付新成

廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 廊坊 065000

0 引言

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬的一種以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的格拉瑟氏病病原菌，屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的革蘭氏陰性菌，呈球桿狀、細(xì)絲狀等多種形態(tài)，是豬上呼吸道的共棲菌和條件致病菌［1］。在豬機(jī)體免疫力下降條件下，HPS 感染豬可混合或者繼發(fā)感染豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等免疫抑制性疾病病原體，引起呼吸困難、咳嗽、跛行、消瘦和部分神經(jīng)癥狀。副豬嗜血桿菌病發(fā)病率在10%～15%，病死率可超過(guò)50%，是世界范圍內(nèi)影響豬只健康的重要細(xì)菌性疾病之一［2］。

開展免疫接種和使用抗生素類藥物是防治副豬嗜血桿菌病的主要手段。HPS血清型較多，目前已經(jīng)定義了15個(gè)血清型，另外還有約20%的菌株不能通過(guò)血清進(jìn)行分型［3］。血清型的多樣性和大量菌株的不可分型，對(duì)開發(fā)交叉保護(hù)性疫苗產(chǎn)生了負(fù)面影響。此外，HPS有明顯的地方性特征，不同地區(qū)流行的HPS 菌株存在差異，甚至同一地區(qū)在不同時(shí)期流行的HPS 菌株也有所不同［4］。加之抗生素類藥物長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致HPS耐藥性增強(qiáng)，藥物治療效果不理想。上述原因?qū)е赂必i嗜血桿菌病的預(yù)防和臨床感染的控制存在較大困難。因此，調(diào)查HPS流行菌株血清型分型和耐藥性，對(duì)疫苗菌株篩選和降低抗生素耐藥性具有重要意義。為了解河北省廊坊市豬場(chǎng)HPS 的流行菌株和耐藥情況，筆者于2022年4—10月對(duì)采集自廊坊市豬場(chǎng)疑似感染HPS的病死豬肺臟、腦部等組織病料進(jìn)行分離純化培養(yǎng)、PCR分子血清型鑒定和耐藥性試驗(yàn)，旨在為當(dāng)?shù)匮兄茟?yīng)用HPS疫苗和臨床上合理使用抗生素提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 病料來(lái)源

采集河北省廊坊市18家規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)臨床疑似感染HPS的病死豬肺臟、心包液、氣管、腦組織等樣本274份，病死豬胸腔纖維素樣滲出、肺炎、心包炎病理特征明顯。

1.2 菌株、主要試劑與儀器

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（Tryptic Soy Agar，TSA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）及犢牛血清購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。金黃色葡萄球菌（ATCC25923）購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司。2×Easy Taq PCR Super-Mix（＋dye）購(gòu)自上海新睿生物科技有限公司。DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。細(xì)菌微量生化鑒定管及20 種抗生素藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考Oliveira 等［5］報(bào)道的方法，采用DNA Star6.0中的MegAlign 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)HPS 的16S rRNA 基因（Genbank 登錄號(hào)為M75065）特異性鑒定引物用于PCR鑒定HPS。根據(jù)Jia等［6］、Howell等［7］的研究，設(shè)計(jì)合成血清型1～15型特異性引物用于鑒定分離HPS菌株血清型。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物生物信息如表1所示。

表1 HPS分子血清分型引物序列及相關(guān)信息

1.4 病原菌分離純化培養(yǎng)

無(wú)菌挑取病料分區(qū)劃線接種于含5%犢牛血清和10 mg/L NAD 的TSA 平板培養(yǎng)基表面，在5% CO2、37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24～38 h，觀察菌落形態(tài)特征。挑取單個(gè)菌落制作抹片，進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察病原菌染色和形態(tài)，同時(shí)對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以獲得純化培養(yǎng)菌株。

1.5 “衛(wèi)星生長(zhǎng)”試驗(yàn)

無(wú)菌挑取1.4中獲得的純培養(yǎng)菌株，分別水平劃線接種于不含NAD 的TSA 平板培養(yǎng)基表面，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線在平板上接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察是否出現(xiàn)“衛(wèi)星生長(zhǎng)”（即靠近金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)部位的HPS 菌落較大，越遠(yuǎn)菌落越小，直至不能生長(zhǎng)）［8］和分離菌株溶血現(xiàn)象。

