張洋

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以長(zhǎng)期不可逆的氣道受限和持續(xù)的呼吸道癥狀為特征的呼吸系統(tǒng)疾病,全球40歲以上人群中患病率為5%～19%,社會(huì)負(fù)擔(dān)重[1-2]。急性加重期COPD(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)會(huì)加速患者肺功能損害,導(dǎo)致不良預(yù)后[3]。探索預(yù)測(cè)COPD病程的有效標(biāo)志物,實(shí)現(xiàn)疾病監(jiān)測(cè)和及時(shí)治療,有助于提高患者的治療效果和生活質(zhì)量。有研究[4]發(fā)現(xiàn),COPD可能為吸煙引起的免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制與自身免疫系統(tǒng)的失調(diào)有關(guān)。吸煙者肺組織中存在大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞局部浸潤(rùn),其中T淋巴細(xì)胞,特別是CD4+T淋巴細(xì)胞,主要通過(guò)介導(dǎo)氣道炎癥或免疫應(yīng)答,在COPD的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中起重要作用,此過(guò)程需要樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)參與。DCs是啟動(dòng)或激活具有強(qiáng)功能活性T細(xì)胞的獨(dú)特抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs),被認(rèn)為在免疫反應(yīng)的啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和維持過(guò)程中起著主導(dǎo)作用[5-6]。一項(xiàng)研究[7]發(fā)現(xiàn),CC趨化因子受體6(CC chemokine receptor 6,CCR6)主要表達(dá)于未成熟DC(immature DC,imDC),而CD83(cluster of differentiation 83)則主要表達(dá)于成熟DC(mature DC,mDC)中。故本研究旨在探討COPD患者痰液中DCs以及輔助性T細(xì)胞(Help T cells,Th)亞群Th1、Th2的變化,從免疫調(diào)節(jié)機(jī)制闡述COPD的發(fā)病過(guò)程。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年8月—2022年11月我院就診的COPD患者265例,根據(jù)疾病狀態(tài)將135例COPD急性發(fā)作期患者納入AECOPD組,130例COPD穩(wěn)定期患者納入COPD穩(wěn)定期組,選取同期本院健康體檢者100例作為正常對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合2018年慢性阻塞性肺疾病全球倡議(global initiative for chronic obstructive lung disease,GOLD)[8]的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn),即肺功能檢查顯示支氣管擴(kuò)張后第一秒用力呼氣容積/用力肺活量(forced expiratory volume in one second/forced vital capacity, FEV1/FVC)<70%和FEV1占預(yù)計(jì)值<80%;(2)COPD穩(wěn)定期組咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀穩(wěn)定或輕微;AECOPD組處于病情發(fā)作期,或(呼吸困難、痰量和顏色)癥狀突然惡化,典型癥狀持續(xù)數(shù)天,需要更改常規(guī)用藥方案;(3)COPD患者近1個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素或抗生素;(4)對(duì)照組肺功能檢查和各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查無(wú)異常者;(5)可順利獲得各組受試者痰液標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他肺部疾病或伴有氣流受限特征疾病,如哮喘、活動(dòng)性肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺病、肺部惡性腫瘤等,或行過(guò)肺切除術(shù)者;(2)合并慢性炎癥性疾病,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、結(jié)締組織疾病、炎癥性腸病等疾病者;(3)合并心、腦、肝、腎等器官嚴(yán)重功能障礙,其他部位原發(fā)惡性腫瘤,血液系統(tǒng)或自身免疫性疾病者;(4)近1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)全身性類固醇或抗生素等抗感染治療者。收集受試者性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史等資料并進(jìn)行分析,3組間年齡、性別等一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見(jiàn)表1。本研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):KS-2023-05-10),所有患者均簽署知情同意書(shū)。

