gè)原則:第一,候選QSIs可有效降低QS相關(guān)基因表達(dá);第二,候選QSIs與相應(yīng)QS調(diào)控因子具有專(zhuān)一對(duì)應(yīng)性并在使用后不具有副作用;第三,候選QSIs有很好的化學(xué)穩(wěn)定性,不會(huì)被宿主細(xì)胞代謝活動(dòng)降解[32]。QSIs根據(jù)其來(lái)源可分為天然來(lái)源抑制劑和人工合成抑制劑。天然來(lái)源抑制劑主要來(lái)自微生物代謝物、植物提取物和動(dòng)物等。人工合成抑制劑從偶然發(fā)現(xiàn)到高通量篩選主要是根據(jù)QSIs的特點(diǎn),基于經(jīng)驗(yàn)、半經(jīng)驗(yàn)方法有目的地對(duì)前體化合物進(jìn)行改造和合成。目前QSIs篩選常用的報(bào)告菌株有根癌農(nóng)桿菌A136、紫色桿菌CV026或12472、P.aeruginosaqsc 119等(對(duì)AHLs信號(hào)分子產(chǎn)生響應(yīng))[33-34],V.harveyiBB120或JMH612(對(duì)AI2或AHL類(lèi)信號(hào)分子產(chǎn)生響應(yīng))[35],含有綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌等[36]。
圖1 QSIs對(duì)細(xì)菌QS系統(tǒng)作用示意圖Fig.1 Schematic diagram of action of QSIs against bacterial QS system
天然來(lái)源的QSIs主要包括三大類(lèi):微生物源、植物源和動(dòng)物源。
細(xì)菌素是一類(lèi)對(duì)細(xì)菌有抑制作用的多肽,其抑菌譜和抑菌機(jī)理一直被廣泛研究[37],目前研究發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌素可作為某些水產(chǎn)品致病和腐敗菌的QSIs,通過(guò)影響QS信號(hào)分子活性或作為信號(hào)分子類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)性與QS受體結(jié)合達(dá)到抑制細(xì)菌QS通路的目的。例如乳桿菌素AL705(由彎曲乳桿菌產(chǎn)生)可抑制AI-2信號(hào)分子的活性,并影響L.monocytogenes生物被膜的形成[38];豆素(分子質(zhì)量為484 Da,由芽孢桿菌BR4產(chǎn)生)可作為PQS信號(hào)分子類(lèi)似物,因其與PqsR上的4 個(gè)氨基酸殘基結(jié)合能力較強(qiáng),所以可競(jìng)爭(zhēng)性地與PqsR結(jié)合,因此可抑制P.aeruginosaQS系統(tǒng)調(diào)控的生物被膜的形成以及胞外蛋白產(chǎn)生[39]。
另一類(lèi)微生物源群體感應(yīng)抑制劑為具有群體感應(yīng)淬滅(quorum quenching,QQ)作用的酶類(lèi)。QQ酶最早在芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn),包括內(nèi)酯酶、?;D(zhuǎn)移酶、氧化還原酶和對(duì)氧磷酯酶等[40]。芽孢桿菌中比較有代表性的QQ酶為內(nèi)酯酶,例如在地衣芽孢桿菌T-1中發(fā)現(xiàn)的由ytnp編碼的AHLs內(nèi)酯酶[41],這種酶可裂解AHLs分子的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán),抑制其與靶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑結(jié)合,通過(guò)減弱AHLs有效性來(lái)干擾QS系統(tǒng)[42];另外,芽孢桿菌屬也能夠產(chǎn)生AHLs酰化酶或氧化還原酶,可部分或完全降解AHLs信號(hào)分子[43]。乳酸菌中也發(fā)現(xiàn)多種QQ酶,本團(tuán)隊(duì)在乳桿菌ZHG2-1[44]和植物乳桿菌CY1-1[45]中發(fā)現(xiàn)可能存在AHLs內(nèi)酯酶或者?;?,前者通過(guò)抑制LasI/R和RhlI/R蛋白合成基因的表達(dá)抑制QS系統(tǒng),后者通過(guò)降解AHLs信號(hào)分子抑制QS過(guò)程。分泌QQ酶的微生物、QQ酶種類(lèi)及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步挖掘和研究。