1.6 分離菌株的PCR分型鑒定

利用HPS 的16S rRNA 基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定分離菌株。取1.4中純化的分離菌株接種于含5%犢牛血清和10 mg/L NAD 的TSB 培養(yǎng)基表面，在37 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，以培養(yǎng)菌液為DNA模板。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（＋dye）15 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，補(bǔ)足ddH2O 至25 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃25 s，72 ℃50 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，利用Blast軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank收錄的參考株進(jìn)行同源性分析。

利用表1 中分型鑒定引物分別對(duì)經(jīng)PCR 鑒定為HPS 菌株進(jìn)行PCR 分子分型鑒定，反應(yīng)體系與上述體系相同。PCR 反應(yīng)程序：93 ℃3 min；93 ℃35 s，54 ℃30 s，72 ℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由于PCR 分子分型不能鑒定區(qū)分5 和12 型，因此檢測(cè)結(jié)果為5 型或者12 型的分離菌株需要參考文獻(xiàn)［3］中的免疫瓊脂擴(kuò)散法（Kielstein-Rapp-Gabrielson，KRG）做進(jìn)一步分型。

1.7 藥敏試驗(yàn)

對(duì)鑒定為HPS 的菌株按照Kirby-Bauer（K-B）紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用生理鹽水分別調(diào)整HPS菌液濃度為0.5 麥?zhǔn)媳葷岫?，均勻涂布于TSA 培養(yǎng)基，干燥后貼上藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑（Inhibition Zone Diameter，IZD），然后參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗菌藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100—S25判定藥物敏感性［9］。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 病原菌菌落、形態(tài)特征和“衛(wèi)星生長(zhǎng)”試驗(yàn)

將病料接種于TSA 培養(yǎng)基（含5%犢牛血清和10 mg/L NAD）平板表面，在5% CO2、37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24～38 h，出現(xiàn)表面光滑透明、圓形、隆起、針尖大小的露珠狀菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可見紅色球桿狀、細(xì)絲狀等多形態(tài)陰性菌?！靶l(wèi)星生長(zhǎng)”試驗(yàn)顯示，越靠近金黃色葡萄球菌菌苔的地方分離菌菌落越大，而遠(yuǎn)處分離菌菌落較小，甚至未見生長(zhǎng)。結(jié)果表明，共有86 份病料經(jīng)過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生的菌落形態(tài)、菌體特點(diǎn)和“衛(wèi)星生長(zhǎng)”現(xiàn)象符合HPS特性。

2.2 分離菌株的血清分型

利用HPS 16S rRNA 特異性鑒定引物對(duì)2.1 中培養(yǎng)得到的86 份分離菌株DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示86 份分離菌株在約822 bp 處均能得到目的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增目的條帶基本吻合（見圖1）。經(jīng)Blast軟件與Genbank 參考菌株同源性比對(duì)，獲得的基因核苷酸序列與參考菌株HPS DNA 基因序列相似性在98%以上，表明86份分離菌株均為HPS，總分離率為31.39%。根據(jù)病料采集部位統(tǒng)計(jì)分離率，肺臟、氣管、關(guān)節(jié)液、心包液和腦組織的分離率分別為43.02%、33.72%、10.47%、6.98%、5.81%。利用HPS 血清型1～15 型特異性引物對(duì)所得的86株HPS進(jìn)行PCR分子分型鑒定，結(jié)果顯示61 株HPS 擴(kuò)增條帶分別為320、450、730 bp，其余25 株HPS 未擴(kuò)增出目的條帶，為未知血清型（NT）。根據(jù)目的條帶大小得出；31 株HPS 為血清4型，占36.05%；18 株HPS 為血清5 型，占20.93%；12 株HPS 為血清14 型，占13.95%；25 株HPS 為未知血清型（NT），占29.07%（見圖2）。

