趙良煒,張振國,徐赟霞,王 禹,張 麗

(天津市動物疫病預防控制中心,天津 300402)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,水產(chǎn)養(yǎng)殖病害成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要問題,2019年和2020年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖因疾病造成的經(jīng)濟損失分別為408億元和589億元,而細菌性疾病所占比例最高[1-2]。2020年天津地區(qū)淡水養(yǎng)殖面積22 731 hm2,淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量23.7萬噸,總產(chǎn)值54.0億元,其中草魚、鰱、鳙、鯉、鯽等大宗淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量18.6萬噸,占淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的78.5%[3]。根據(jù)2019年、2020年水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病情測報監(jiān)測結(jié)果,池塘養(yǎng)殖魚類細菌性疾病發(fā)病率分別占病害發(fā)病總數(shù)的50.0%和53.3%[1-2]。2022年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《關于做好2022年水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖技術推廣“五大行動”工作的通知》中要求繼續(xù)做好水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥減量行動,而對水生動物病原菌耐藥性監(jiān)測是用藥減量行動的重要環(huán)節(jié)。

通過流行病學調(diào)查顯示,氣單胞菌屬(Aeromonas)細菌是鯉、鯽、草魚等大宗淡水魚細菌性疾病的主要致病源。氣單胞菌屬細菌廣泛分布于水環(huán)境中,是一種條件致病菌,可以引起水產(chǎn)動物多種疾病,如細菌性敗血癥、細菌性爛鰓、腸炎等,對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。抗生素治療是針對此類疾病的首選方法,當前水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥及用藥指導是以國家漁藥標準為基礎,缺乏對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病菌的耐藥性監(jiān)測及致病菌耐藥性變化的數(shù)據(jù),再加上藥物的濫用、誤用等不合理用藥情況普遍存在,致使細菌耐藥性日益嚴重。因此,針對氣單胞菌病進行病原菌耐藥性監(jiān)測,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義:可以針對水產(chǎn)病原菌耐藥性及其變化的規(guī)律,在養(yǎng)殖過程中科學選擇和使用藥物;可以避免濫用藥物,為水產(chǎn)品的質(zhì)量安全奠定了基礎;可以控制細菌耐藥性的產(chǎn)生及傳遞,降低將耐藥性傳播給人類致病菌的潛在風險,維護公共衛(wèi)生安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 2020—2022年4—10月,每月采集發(fā)病樣品,樣品包括草魚、鰱、鳙、鯉、鯽等大宗淡水魚,取樣部位為肝、脾、腎、腹水。

1.1.2 生化試劑 營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液瓊脂(BHI)購自英國Oxoid公司,革蘭氏染液試劑盒、氧化酶試紙以及生化鑒定管均購自北京陸橋技術有限責任公司,梅里埃生化鑒定試劑卡GN及配套試劑購自法國梅里埃公司,藥敏預制板購自南京菲恩生物科技有限公司,DL2000 DNA marker、核酸染料、瓊脂糖購自Takara,PCR引物27F:(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R:(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)蘇州金唯智合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的生化鑒定 細菌生化鑒定采用梅里埃VITEK Compact2 進行,并補充革蘭氏染色、氧化發(fā)酵試驗、氧化酶試驗、硫化氫、葡萄糖產(chǎn)氣、V-P試驗等。

1.2.2 細菌的分子鑒定 細菌16S rRNA分子生物學鑒定按照曹青等[4]的方法進行。

1.2.3 細菌最小抑菌濃度(MIC)測定 細菌最小抑菌濃度測定采用微量稀釋法進行,操作方案按照南京菲恩藥物預制板說明書進行,質(zhì)控菌株使用大腸桿菌(ATCC29522),測定藥物均為允許使用的國標漁藥。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果, 采用 SPSS 計算各抗菌藥物對分離菌株的 MIC50和 MIC90( 分別指抑制50% 和90%分離菌株生長所需要的MIC)。

