梁小波,藍(lán) 楠,張 沄,王宋平,李玉英

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室,四川瀘州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(簡(jiǎn)稱慢阻肺)是一種以持續(xù)存在的呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限為特征的慢性炎癥性疾病[1]。肺功能檢查是目前診斷和評(píng)估該疾病嚴(yán)重程度的重要手段,香煙煙霧等導(dǎo)致的氣道重塑在慢阻肺患者肺功能下降過程中扮演著重要角色,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展過程中也起著關(guān)鍵作用[2-3]。白細(xì)胞介素(IL)-1超家族和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)-母親信號(hào)蛋白同源物(mothers against decapentaplegic homologs,Smad)超家族與慢阻肺、支氣管哮喘、肺纖維化等多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),這些肺部疾病在發(fā)生機(jī)制上都存在EMT,IL-33信號(hào)通路和TGF-β1信號(hào)通路在EMT發(fā)生、發(fā)展過程中是否存在相互作用目前并不清楚[4-6]。因此,探索IL-33在煙草提取物(cigarette smoke extracts,CSE)誘導(dǎo)EMT發(fā)生過程中的具體作用及IL-33/腫瘤發(fā)生抑制蛋白2(suppression of tumorigenicity 2,ST2)、TGF-β1/Smad3信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián),對(duì)于進(jìn)一步闡明慢阻肺的潛在細(xì)胞分子機(jī)制有著重要意義。本研究探討IL-33在CSE誘導(dǎo)細(xì)胞EMT形成過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)來源于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室;天下秀(金)香煙購自川渝中煙公司;ST2、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、Smad3、磷酸化Smad3(phosphorylation of Smad3,p-Smad3)抗體購自英國Abcam公司,波形蛋白(Vimentin)、TGF-β1、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司;人IL-33抗體購自美國R&D公司;重組人IL-33購自美國PeproTech公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Western blot檢測(cè)試劑盒及IP裂解液購自美國Thermo公司;垂直電泳槽、ECL化學(xué)發(fā)光底物、凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司;二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司;激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1CSE制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]制備CSE,依次點(diǎn)燃2支去過濾嘴香煙,負(fù)壓泵吸引下香煙煙霧通過裝有4 mL PBS的收集瓶,待煙霧溶解充分后,利用0.22 μm過濾器除去大顆粒物質(zhì)和細(xì)菌,1 mol/L NaOH將CSE的pH調(diào)至7.2～7.4。每次實(shí)驗(yàn)前30 min新鮮制備。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將細(xì)胞分為對(duì)照組、CSE組、CSE+Anti-IL-33組、CSE+IL-33組。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-9]進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和刺激,細(xì)胞在含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到70%融合度時(shí),按照實(shí)驗(yàn)分組分別給予PBS、5% CSE、5% CSE+Anti-IL-33(3 μg/mL)、5% CSE+IL-33(40 ng/mL)刺激,繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h,收集細(xì)胞。

1.2.3各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin熒光強(qiáng)度

各組細(xì)胞刺激72 h后用甲醛固定,0.2% TritoX-100溶液作用15 min,1%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min,E-cadherin、Vimentin一抗孵育過夜,二抗室溫避光作用2 h,DAPI室溫作用5 min,激光共聚焦顯微鏡觀察拍照后進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.2.4各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、ST2、TGF-β1、p-Smad3、Smad3蛋白表達(dá)

刺激72 h后收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行Western blot檢測(cè),凝膠成像儀曝光并提取圖片,AlphaEaseFC軟件分析目的條帶相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin熒光強(qiáng)度比較

與對(duì)照組比較,CSE暴露后干預(yù)各組細(xì)胞E-cadherin熒光強(qiáng)度減弱,Vimentin熒光強(qiáng)度增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CSE組比較,CSE+Anti-IL-33組E-cadherin熒光強(qiáng)度增強(qiáng),Vimentin熒光強(qiáng)度減弱,CSE+IL-33組E-cadherin熒光強(qiáng)度減弱,Vimentin熒光強(qiáng)度增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

A:E-cadherin熒光強(qiáng)度;B:E-cadherin熒光強(qiáng)度組間比較;C:Vimentin熒光強(qiáng)度;D:Vimentin熒光強(qiáng)度組間比較;①:對(duì)照組;②:CSE組;③:CSE+Anti-IL-33組;④:CSE+IL-33組;a:P<0.05,與對(duì)照組比較;b:P<0.05,與CSE組比較。

2.2 各組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、ST2蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較,CSE暴露后干預(yù)各組細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)降低,Vimentin、ST2蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CSE組比較,CSE+Anti-IL-33組E-cadherin蛋白表達(dá)升高,Vimentin、ST2蛋白表達(dá)降低,CSE+IL-33組E-cadherin蛋白表達(dá)降低,Vimentin、ST2蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