除了細(xì)菌素和QQ酶,從微生物中也分離到了可作為QSIs的其他代謝物。枯草芽孢桿菌R-18(從植物根系中分離)的代謝產(chǎn)物2,4-二叔丁基苯酚是AHLs信號(hào)分子類(lèi)似物,可通過(guò)阻止AHLs與其受體結(jié)合來(lái)抑制QS通路[46]。鏈霉菌(從魷魚(yú)中分離)提取物也可抑制紫色桿菌MTCC2656紫色素產(chǎn)生[47]。微生物代謝物的組成受到微生物培養(yǎng)條件(碳源、氮源和礦物質(zhì))的影響,因此也是在對(duì)微生物源QSIs獲取和研究中需要考慮的因素。另外,現(xiàn)有研究雖證實(shí)某些微生物代謝物可作為潛在QSIs,但是其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
植物來(lái)源的QSIs主要包括植物提取物、精油以及從其中分離的各種單體。植物提取物和精油一直以來(lái)被認(rèn)為具有抑菌功能。植物來(lái)源QSIs的抑制機(jī)制主要包括兩種:一是干擾信號(hào)分子與受體結(jié)合,因?yàn)椴糠种参锾崛∥锏幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與某些AIs類(lèi)似,可與AIs競(jìng)爭(zhēng)性與受體結(jié)合影響QS過(guò)程;第二種是通過(guò)影響AIs的合成來(lái)起到干擾QS的作用。和其他來(lái)源的QSIs相比,植物來(lái)源QSIs應(yīng)用相對(duì)廣泛,可對(duì)多種QS系統(tǒng)起到抑制作用[48]。
小蘗堿(黃連素)是一種異喹啉生物堿,為廣譜抗菌藥物,其對(duì)病毒、真菌、和各類(lèi)細(xì)菌(尤其是一些耐藥菌株)都有抑制作用,它還可抑制多種細(xì)菌的QS系統(tǒng),顯示出相對(duì)廣譜的QS抑制能力。小蘗堿在質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)可抑制紫色桿菌12472以及CV026產(chǎn)生紫色素以及P.aeruginosa生物被膜的形成,通過(guò)分子對(duì)接和同源建模發(fā)現(xiàn)其對(duì)P.aeruginosaQS系統(tǒng)的干擾是由于可與信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)性地同受體LasR和RhlR結(jié)合[30]。另有研究表明,在1/2最小抑菌質(zhì)量濃度(0.64 mg/mL)下,小蘗堿可以抑制耐藥性大腸桿菌生物被膜的形成,通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)在該濃度下小蘗堿對(duì)生物被膜的抑制作用明顯,細(xì)胞形狀發(fā)生改變,產(chǎn)生溶脹和伸長(zhǎng)現(xiàn)象,說(shuō)明其對(duì)生物被膜產(chǎn)生比較大的破壞;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在1/2最小抑菌質(zhì)量濃度(0.64 mg/m L)和1/4 最小抑菌質(zhì)量濃度(0.3 2 m g/m L)下,小蘗堿可顯著下調(diào)大腸桿菌AI-2 QS系統(tǒng)相關(guān)基因(luxS、pfS基因、與luxR基因功能相似的sdiA基因、參與細(xì)胞分化的hflX基因、鞭毛驅(qū)動(dòng)合成基因fliA基因以及此基因控制的操縱子motA基因)的表達(dá)[49];研究還發(fā)現(xiàn)苦參堿也具有與小蘗堿類(lèi)似的QS抑制效果,但是在對(duì)QS抑制濃度和相關(guān)基因的干擾上存在一些差別,說(shuō)明不同中藥單體對(duì)同種細(xì)菌的QS抑制能力不同;小蘗堿也可抑制表皮葡萄球菌生物被膜的形成,推測(cè)其與干擾表皮葡萄球菌QS系統(tǒng)有關(guān),但是具體的機(jī)制還未得到證實(shí)[50-51]。
