婁惠娟，叢德毓，2，張紅石，蒙 蒙，李湛新，王宇峰*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021）

動(dòng)物造模方法的正確選擇，是保證一項(xiàng)科研研究順利進(jìn)行的基礎(chǔ)，腦梗死動(dòng)物模型正確建立對(duì)其發(fā)病機(jī)制及判斷療效等類型的研究都具有重要意義。腦卒中可分為出血性和缺血性2 種，因缺血性腦卒中臨床發(fā)病率遠(yuǎn)高于出血性腦卒中，導(dǎo)致目前的動(dòng)物研究也多集中于缺血性腦卒中上。動(dòng)物造模過(guò)程中因腦缺血時(shí)間的不同可分為永久性腦缺血和短暫性腦缺血，永久性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ图膊?yán)重程度及死亡率均較高，加之臨床中患者發(fā)病后多會(huì)進(jìn)行缺血的再灌注治療，因此短暫性腦缺血應(yīng)用更加廣泛。根據(jù)腦梗死面積的不同，又分為全腦缺血模型及局灶性腦缺血模型，全腦缺血模型多應(yīng)用于心臟驟停等導(dǎo)致的大面積腦損傷，臨床發(fā)病原因占比較少，且動(dòng)物模型死亡率高。而在局灶性腦缺血模型中大腦中動(dòng)脈模型應(yīng)用最為廣泛。

本文就局灶性腦梗死模型動(dòng)物的選擇、造模方法的選擇及模型建立與否的評(píng)價(jià)進(jìn)行概述。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

受到成本、倫理等的影響，嚙齒動(dòng)物是腦卒中研究中最常用的動(dòng)物[1]。在腦卒中實(shí)驗(yàn)研究論文中，絕大多數(shù)使用了嚙齒類動(dòng)物包括大鼠、小鼠、沙鼠，其中以大鼠居多。模型動(dòng)物選擇大鼠一方面是因?yàn)榇笫蟮哪X血管和生理與人類相似[2-3]，其適中的體形可以輕松監(jiān)測(cè)各項(xiàng)生理參數(shù)；它的大腦小，非常適合固定程序（例如用于組織切片的多聚甲醛固定等）[4]，最重要的是，進(jìn)行可重復(fù)的研究很容易。而對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)更適合用于基因的研究，因?yàn)樾∈笫亲钊菀装l(fā)生遺傳修飾的動(dòng)物[5-7]。因此大鼠、小鼠被廣泛用于評(píng)估中風(fēng)病理機(jī)制及治療機(jī)制的研究中。

2 造模方法的選擇

2.1 線栓法模型 在卒中研究中，最常用的體內(nèi)模型之一是嚙齒動(dòng)物的大腦中動(dòng)脈（MCA）血管內(nèi)縫合或線栓模型，這會(huì)在中動(dòng)脈供血區(qū)域造成可重復(fù)的梗死。通過(guò)阻塞頸總動(dòng)脈（CCA），頸外動(dòng)脈（ECA），將線栓直接引入頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）并推進(jìn)直到中斷向MCA的血液供應(yīng)[8]。據(jù)梗死的時(shí)間分為短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞（tMCAO），最常見(jiàn)的持續(xù)時(shí)間是60 min、90 min、120 min 和永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（pMCAO）[9-12]。梗死的體積受到線栓的直徑、硅酮涂層長(zhǎng)度及插入的長(zhǎng)度、鼠的品系（如Sprague-Dawley 較Wistar 變異性大）、再灌注的是否及時(shí)間等的影響。關(guān)于線栓進(jìn)入血管的切口，經(jīng)典的是Zea-Longa 報(bào)道的從ECA 切口將線栓引入，在以往的實(shí)驗(yàn)研究中也有較多的是從CCA 切口將線栓引入（見(jiàn)圖1A）。2 種方法各有千秋，線栓從ECA 切口進(jìn)入再灌注階段，線栓硅膠頭退回到ECA斷端，不阻礙CCA 的正常供血，模型形成完全性再灌注；因CCA 較ECA 血管的走向和直徑都更有利于線栓的進(jìn)入，對(duì)數(shù)實(shí)驗(yàn)也會(huì)選擇線栓從CCA 切口進(jìn)去，有研究表明通過(guò)CCA 插入途徑的MCAO 模型在大鼠中得到了更高的成功率[13-14]；Tsuchiya D 等的研究則表明阻斷CCA血流后t MCAO 得到的梗死體積明顯更大，并且梗死體積的變異性更小[15]。線栓法一般梗死涉及很大一部分的半球，包括大部分皮質(zhì)，紋狀體，丘腦，海馬和腦室下帶[16]（見(jiàn)圖1B）。其優(yōu)點(diǎn)包括：較低的侵入性，不需要進(jìn)行開(kāi)顱手術(shù)，模仿了人類的缺血性中風(fēng)并有與人類相似的缺血半暗帶[17]，梗死的體積較大，可重復(fù)性高，再灌注時(shí)間可控，能夠用于神經(jīng)保護(hù)的研究。但此方法可能會(huì)導(dǎo)致下丘腦的損傷發(fā)生高熱反應(yīng)，這在人類不多見(jiàn)。而且再灌注的實(shí)現(xiàn)更傾向于人類的機(jī)械取栓治療過(guò)程，不適用于溶栓治療的研究。