A:Western blot檢測(cè)E-cadherin、Vimentin、ST2表達(dá);B～D:分別為E-cadherin、Vimentin、ST2表達(dá)水平組間比較;①:對(duì)照組;②:CSE組;③:CSE+Anti-IL-33組;④:CSE+IL-33組;a:P<0.05,與對(duì)照組比較;b:P<0.05,與CSE組比較。

2.3 各組細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較,CSE暴露后干預(yù)各組細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CSE組比較,CSE+Anti-IL-33組TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)降低,CSE+IL-33組TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

A:Western blot檢測(cè)TGF-β1、p-Smad3表達(dá);B、C:分別為TGF-β1、p-Smad3表達(dá)水平組間比較;①:對(duì)照組;②:CSE組;③:CSE+Anti-IL-33組;④:CSE+IL-33組;a:P<0.05,與對(duì)照組比較;b:P<0.05,與CSE組比較。

3 討 論

慢阻肺已成為全球三大死亡原因之一,吸煙仍然是慢阻肺的主要危險(xiǎn)因素,長(zhǎng)期暴露于香煙煙霧等有害顆?；驓怏w中會(huì)導(dǎo)致慢阻肺患者肺功能的進(jìn)行性下降,嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量[1,10]。氣道重塑是引起慢阻肺患者肺功能下降的重要原因之一,EMT在氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[2-3]。EMT是由一組保守的誘導(dǎo)信號(hào)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器和下游效應(yīng)器驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞組織從上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的動(dòng)態(tài)過程,其中TGF-Smad家族的信號(hào)具有主導(dǎo)作用,其結(jié)果表現(xiàn)為E-cadherin、Occludin等上皮細(xì)胞蛋白表達(dá)下調(diào),Vimentin、Fibronectin等間質(zhì)細(xì)胞蛋白表達(dá)上調(diào),使上皮細(xì)胞頂?shù)讟O性喪失、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[11-12]。

既往研究表明[13-14],CSE可以在人支氣管上皮細(xì)胞、人小氣道上皮細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT的形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[15],在屋塵螨提取物處理的肺泡上皮細(xì)胞中,IL-33可以刺激CD146表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)慢性過敏性氣道炎癥的EMT形成。盡管CSE已被證實(shí)可以誘導(dǎo)多種肺上皮細(xì)胞EMT的形成,但是其在慢阻肺氣道重塑中的作用機(jī)制仍未闡明。

IL-33屬于IL-1趨化因子超家族成員,定位于細(xì)胞核并充當(dāng)基因調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞損傷、應(yīng)激、死亡時(shí)細(xì)胞核釋放,IL-33的N末端被裂解后才能獲得完全的生物活性,它需要與細(xì)胞膜上的ST2結(jié)合從而發(fā)揮促炎生物學(xué)功能[6]。既往研究顯示,在慢阻肺患者及香煙誘導(dǎo)的慢阻肺小鼠模型中IL-33和ST2的表達(dá)升高,而抗IL-33抗體可以減輕香煙誘導(dǎo)的慢阻肺小鼠模型病理改變[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn),IL-33的表達(dá)與慢阻肺患者疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),與第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)呈負(fù)相關(guān)[18]。但是IL-33/ST2信號(hào)通路在慢阻肺氣道重塑的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究顯示,與對(duì)照組比較,CSE暴露可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT,主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin熒光強(qiáng)度減弱,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin熒光強(qiáng)度增強(qiáng),Anti-IL-33可以抑制CSE誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的改變,而IL-33可以促進(jìn)這種變化。在Western blot實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,CSE暴露后細(xì)胞IL-33特異性受體ST2蛋白表達(dá)升高,Anti-IL-33可以抑制CSE誘導(dǎo)細(xì)胞ST2蛋白表達(dá),而IL-33可以與CSE協(xié)同作用進(jìn)一步升高ST2蛋白表達(dá)。根據(jù)以上研究結(jié)果,筆者推測(cè)IL-33可能通過IL-33/ST2軸促進(jìn)CSE誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的形成。

TGF-β與其胞膜受體結(jié)合后可使Smad2/Smad3發(fā)生磷酸化,后者與Smad4形成異源復(fù)合物轉(zhuǎn)位入核,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,CSE暴露后細(xì)胞TGF-β1及其下游信號(hào)分子p-Smad3蛋白表達(dá)升高,Anti-IL-33可以明顯抑制CSE暴露引起的TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá),IL-33可以促進(jìn)CSE暴露引起的TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,筆者推測(cè)IL-33信號(hào)通路與TGF-β1信號(hào)通路在慢阻肺EMT形成過程中可能的作用機(jī)制:IL-33可能通過上調(diào)氣道上皮細(xì)胞TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá),從而促進(jìn)CSE誘導(dǎo)的EMT形成。

綜上所述, IL-33可能通過IL-33/ST2軸上調(diào)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路,促進(jìn)CSE誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的形成,但是它們?cè)诼璺位颊唧w內(nèi)是否存在著相同的作用,以及IL-33是否會(huì)成為慢阻肺潛在的治療靶點(diǎn)還需進(jìn)一步研究。