姜黃素是從姜黃中提取的一種生物活性物質(zhì),其核心結(jié)構(gòu)帶有2 個(gè)芳香環(huán)和7 個(gè)C碳鏈二芳基庚烷,可抑制在C6-HSL信號(hào)分子存在下的紫色桿菌CV026和在C8-HSL存在下的根癌農(nóng)桿菌色素的產(chǎn)生[52],也可以抑制V.harveyi在QS系統(tǒng)調(diào)控作用下的生物發(fā)光行為,對(duì)弧菌屬生物被膜形成的抑制作用明顯,在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)對(duì)V.harveyi、V.parahaemolyticus、創(chuàng)傷弧菌生物被膜形成的抑制率分別為69%、56%和79%;姜黃素處理上述弧菌成熟生物被膜,會(huì)使生物被膜的厚度變薄并呈現(xiàn)出不完整狀態(tài);并且分泌胞外多糖、阮藻酸鹽以及群集和泳動(dòng)等QS調(diào)控的毒力行為產(chǎn)生也明顯降低[53]。除了對(duì)弧菌屬Q(mào)S的抑制作用,姜黃素還可以通過(guò)與LuxI型的AHLs合成酶結(jié)合干擾溫和氣單胞菌QS系統(tǒng)[52],通過(guò)影響AHLs合成酶ahlI基因以及AHL結(jié)合受體合成酶ahyR基因的表達(dá)干擾嗜水氣單胞菌的QS系統(tǒng)等[54]。
研究發(fā)現(xiàn),與其他化學(xué)和物理方法協(xié)同作用可增強(qiáng)植物源QSIs的QS抑制能力,例如在光催化條件下,姜黃素可使得P.aeruginosa的lasI/R和rhlI/R基因發(fā)生明顯下調(diào)[55],對(duì)其生物被膜的抑制效果相比姜黃素單獨(dú)作用顯著增強(qiáng),因此也可作為植物源QSIs應(yīng)用發(fā)展的一個(gè)方向。
動(dòng)物細(xì)胞和組織中也有部分QSIs存在。當(dāng)真核宿主被一些具有QS系統(tǒng)的病原菌侵染后,會(huì)對(duì)不同AIs產(chǎn)生響應(yīng),產(chǎn)生可分解AIs的代謝物。Maurice等[56]發(fā)現(xiàn)P.aeruginosa感染肺上皮細(xì)胞的線(xiàn)粒體后,其會(huì)分泌去乙?;?(sirtuin 1,SIRT1)和磷酸腺苷依賴(lài)性激酶(AMP-dependent kinase,AMPK)來(lái)減弱P.aeruginosa信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL對(duì)線(xiàn)粒體的影響,因此這兩種酶具有潛在QSIs功能。另有研究表明,碎牛肉提取物可抑制AI-2信號(hào)分子的活性,抑制大腸桿菌O157:H7的生長(zhǎng)以及其yadK和hhA基因的表達(dá)[57]。驢初乳中分離的多聚己糖可顯著抑制紫色桿菌12472紫色素產(chǎn)生,也可以抑制S.aureus溶血素、蛋白酶和脂肪酶等毒力因子的產(chǎn)生和生物被膜的形成,并且同時(shí)具有降解C4-HSL和C12-HSL兩種信號(hào)分子的功能[58]。一種南非的蜂膠也可作為潛在QSIs,其中所含的黃酮類(lèi)物質(zhì)喬松素、高良姜素和白楊素,比香草醛對(duì)紫色桿菌12472產(chǎn)紫色素的抑制率高,且3 種物質(zhì)綜合的效果大于單一作用效果,可同時(shí)抑制G+L.monocytogenes、G-大腸桿菌和真菌中的白色念珠球菌的生物被膜形成,表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性和抗QS特性,豐年蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)其無(wú)毒,在水產(chǎn)品工業(yè)上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[57];另外一種從蜜蜂毒液中分離的蜂毒肽也具有抑制S.aureus、大腸桿菌和P.aeruginosa的生物被膜形成的功能,但是其活性成分以及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步評(píng)估[59]。
有代表性的不同天然來(lái)源QSIs及其對(duì)QS系統(tǒng)的主要影響見(jiàn)表2。
表2 常見(jiàn)天然來(lái)源QSIsTable 2 Common natural QSIs
