石文靜 施巍 王寧 張雷

（遼寧省大連生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116000）

1 引言

水體富營養(yǎng)化（eutrophication）是指在人類活動的影響下，生物所需的氮磷等營養(yǎng)物質大量進入湖泊、河湖、海灣等緩流水體，引起藻類及其他浮游生物迅速繁殖，導致水體溶解氧含量下降，引起水質惡化，從而造成魚類及其他生物大量死亡的現(xiàn)象。在自然條件下，也會發(fā)生湖泊從貧營養(yǎng)狀態(tài)逐步過渡到富營養(yǎng)狀態(tài)的現(xiàn)象，一般自然界中的這種過程通常非常緩慢。但是隨著工業(yè)的發(fā)展，人為排放的含有各類營養(yǎng)物質的工業(yè)廢水以及生活污水引起的水體富營養(yǎng)化卻可以在極短時間內發(fā)生。當水體出現(xiàn)富營養(yǎng)化時，生物表現(xiàn)形式為藻類大量繁殖，從而形成水華或赤潮現(xiàn)象（通常淡水富營養(yǎng)化稱為水華，海水富營養(yǎng)化則稱為赤潮）。通常來講，葉綠素a 是評價水體富營養(yǎng)化的一個重要參數(shù)，所以葉綠素a 的各項實驗室指標以及分析方法就非常重要。根據(jù)GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》［1］規(guī)定，我國海水葉綠素a 的監(jiān)測方法分為熒光分光光度法和分光光度法兩種，但現(xiàn)有標準中這兩種方法都沒明確檢出限、精密度和準確度等方法特征性指標，實驗室查閱多篇相關文獻并沒有獲得海水監(jiān)測中相關數(shù)據(jù)，但在實際工作中以及填報監(jiān)測數(shù)據(jù)時卻經常會要求填報方法檢出限之類的數(shù)據(jù)，所以本文以GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》、HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術導則》［2］、HJ 897—2017《水質葉綠素a 的測定分光光度法》［3］和《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第四版）［4］為依據(jù)，參考地表水中葉綠素a的方法研究等文獻材料［5］，通過試驗確立分光光度法分析海水中葉綠素a 的實驗室檢出限、精密度和準確度等特征性指標數(shù)據(jù)，以方便日常工作數(shù)據(jù)填報，并為其他實驗室分析人員提供參考。

2 材料與方法

實驗室參照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》中分光光度法對實驗室分析條件的要求以及HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術導則》中對分析項目檢出限、準確度以及精密度的相關規(guī)定，開展針對海水中葉綠素a 的分析檢測，記錄實驗結果并參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第四版）以及HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術導則》中對分析項目檢出限、準確度以及精密度的相關計算方法，對實驗數(shù)據(jù)進行計算并匯總。

2.1 儀器與試劑

參照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》中分光光度法監(jiān)測葉綠素a 的實驗室分析條件。

儀器：分光光度計；0.45 μm 玻璃纖維濾膜；具塞離心管。

試劑：葉綠素a 標準樣品（編號KCG6922）；90%丙酮溶液；碳酸鎂懸浮液（10 g/L）。

2.2 實驗方法

按照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》中分光光度法監(jiān)測葉綠素a 的實驗室分析條件。

2.2.1 樣品制備

利用量筒準確量取一定量海水樣品，加入3 mL碳酸鎂懸浮液，并混勻?；靹蚝髽悠酚?.45 μm 玻璃纖維濾膜過濾，過濾負壓不應超過50 kPa。

2.2.2 樣品提取

將樣品制備中過濾樣品后得到的玻璃纖維濾膜放入具塞離心管中，迅速加入10 mL 丙酮溶液并搖蕩，隨后放冰箱儲存室中儲存14～24 h 后取出離心提取，選擇離心機離心速度3 000～4 000 r/min、離心時間10 min。

2.2.3 樣品測定

取離心后的上清液于1 cm 比色皿中，利用分光光度計對上清液進行掃描分析，分析過程中利用空白丙酮溶液作參比溶液，分別記錄分光光度計750，664，647，630 nm 4 個波長處所測得的吸光值。需要注意的是，當分光光度計波長在750 nm 處，1 cm比色皿吸光度超過0.005 時，參與分析的提取液需要重新離心再進行分光光度比色分析。

3 結果與分析

參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第四版）中相關規(guī)定以及HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術導則》中對分析項目檢出限、準確度以及精密度的相關規(guī)定，本試驗分別對海水中葉綠素a 進行關于檢出限、準確度以及精密度等實驗室指標統(tǒng)計計算。

3.1 檢出限

對濃度為0.1 mg/L 的海水葉綠素a 標準品進行測定，并計算7 次平均測定的標準偏差，按照下面公式計算海水葉綠素a 的方法檢出限：

式中，MDL 為方法檢出限；n 為樣品的平行測定次數(shù)；t 為自由度為n-1、置信度為99%時的t 分布（單側，n=7 時，t=3.143）；S 為n 次平行測定的標準偏差。測定結果見表1。

表1 檢出限測定結果mg/L

由表1 中7 個檢測結果計算得出檢出限為0.018 mg/L，從而可以計算出：當實驗室丙酮使用液體積為10 mL、采樣體積為1 000 mL 時，海水中葉綠素a 的實驗室檢出限為0.18 μg/L。

3.2 準確度

實驗室采取加標回收率的方法來考察分光光度法檢測海水中葉綠素a 的方法準確性。采取對2 個濃度的實際樣品加標的方法來考察方法的準確度，加標方法為對實際海水樣品抽濾后加入葉綠素a 標準溶液，按照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》中分光光度法對樣品進行分析，分析結果見表2。由表2 可以看出，2 個濃度的海水實際樣品加標回收率分別為85.4%和82.7%。

表2 準確度測定結果

3.3 精密度

對不同濃度的海水實際樣品進行平行測定6次，并計算相對標準偏差，考察分光光度法檢測海水中葉綠素a 的方法精密度，實驗分析結果見表3。由表3 可以看出，分光光度法檢測海水中葉綠素a 的方法相對標準偏差為0.8%～4.4%。

表3 準確度測定結果

4 結果與討論

由以上實驗可以得出結論，利用分光光度法分析海水中葉綠素a 時，當丙酮使用液體積為10 mL、海水采樣體積為1 000 mL 時，本實驗利用分光光度法進行的海水中葉綠素a 分析的方法檢出限為0.18 μg/L，海水中葉綠素a 實際樣品加標回收率為85.4%和82.7%，實驗室精密度為0.8%～4.4%。

總結本實驗過程的注意事項和關鍵點為：（1）海水樣品在進行實驗室葉綠素a 分析之前必須搖勻再進行其他實驗室操作步驟；（2）如果實驗過程中當分光光度計波長在750 nm 處，1 cm 比色皿的吸光度超過0.005 時，參與分析的葉綠素a 提取液應重新離心再參與分析檢測；（3）由于葉綠素a 具有對光敏感的特性，所以實驗室進行海水中葉綠素a 實驗的全過程都應該在微光照條件下操作，并且實驗中所使用的標準溶液要嚴格避光保存。