圖1 部分HPS 16S rRNA電泳檢測(cè)結(jié)果

圖2 PCR分子血清分型電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

采用K-B 法對(duì)分離鑒定出的86 株HPS 進(jìn)行16 種抗生素藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，HPS 對(duì)頭孢類和多粘菌素B 藥物高度敏感，耐藥率在6.98%～13.95%；對(duì)鏈霉素、青霉素耐藥率較高，分別為40.70%和47.67%；HPS表現(xiàn)出多重耐藥性，至少耐6 種藥物，最高耐12 種藥物，其中耐12 種藥物的有5 株，耐11 種藥物的有7 株，耐10、7 種藥物的各有18 株，耐9、8 種藥物的各有15株，耐6種藥物的有8株。

3 結(jié)論與討論

此次研究通過(guò)在含有1%NAD 與5%犢牛血清的TSA 培養(yǎng)基上對(duì)分離菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)、染色鏡檢和“衛(wèi)星生長(zhǎng)”試驗(yàn)，從274 份病料樣本中分離培養(yǎng)出86株疑似HPS。由于HPS感染病豬通常與其他疾病混合感染，單憑傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定培養(yǎng)很難確定致病菌。目前，分子生物技術(shù)常被用于檢測(cè)病原微生物。16S rRNA序列保守性極高，是細(xì)菌分類鑒定較為理想的靶序列［10］。因此，在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用PCR 分子技術(shù)對(duì)分離菌株的DNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定出86份分離菌株為HPS，總檢出率為31.39%，低于王慶云［11］2021年對(duì)廊坊市副豬嗜血桿菌病調(diào)查的檢出率（64.97%）。不同采集組織病料的統(tǒng)計(jì)檢出率從高到低分別為肺臟、氣管、關(guān)節(jié)液、心包液和腦組織，這與王治方等［12］對(duì)河南省部分豬場(chǎng)HPS感染調(diào)查結(jié)果一致。

HPS 血清型較多，不同菌株之間毒力差異較大，1型、5型、10型、12型、13型、14型毒力最強(qiáng)，2型、4型、8型、15 型毒力中等，3 型、6 型、7 型、9 型、11 型感染豬后沒有明顯臨床癥狀，且不同血清型之間無(wú)交叉保護(hù)或交叉保護(hù)較差，甚至不同地區(qū)感染的血清型也不同［13-14］。因此，明確菌株血清型對(duì)于提高副豬嗜血桿菌病防控水平意義重大。此次研究采用PCR 分子血清分型和KRG 法（用于區(qū)分血清5 和12 型）對(duì)86 株HPS進(jìn)行血清分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有血清型4型、5型、14型和未知血清型。這與郭龍等［15］報(bào)道的2017 年我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)主要流行血清型為4型、5/12型、14型的結(jié)果一致。目前，我國(guó)商品HPS 疫苗菌株血清型為4 型和5 型，無(wú)法對(duì)其他血清型提供安全保護(hù)。因此，針對(duì)當(dāng)?shù)亓餍芯暄兄茟?yīng)用多價(jià)HPS 滅活疫苗對(duì)防控該病流行作用重大。此外，此次研究中未知血清型占比較高，僅次于血清4 型，這可能是廊坊市副豬嗜血桿菌病發(fā)病率較高的原因之一。

研究顯示，長(zhǎng)期濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致HPS 的耐藥性不斷增強(qiáng)，給副豬嗜血桿菌病的防治帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)。藥物敏感性檢測(cè)能夠了解細(xì)菌耐藥性情況，避免盲目使用藥物，是科學(xué)合理用藥的基本依據(jù)。此次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，HPS 對(duì)頭孢類和多粘菌素B 藥物耐藥率在6.98%～13.95%，相對(duì)較低；而對(duì)鏈霉素、青霉素耐藥率較高，分別為40.70%和47.67%；其余藥物耐藥性不十分嚴(yán)重，但是多重耐藥性比較普遍，耐藥種類在6種以上，最高12 種，其中耐10 種和7 種的菌株最多，均為18株，兩種耐藥菌株的占比為41.86%。河北省監(jiān)管部門應(yīng)重視多重耐藥性的問(wèn)題，建議加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)用藥監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)和宣傳。