因?yàn)樘烊籕Q酶具有分離困難、產(chǎn)量低等不利因素,使其工業(yè)應(yīng)用受到限制,目前研究可考慮通過(guò)生物工程的方法根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的QQ酶基因合成QQ酶(圖2)。本團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)P.fluorescens的基因序列分析,利用pET28a載體在大腸桿菌DE3中成功表達(dá)了具有AHLs淬滅活性的QQ酶PF2571和PF1240,PF2571能夠抑制維氏氣單胞菌BY-8中包括生物被膜、蛋白酶、脂肪酶、藻朊酸鹽等QS調(diào)控的毒力因子的形成,并有效控制鯛魚(yú)的腐敗[62];PF1240與AHLs?;D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)相似,能夠分解不同長(zhǎng)度碳鏈的多種AHLs,可抑制H.alvei菌生物被膜、蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生及其泳動(dòng)能力[63]。另有報(bào)道成功對(duì)從健康蝦中分離的Ruegeria mobilisYJ3菌株的胞外群體感應(yīng)淬滅酶RmmL序列在體外進(jìn)行了克隆表達(dá),其可以降解長(zhǎng)鏈的C12-HSL信號(hào)分子,能夠抑制P.aeruginosa產(chǎn)生綠膿菌素,同時(shí)RmmL被認(rèn)為可以作為水產(chǎn)的治療藥劑[64]。
圖2 異源表達(dá)QQ酶流程示意圖Fig.2 Schematic diagram of heterogenous expression of quorum quenching enzyme
除了采用生物工程的方法,在已有經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,QSIs可通過(guò)骨架躍遷的方法(即從已知活性的化合物出發(fā),通過(guò)改變其核心結(jié)構(gòu),得到新的具有相似活性的化合物)設(shè)計(jì)合成,其QS抑制效果可以利用分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)(圖3)。一種策略是根據(jù)不同類(lèi)型AIs結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)相關(guān)類(lèi)似物,這種類(lèi)似物可與AIs競(jìng)爭(zhēng)性與其對(duì)應(yīng)受體結(jié)合,進(jìn)而影響毒力基因表達(dá)。例如可以通過(guò)改變AHLs的內(nèi)酯環(huán)以及對(duì)其酰胺基和脂肪鏈進(jìn)行一定化學(xué)修飾合成新QSIs[31],其中內(nèi)酯環(huán)可用噻唑、二氫噻唑、苯并咪唑、吡啶和咪唑啉等雜環(huán)代替,一般來(lái)說(shuō)氨基酸基團(tuán)和側(cè)鏈可相對(duì)保持不變,而側(cè)鏈基團(tuán)的長(zhǎng)度可進(jìn)行一定調(diào)整。研究發(fā)現(xiàn)采用此種策略合成的大部分AHLs類(lèi)似物都具有抑制AHLs型QS系統(tǒng)的功能,分子對(duì)接模擬結(jié)果顯示這些類(lèi)似物與紫色桿菌CviR受體的結(jié)合能力大于天然AHLs信號(hào)分子。這種合成策略需要根據(jù)目標(biāo)AIs特點(diǎn)選擇合適的先導(dǎo)化合物作為核心結(jié)構(gòu),同時(shí)對(duì)其他基團(tuán)進(jìn)行有針對(duì)性地修飾[65]。另一種策略是利用已知結(jié)構(gòu)的QSIs來(lái)設(shè)計(jì)和合成具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的新型QSIs。有研究合成了與對(duì)P.aeruginosa毒力因子有抑制作用的5-硝基咪唑類(lèi)甲硝唑這種類(lèi)型的QSIs結(jié)構(gòu)類(lèi)似的一系列塞克硝唑化合物,并證實(shí)了這類(lèi)化合物可同時(shí)下調(diào)群體感應(yīng)信號(hào)分子合成酶基因lasI、rhlI、pqsA和信號(hào)分子受體lasR、rhlR和pqsR基因的表達(dá),從而抑制P.aeruginosa毒力因子產(chǎn)生[66]。
圖3 1,5-二氫吡咯-2-酮(A)[9]、5-乙?;?4-甲基-2-(3-吡啶)噻唑(B)[67]、吡哆醛乳腙(C)[68]與LasR蛋白模型分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.3 Schematic diagram of the molecular docking of 1,5-dihydropyrrol-2-ones (A)[9],5-acetyl-4-methyl-2-(3-pyridyl) thiazole (B)[67]and pyridoxal lactohydrazone (C)[68] with the LasR protein model