表1 3組受試者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 痰液樣本采集 正常對(duì)照組和所有COPD患者在入院后,使用抗生素及激素治療前收集晨起痰液標(biāo)本2 mL,吸入200 μg沙丁胺醇和3%高滲鹽水誘導(dǎo)痰排出。將痰標(biāo)本排入無(wú)菌杯后,低倍顯微鏡下觀察,上皮細(xì)胞<10個(gè)和白細(xì)胞>25個(gè)判斷為合格。將合格樣品與1×0.1%二硫蘇糖醇混勻后在37 ℃下孵育30 min,加入等體積無(wú)菌生理鹽水混勻,晃動(dòng)5 min,然后4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,吸取上清液在-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 痰液樣本中CD83和CCR6水平檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)痰液中CD83和CCR6表達(dá)水平,將痰上清液加入10 μL小鼠抗人CD83抗體(美國(guó)eBioscience公司)和小鼠抗人CCR6抗體(美國(guó)eBioscience公司)共處理20 min。用0.1% NaN3溶液和1%胎牛血清懸浮細(xì)胞。BD FACSCelestaTM流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)CD83、CCR6陽(yáng)性細(xì)胞百分比,計(jì)算CD83/CCR6比值。

1.2.3 痰液樣本中Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme- linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒檢測(cè)痰樣本上清液中Th1 [干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]和Th2 [白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4、IL-6] 相關(guān)細(xì)胞因子水平,試劑盒均購(gòu)自上海茂元科技有限公司。

1.2.4 肺功能測(cè)定 COPD患者于治療前行肺功能檢測(cè),正常對(duì)照組于體檢時(shí)進(jìn)行肺功能檢測(cè)。受試者取坐位,待呼吸平穩(wěn)時(shí),使最大可能吸氣后迅速且最大力呼出,通過(guò)肺功能儀(HI-101,日本CHEST捷斯特)獲取FEV1、FEV1/FVC和FEV1% pred,評(píng)估患者肺功能。根據(jù)GOLD報(bào)告進(jìn)行肺功能分級(jí)[8],Ⅰ級(jí):氣流受限輕度,FEV1%Pred≥80%;Ⅱ級(jí):氣流受限中度,FEV1% 50%～79%;Ⅲ級(jí):氣流受限重度,FEV1% 30%～49%;Ⅳ級(jí):氣流受限極重度,FEV1% <30%。

1.2.5 COPD穩(wěn)定期組COPD評(píng)估測(cè)試(COPD assessment test,CAT)評(píng)分[9]采用CAT評(píng)分評(píng)估COPD穩(wěn)定期患者日?；顒?dòng)水平,量表包括咳嗽、咳痰、胸悶、呼吸困難、活動(dòng)受限、離家信心、睡眠和精力情況8個(gè)項(xiàng)目,每個(gè)項(xiàng)目分?jǐn)?shù)從0～5分(無(wú)到極嚴(yán)重),CAT總分從0～40分(0～10:輕度影響;11～20分:中度影響;21～30分:重度影響;31～40分:極重度影響)。CAT的最小臨床重要差異為2分。

1.2.6 COPD穩(wěn)定期組改良版英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)呼吸問(wèn)卷(modified British medical research council,mMRC)分級(jí)[10]采用mMRC分級(jí)評(píng)估COPD穩(wěn)定期患者呼吸困難程度。mMRC分級(jí)0級(jí):患者在劇烈活動(dòng)中出現(xiàn)呼吸困難;1級(jí):平地快步行走/爬緩坡中出現(xiàn)呼吸困難;2級(jí):患者平地快步行走/爬緩坡較同齡人緩慢,需要休息;3級(jí):患者平地行走100米或數(shù)分鐘后需停下喘氣;4級(jí):患者呼吸困難無(wú)法離家/穿脫衣服時(shí)出現(xiàn)呼吸困難。mMRC分級(jí)≥2級(jí)被認(rèn)為是嚴(yán)重呼吸困難。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察比較3組痰液樣本中CD83、CCR6及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平變化,分析其與COPD穩(wěn)定期患者肺功能、CAT評(píng)分及mMRC分級(jí)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者一般資料比較 3組受試者間年齡、性別、吸煙史、體質(zhì)量指數(shù)、病程及近1個(gè)月內(nèi)主要用藥史比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 3組受試者痰液CD83、CCR6及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 AECOPD組、COPD穩(wěn)定期組、正常對(duì)照組痰液中CD83/CCR6比值依次升高,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平依次降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組痰樣本中CD83、CCR6表達(dá)及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.3 不同肺功能分級(jí)的COPD穩(wěn)定期患者痰CD83、CCR6及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 隨著COPD穩(wěn)定期患者GOLD肺功能分級(jí)逐漸升高,痰液中CD83/CCR6水平逐漸降低,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平則逐漸升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同肺功能分級(jí)的COPD穩(wěn)定期患者痰CD83、CCR6表達(dá)及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.4 不同CAT評(píng)分的COPD穩(wěn)定期患者痰CD83、CCR6表達(dá)及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 隨CAT評(píng)分逐漸增加,患者痰液中CD83、CD83/CCR6水平逐漸降低, TNF-α、IL-4、IL-6水平則逐漸升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輕度影響組CCR6、IFN-γ顯著低于中度、重度、極重度影響組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同CAT評(píng)分的COPD穩(wěn)定期患者痰樣本中CD83、CCR6表達(dá)及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.5 不同mMRC分級(jí)的COPD穩(wěn)定期患者痰CD83、CCR6表達(dá)及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 按mMRC分級(jí)將患者分為mMRC分級(jí)<2級(jí)亞組和mMRC分級(jí)≥2級(jí)亞組,mMRC分級(jí)≥2級(jí)亞組患者的CD83、CD83/CCR6比值低于mMRC分級(jí)<2級(jí)亞組,而IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平則顯著高于mMR<2級(jí)亞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組間CCR6水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 不同mMRC分級(jí)的COPD穩(wěn)定期患者痰CD83、CCR6表達(dá)及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