2 結(jié)果

2.1 氣單胞菌分離鑒定結(jié)果

氣單胞菌屬細菌在BHI瓊脂平板上菌落呈淡黃色,圓形,表面光滑、微凸,革蘭氏染色為陰性,氧化發(fā)酵陽性,氧化酶陽性,部分菌株生化鑒定結(jié)果見表1。分子鑒定通過對分離菌株進行16s rRNA擴增,將條帶大小與目的條帶一致的菌株經(jīng)測序、BIAST比對確定到種屬。2022年從寶坻、寧河區(qū)等地區(qū)人工養(yǎng)殖鯉、鯽、鰱、鳙、草魚等發(fā)病魚體內(nèi)共分離獲得氣單胞菌屬細菌60株,其中嗜水氣單胞菌32株,溫和氣單胞菌18株,維氏氣單胞菌8株、豚鼠氣單胞菌2株(分類占比見圖1)。

表1 部分菌株部分生化試驗結(jié)果

圖1 2022年氣單胞菌分離情況

2.2 氣單胞菌屬細菌耐藥性總體情況

2022年分離的60株氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布情況見表2、表3所示。分離菌株對恩諾沙星的感受性最低,其MIC50為0.12 μg/mL,MIC90為1.58 μg/mL;其次為鹽酸多西環(huán)素,其MIC50為0.27 μg/mL,MIC90為2.92 μg/mL;甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50雖然不高,分別為3.60、2.25、0.4 μg/mL,但MIC90卻很高,分別為117.50、29.76、10.23 μg/mL?；前烽g甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表2 60株病原菌對抗菌藥物的感受性分布

表3 60株病原菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

從抗菌藥物MIC分布情況來看,每種藥物都有相對集中的MIC分布。恩諾沙星的MIC主要分布在0.008～0.5 μg/mL之間,硫酸新霉素的MIC主要分布在0.25～4 μg/mL之間,甲砜霉素的MIC主要分布在1～4 μg/mL之間,氟苯尼考的MIC主要分布在1～2 μg/mL之間,鹽酸多西環(huán)素的MIC主要分布在0.06～4 μg/mL之間,氟甲喹的MIC主要分布在0.125～4 μg/mL之間,磺胺間甲氧嘧啶的MIC主要分布在128～1 024 μg/mL之間,磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的MIC主要分布在76/4～608/32 μg/mL之間。

2.3 不同種類氣單胞菌對水產(chǎn)用抗菌藥物的感受性

2.3.1 嗜水氣單胞菌對水產(chǎn)用抗菌藥物的感受性

32株嗜水氣單胞菌對抗菌藥物感受性分布情況見表4、表5。恩諾沙星、硫酸新霉素、氟甲喹、鹽酸多西環(huán)素對分離菌株的MIC50較低,分別為0.08、0.76、0.20、0.23 μg/mL;恩諾沙星和鹽酸多西環(huán)素的MIC90較低,分別為0.65、0.87 μg/mL。磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表4 嗜水氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布

表5 嗜水氣單胞菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

2.3.2 溫和氣單胞菌對水產(chǎn)用抗菌藥物的感受性 18株溫和氣單胞菌對抗菌藥物感受性分布情況見表6、表7。恩諾沙星、氟甲喹、鹽酸多西環(huán)素對分離菌株的MIC50較低,分別為0.15、0.54、0.18 μg/mL,鹽酸多西環(huán)素的MIC90最低,為2.35 μg/mL。恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50雖然不高,但MIC90卻很高,分別為6.23、11.39、314.01、55.33、11.00 μg/mL?；前烽g甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表6 溫和氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布

表7 溫和氣單胞菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

2.3.3 維氏氣單胞菌對水產(chǎn)用抗菌藥物的感受性 8株維氏氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布情況見表8、表9。恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素對分離菌株的MIC50較低,分別為0.19、0.49 μg/mL,恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素的MIC90較低,分別為1.3、3.68 μg/mL。甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50雖然不高,但MIC90卻很高,分別為41.31、15.02、22.63 μg/mL。磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表8 維氏氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布