除了依據(jù)經(jīng)驗(yàn)對(duì)QSIs進(jìn)行設(shè)計(jì)合成,基于計(jì)算方法的大規(guī)模篩選也被應(yīng)用在QSIs的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)中。Grossman等[69]從諾丁漢化合物數(shù)據(jù)庫(kù)(包含85 000 種不同的化合物)篩選出結(jié)構(gòu)內(nèi)核與PQS和2-庚基-4-喹啉酮(2-heptylquinolin-4(1H)-one,HHQ)的內(nèi)部配體具有一定相似性的喹唑啉酮骨架化合物,可以作為PasR的拮抗物進(jìn)而干擾QS過(guò)程。在虛擬篩選過(guò)程中,首先需要選擇適合的數(shù)據(jù)庫(kù),目前常用的化合物公共數(shù)據(jù)庫(kù)有Pubchem(小分子信息)、Drugbank(常見(jiàn)藥物信息)、中藥資源的數(shù)據(jù)庫(kù)TCM(中藥信息)等,同時(shí)也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)建立有針對(duì)性的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)以應(yīng)用于QSIs的虛擬篩選。
納米顆粒是一類(lèi)尺寸1~100 nm、形狀多樣、具有特殊化學(xué)和物理特性的物質(zhì),已經(jīng)應(yīng)用在包括診療、催化、藥物遞送、傳感等諸多領(lǐng)域,同時(shí)其也可作為抗菌劑,對(duì)很多耐藥菌有很好的抑制作用?,F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)一部分納米顆??勺鳛镼SIs,對(duì)QS的抑制效果取決于納米顆粒的類(lèi)型、合成方法以及作用濃度大小等[70]。
銀納米顆粒(silver nanoparticles,AgNPs)是目前研究較多的一類(lèi)納米顆粒,對(duì)多種QS系統(tǒng)都有抑制作用。AgNPs對(duì)QS系統(tǒng)的抑制機(jī)制主要由于AgNPs具有破壞細(xì)胞膜(尤其是肽聚糖層)、破壞細(xì)菌的呼吸鏈(呼吸鏈酶ATPase)、干擾DNA的復(fù)制、產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)等作用,而這些作用會(huì)對(duì)細(xì)菌QS系統(tǒng)產(chǎn)生干擾。以AgNPs對(duì)P.aeruginosaPAO1的QS系統(tǒng)影響為例,首先AgNPs引發(fā)的DNA損傷和ROS產(chǎn)生會(huì)激活編碼σ因子的rpoS基因的上調(diào)表達(dá),而RpoS(σ因子)能激活細(xì)胞對(duì)DNA損傷和ROS的保護(hù)作用,并可同時(shí)激活RsmA表達(dá),在RpoS和RsmA的聯(lián)合作用下,rhl和las家族的基因表達(dá)受到抑制并隨后影響到下游QS相關(guān)基因表達(dá)[71]。
AgNPs的合成方法很多,采用植物提取物或微生物代謝物對(duì)AgNPs進(jìn)行綠色合成因?yàn)榉椒ê?jiǎn)單、安全以及對(duì)環(huán)境污染小近年來(lái)受到很多關(guān)注[72](圖4)。植物或微生物提取物在AgNPs的合成過(guò)程中既可以作為還原劑,也具有穩(wěn)定AgNPs的作用。有研究利用大花紫薇葉的水提取物合成的AgNPs可成功抑制P.aeruginosa生物被膜形成[73];采用印度藏茴香種子的水提取物合成的AgNPs在質(zhì)量濃度為1、2、3 μg/mL和4 μg/mL時(shí)能使紫色桿菌12472產(chǎn)紫色素能力分別下降34.2%、47.0%、65.6%和74.7%,在質(zhì)量濃度為1~15 μg/mL時(shí)可在不同程度抑制P.aeruginosa綠膿菌素、鼠李糖脂和彈性蛋白酶以及黏質(zhì)沙雷氏靈桿菌素的產(chǎn)生[74];采用真菌(煙草內(nèi)生菌)提取物合成的AgNPs可以顯著抑制兩種P.aeruginosa的泳動(dòng)能力、綠膿菌素和胞外多糖的產(chǎn)生以及生物被膜的形成[72]。
圖4 利用植物提取物合成AgNPs的流程圖Fig.4 Schematic diagram of plant extract-mediated silver nanoparticles synthesis