圖1 線栓法造模方法及梗死體積示意圖

2.2 開(kāi)顱模型 通過(guò)外科手術(shù)，打開(kāi)硬腦膜，在腦表面直接用灼燒或結(jié)扎閉塞表面血管引起局灶性的腦缺血（見(jiàn)圖2），不發(fā)生再灌注[18]。此類方法較適用于大型動(dòng)物的腦梗死，模型狀態(tài)穩(wěn)定，成模率高，但存在一定的腦熱損傷、手術(shù)過(guò)程大腦暴露于空氣中、顱內(nèi)壓改變等弊端。

圖2 開(kāi)顱法造模方法示意圖

2.3 內(nèi)皮素-1 注射腦卒中模型 內(nèi)皮素是一種內(nèi)源性長(zhǎng)效血管收縮肽[19-20]，通過(guò)持續(xù)有效的血管收縮作用，導(dǎo)致局部腦血流量減少，引起短暫的局灶性腦梗死，并且經(jīng)常用于模擬腔隙性中風(fēng)[21-22]。這種腦缺血模型損傷程度可以根據(jù)注射部位、內(nèi)皮素用藥濃度及注射劑量的不同進(jìn)行初步調(diào)控[23]。但隨著內(nèi)皮素-1 的藥物代謝，作用消失，動(dòng)脈逐漸恢復(fù)，并且梗死區(qū)域被重新灌注，導(dǎo)致不能嚴(yán)格控制腦缺血的持續(xù)時(shí)間。并且內(nèi)皮素-1 的使用已被證明可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，并產(chǎn)生允許軸突發(fā)芽的環(huán)境，這會(huì)干擾中風(fēng)后的恢復(fù)機(jī)制的研究[24-25]。

2.4 光化學(xué)法卒中模型 其造模原理是通過(guò)血管注射光敏劑（如孟加拉玫瑰紅、熒光素、熒光素鈉、赤蘚紅等），在動(dòng)物頭部特定部位開(kāi)顱骨窗，然后利用特定波長(zhǎng)的激光器照射腦組織表面，激光與光敏劑反應(yīng)釋放大量活性氧自由基，導(dǎo)致血管內(nèi)皮氧化損傷，血小板激活和聚集形成血栓[26-27]。這類模型操作相對(duì)方便，侵入性小，模型穩(wěn)定，成模率成活率高，模型嚴(yán)重程度受到激光照射時(shí)間、不同激光強(qiáng)度的調(diào)控，梗死面積相對(duì)較小，集中于一個(gè)位置（見(jiàn)圖3）。優(yōu)點(diǎn)在于梗死灶在皮層的位置、大小是相對(duì)可控的[28-30]。也有研究結(jié)合目前光化學(xué)技術(shù)，將光纖的末端加探針，實(shí)現(xiàn)腦深層部位的梗死灶，不局限于大腦皮層。但其存在的缺點(diǎn)也很明顯，首先這類模型除了人類存在的細(xì)胞毒性水腫外，還伴發(fā)血管性水腫，并迅速破壞血腦屏障；其次是迅速的終末動(dòng)脈閉塞使得梗死位置發(fā)生不可逆的細(xì)胞死亡。這在一定程度上限制了模型應(yīng)用于神經(jīng)保護(hù)劑的研究中，而常用來(lái)研究腔隙性腦梗死及腦缺血相關(guān)的長(zhǎng)期功能結(jié)局觀察[31]。