表9 維氏氣單胞菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

2.3.4 豚鼠氣單胞菌對水產(chǎn)用抗菌藥物的感受性 豚鼠氣單胞菌由于分離數(shù)量較少,不進行MIC50和MIC90統(tǒng)計分析,其藥敏試驗結(jié)果見表10。結(jié)果顯示除恩諾沙星的MIC較低外,豚鼠氣單胞菌對其它7種藥物均呈現(xiàn)不同程度的耐受。

表10 豚鼠氣單胞菌對抗菌藥物感受性

2.4 不同種類氣單胞菌對水產(chǎn)用抗菌藥物感受性比較

嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞據(jù)、維氏氣單胞菌對抗菌藥物感受性結(jié)果進行Kruskal-Wallis 檢驗分析,結(jié)果如表11所示。3種氣單胞菌對硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶感受性存在差異,經(jīng)Bonferroni法校正顯著性水平的事后兩兩比較發(fā)現(xiàn)(表12),嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌對硫酸新霉素、氟苯尼考感受性存在差異,嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌對甲砜霉素感受性存在差異,3種氣單胞菌對氟甲喹和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶感受性經(jīng)Bonferroni法校正顯著性水平的事后兩兩比較后,差異不顯著。

表11 3種氣單胞菌之間對抗拒藥物感受性Kruskal-Wallis檢驗

表12 3種氣單胞菌對抗菌藥物感受性兩兩比較結(jié)果

3 討論

氣單胞菌屬細菌是大宗淡水魚類細菌性敗血癥的主要病原,其中嗜水氣單胞菌為最為常見的致病菌,2022年分離菌株中,嗜水氣單胞菌占總數(shù)的53.34%,吳亞鋒等[5]2017—2018年從江蘇分離氣單胞菌1 364株,分離菌株中以嗜水氣單胞菌最多,占67.23%,與本研究分離情況較為相似。而王一娟[6],張德鋒等[7],鄧玉婷等[8]從魚類分離獲得的病原菌以維氏氣單胞菌為主,說明不同地區(qū),氣單胞菌的組成存在一定差異。

氣單胞菌對抗菌藥物的感受性總體情況表明,恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素對分離菌株的抑菌效果較好,而磺胺類的兩種藥物、甲砜霉素的抑菌效果較差,與梁倩蓉等[9]2019年在浙江地區(qū)淡水養(yǎng)殖品種中分離的病原菌對抗菌藥物感受性結(jié)果較為相似。同為酰氨醇類藥物,氟苯尼考相對于甲砜霉素則呈現(xiàn)出不同程度的抑菌效果,這可能與氟苯尼考的分子結(jié)構有關,從而表現(xiàn)出對甲砜霉素耐藥細菌仍敏感[10]。比較不同種屬的氣單胞菌對抗菌藥物感受性,結(jié)果顯示不同種屬氣單胞菌對抗菌藥物感受性存在一定差異,與吳亞鋒等[5]、鄧玉婷等[8]報道一致。

在CLSI中,敏感是指使用常規(guī)劑量時的平均血藥濃度超過MIC 4倍以上,用常規(guī)劑量通常有效,耐藥是指藥物對細菌的MIC高于應用常規(guī)劑量時的血藥濃度,應用常規(guī)劑量治療通常無效。由于藥物在魚和人體內(nèi)的藥代動力學數(shù)據(jù)不同,而判斷細菌是否敏感必須考慮藥物在體內(nèi)的動力學特性,因此使用醫(yī)學上敏感、耐藥標準進行結(jié)果判定是不合理的[11]。故本文未采用醫(yī)學上的標準進行結(jié)果判定。通過研究發(fā)現(xiàn),同一種藥物在不同的水產(chǎn)動物體內(nèi),其藥代動力學也不完全相同,張國棟等[12]研究發(fā)現(xiàn)恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內(nèi)的峰濃度分別為 4.66 μg/mL 和 3.95 μg/mL,朱曉漫等[13]研究發(fā)現(xiàn)恩諾沙星在羅非魚血漿峰濃度為 4.38 mg/L。因此在藥物使用中需根據(jù)養(yǎng)殖品種,結(jié)合藥敏試驗結(jié)果和藥代動力學相關數(shù)據(jù)確定藥物使用劑量和周期,避免耐藥菌的產(chǎn)生并保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。