納米顆粒作為QSIs的效果受到顆粒大小的影響。研究發(fā)現(xiàn)雖然球形納米銀顆粒(粒徑<20 nm)和銀納米棒(直徑在100~200 nm之間,長(zhǎng)度為5~10 μm)都可下調(diào)編碼LasA蛋白酶、LasB彈性蛋白酶、鐵載體等QS相關(guān)毒力基因表達(dá),但是相對(duì)于納米棒,納米顆粒可以在較低的濃度下起到QS抑制作用,這可能是由于其比表面積大,更容易穿透細(xì)胞膜引起氧化和DNA損傷[71]。不同類(lèi)型的納米顆粒對(duì)QS的抑制機(jī)制也不盡相同。對(duì)于AHL型QS系統(tǒng)來(lái)說(shuō),ZnO納米顆粒、TiO2納米顆粒、AgNPs都具有抑制紫色桿菌QS的能力,但是TiO2納米顆粒與AgNPs主要影響信號(hào)分子的合成,而ZnO納米顆粒則通過(guò)破壞對(duì)信號(hào)分子的識(shí)別和響應(yīng)來(lái)干擾QS系統(tǒng)[75]。
在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中納米顆粒膠體具有不穩(wěn)定和容易聚集的缺點(diǎn),會(huì)對(duì)其QS抑制能力造成影響。為了解決這個(gè)問(wèn)題,常將納米顆粒負(fù)載到一個(gè)可起到支撐作用的基質(zhì)上,基質(zhì)一般選擇帶有羥基、羰基、羧基和環(huán)氧基等官能團(tuán)的物質(zhì)(殼聚糖就是一種經(jīng)常采用的納米顆粒負(fù)載基質(zhì)),所形成的納米復(fù)合材料和復(fù)合納米顆粒可增強(qiáng)QSIs對(duì)QS的抑制功能[76]。納米顆粒本身也可以作為載體負(fù)載某些水溶性和生物利用度不好的生物活性物質(zhì)來(lái)提高其QS抑制能力,以增強(qiáng)其在水產(chǎn)品保鮮和包裝中的應(yīng)用潛力。Ilk等[77]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖-山柰酚復(fù)合納米顆粒可以顯著提高山柰酚QS抑制作用并且其抑制作用可在較長(zhǎng)的一段時(shí)間(30 d)得到保持;Subhaswaraj等[78]合成了殼聚糖-肉桂醛納米顆粒,并發(fā)現(xiàn)其在1 mg/mL質(zhì)量濃度下可通過(guò)干擾P.aeruginosa的LasI/R和RhlI/R系統(tǒng)來(lái)抑制生物被膜的形成以及群集和泳動(dòng)能力;Ibrahim等[79]合成了膳食殼聚糖槲皮素納米顆粒,其可以顯著下調(diào)氣單胞菌QS相關(guān)ahyI和ahyR基因的表達(dá),以達(dá)到抑制羅非魚(yú)體內(nèi)的氣單胞菌QS系統(tǒng)的目的,并且這種納米顆??勺鳛檠a(bǔ)充劑添加到羅非魚(yú)飼料當(dāng)中,擴(kuò)大了QSIs的應(yīng)用范圍。
QSIs在針對(duì)水產(chǎn)品常見(jiàn)致病和腐敗菌的控制方面具有一定優(yōu)勢(shì),但仍有很多可作為QSIs不同來(lái)源的天然抑菌劑有待開(kāi)發(fā)。另外,雖然一些抗菌物質(zhì)(包括一些植物和微生物的提取物)被證實(shí)具有QS抑制作用,可以作為潛在QSIs,但其對(duì)QS抑制的主要功能成分以及結(jié)構(gòu)還有待挖掘,QS抑制機(jī)制也需要深入研究。組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究QSIs的抑制機(jī)制提供了輔助支持,未來(lái)研究可結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù),多維度解析QSIs的抑制機(jī)制。此外,除了現(xiàn)有QSIs篩選報(bào)告系統(tǒng),可以考慮開(kāi)發(fā)靈敏度和準(zhǔn)確性更高的QS報(bào)告和檢測(cè)系統(tǒng),同時(shí)輔助基于計(jì)算的篩選技術(shù),提高QSIs篩選效率。由于QS系統(tǒng)的復(fù)雜性,QSIs的抑制作用有一定的特異性(針對(duì)特定菌屬或者某一類(lèi)QS系統(tǒng)),未來(lái)可以考慮基于天然產(chǎn)物篩選或通過(guò)人工設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)具有更廣泛抑制功能的QSIs,同時(shí)QSIs安全性也需要采用合理的方法進(jìn)行評(píng)估,以實(shí)現(xiàn)其在水產(chǎn)品鮮度和微生物安全控制方面的應(yīng)用。