圖3 光化學(xué)法造模方法示意圖

2.5 梗死性卒中模型 梗死性卒中模型造模因使用拴子材質(zhì)來(lái)源的不同分為血栓梗死和非血栓梗死2 種。運(yùn)用不同材質(zhì)的栓子注入到ICA 或者ECA 末端中，來(lái)模擬人類的梗死性梗死。在血栓模型中，將血凝塊或者血凝酶注射到腦血管中，血凝塊隨血流因栓子的大小、數(shù)量等導(dǎo)致隨后的隨意腦區(qū)域內(nèi)發(fā)生梗死[32-33]。此類模型與人類的病理生理學(xué)情況類似，不僅可以分析具有自發(fā)恢復(fù)機(jī)制的急性期，而且可以分析慢性期。但也存在梗死的位置和梗死大小有很大的差異，閉塞物質(zhì)存在無(wú)法預(yù)測(cè)的部分或完全裂解，然后再灌注，這與臨床情況更為相似[34]。但也導(dǎo)致了各種不可控因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的挑戰(zhàn)，為此出現(xiàn)的特殊材質(zhì)的梗死模型，一定程度上改善了標(biāo)準(zhǔn)化的問(wèn)題，但也背離了臨床。

2.6 模型疾病風(fēng)險(xiǎn)因素的建立 為了更好地實(shí)現(xiàn)模型與臨床的轉(zhuǎn)化，性別、年齡、基礎(chǔ)疾病等對(duì)因素也被利用到造模中[35]。利用風(fēng)險(xiǎn)因素的干預(yù)導(dǎo)致自發(fā)性的中風(fēng)模型，目前運(yùn)用最廣泛的是高血壓自發(fā)中風(fēng)的模型[36]。該模型與臨床更加貼近但同時(shí)也大大增加科研成本。

3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定

3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 神經(jīng)功能缺損評(píng)分是評(píng)價(jià)模型成功與否的最簡(jiǎn)便的方法。包括Zea-Longa 評(píng)分法、Bederson 評(píng)分、神經(jīng)功能缺損評(píng)分（neurological severity scores，NSS）、 改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）、Belayev 評(píng)分等[37-39]。目前應(yīng)用較為廣泛的就是Zea-Longa 評(píng)分法，這些方法更多地關(guān)注了運(yùn)動(dòng)方面的評(píng)估。為了能夠更加全面地評(píng)估模型的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)及認(rèn)知缺損情況，同時(shí)還需要對(duì)模型進(jìn)行更加精細(xì)和有針對(duì)性的行為學(xué)變化觀察。

3.2 感覺(jué)運(yùn)動(dòng)類行為學(xué)評(píng)估 模型不同的梗死部位會(huì)表現(xiàn)出不同的行為學(xué)變化，額葉皮質(zhì)的梗死主要變現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力的下降，而頂葉皮質(zhì)或丘腦的梗死會(huì)出現(xiàn)感覺(jué)的異常，對(duì)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)的復(fù)雜行為學(xué)變化的評(píng)估包括平衡木行走實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、肢體放置實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、膠帶摘除實(shí)驗(yàn)、跑梯試驗(yàn)及相應(yīng)的改良實(shí)驗(yàn)，針對(duì)性的評(píng)估模型的平衡性、肌肉力量、感覺(jué)異常、異常行為活動(dòng)等[40-42]。

3.3 學(xué)習(xí)記憶類行為學(xué)評(píng)估 認(rèn)知的形成是一個(gè)復(fù)雜的回路共同作用產(chǎn)生的，在回路中的任何一部位的梗死灶都會(huì)導(dǎo)致模型學(xué)習(xí)記憶功能障礙，不論是淺層的皮質(zhì)還是深層的海馬出現(xiàn)缺血梗死都會(huì)對(duì)認(rèn)知產(chǎn)生影響。對(duì)于認(rèn)知的評(píng)估多是利用大鼠的不同生活喜好設(shè)計(jì)了不同實(shí)驗(yàn)，包括各種迷宮類，其中有利用大鼠惡水性的morris 水迷宮[43-44]及加以變換的放射臂水迷宮，利用大鼠避光避噪的巴恩斯迷宮[45]，食物誘導(dǎo)性的T迷宮、Y 迷宮。除此外還利用嚙齒類動(dòng)物喜歡探索陌生事物的天性設(shè)計(jì)的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，利用強(qiáng)刺激如點(diǎn)擊和噪音等設(shè)計(jì)的穿梭箱實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)[46]、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)等。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前最常應(yīng)用于檢測(cè)和評(píng)估模型學(xué)習(xí)及記憶能力的方法。

4 常用腦組織病理學(xué)評(píng)估

對(duì)于局灶性腦缺血模型的評(píng)估，腦組織的病理學(xué)染色也常被聯(lián)合運(yùn)用。常見(jiàn)的如2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色[47]、尼氏染色[48]、蘇木精-伊紅（HE）染色、Fluoro-JadeB（FJB）熒光染色、鍍銀染色、高爾基染色（golgi-cox）以及透射電鏡觀察神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等[49]。TTC 染色將活細(xì)胞染成紅色，因其便捷、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)被廣泛運(yùn)用于腦卒中急性期腦梗死體積的評(píng)價(jià)。HE 染色、尼氏染色主要能顯示出梗死細(xì)胞的形態(tài)變化特征、尼氏小體的多少。高爾基染色能夠?qū)⑸窠?jīng)元樹(shù)突棘突的形態(tài)多少變化顯現(xiàn)出來(lái)。而想要觀測(cè)亞細(xì)胞架構(gòu)就需要使用電鏡，來(lái)觀察線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等的超微結(jié)構(gòu)。

5 影像學(xué)檢查

模型造模后使用MRI 檢查[50]、CT 檢查等，能直觀地檢測(cè)出腦缺血，并且MRI 的靈敏度高，能夠發(fā)現(xiàn)超早期的腦缺血病灶[51]，也可以采用動(dòng)脈自旋標(biāo)記灌注磁共振成像技術(shù)、激光多普勒血流監(jiān)測(cè)[52]、激光散斑成像技術(shù)[53-54]等技術(shù)對(duì)模型進(jìn)行腦血流監(jiān)測(cè)，這類檢測(cè)相較于行為學(xué)檢測(cè)更加精確直觀，相較于病理染色不需要處死模型，不影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

6 小結(jié)

上述檢測(cè)技術(shù)用來(lái)檢測(cè)功能的缺損情況，問(wèn)題是嚙齒動(dòng)物比人類有更大的恢復(fù)潛力。同時(shí)動(dòng)物自身的認(rèn)知與感覺(jué)運(yùn)動(dòng)也存在相互影響，許多行為學(xué)實(shí)驗(yàn)與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示的梗死體積及位置會(huì)存在偏差。因此較為合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)常為選擇多種手段聯(lián)合使用，多種行為學(xué)方法聯(lián)合使用，并結(jié)合病理學(xué)、影像學(xué)等來(lái)綜合評(píng)估神經(jīng)缺損情況。