3 討論

AECOPD是COPD發(fā)展的自然病程,患者癥狀加重,肺功能惡化,生活質(zhì)量下降,是未來(lái)發(fā)病率和死亡率增加的潛在危險(xiǎn)因素。GOLD指出,預(yù)防和治療急性加重是COPD管理的關(guān)鍵目標(biāo)之一[8,11]。目前已證實(shí)COPD與氣道和肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥有關(guān),急性加重時(shí)增加與全身性炎癥有關(guān)[12]。眾所周知,COPD炎癥應(yīng)答過(guò)程需要啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,DCs是激活T細(xì)胞的最重要的免疫細(xì)胞。COPD動(dòng)物模型和COPD患者外周血中DC顯著降低,但結(jié)論存在爭(zhēng)議[13]。本研究中,COPD患者痰樣本中CD83/CCR6比值普遍降低,尤其是AECOPD患者降低更明顯。筆者推測(cè)可能與DCs的不成熟狀態(tài)有關(guān),且肺組織中不成熟DCs浸潤(rùn)增多可能是導(dǎo)致疾病急性發(fā)作的重要原因之一。這一結(jié)論與Su等[14]研究結(jié)果一致,該研究結(jié)果表明COPD患者中mDCs降低,且隨著COPD的進(jìn)展,DCs成熟度受到進(jìn)一步抑制。

此外,有研究[15]提出,T淋巴細(xì)胞與DCs的相互作用是COPD免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中重要的環(huán)節(jié)?；罨腃D4+T淋巴細(xì)胞可分化為Th1及Th2細(xì)胞,Th1細(xì)胞主要分泌促炎相關(guān)細(xì)胞因子,如IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ等,Th2則為分泌抗炎相關(guān)細(xì)胞因子,如IL-4、IL-5、IL-6等。Th1與Th2可以相互制衡從而維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài),當(dāng)Th1、Th2細(xì)胞發(fā)生異常分化、平衡打破時(shí)就會(huì)引發(fā)免疫功能障礙。Wei等[16]對(duì)AECOPD及穩(wěn)定期COPD患者Th1/Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)研究顯示,AECOPD患者IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17的水平高于COPD穩(wěn)定期或正常對(duì)照組,證實(shí)了COPD患者的急性發(fā)作與CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的失衡相關(guān),且該變化是由Th1/Th2失衡引起的。本研究結(jié)果顯示,COPD患者痰樣本中Th1相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α)、Th2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-6)水平均顯著升高,且AECOPD組患者各指標(biāo)水平變化最為明顯,與Wei等[16]學(xué)者的研究結(jié)論相符。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Th1及Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平的升高,還與穩(wěn)定期COPD患者肺功能下降、呼吸困難程度及日?；顒?dòng)水平的影響加重相關(guān)。

肺功能檢查可反映COPD患者的疾病進(jìn)展和肺功能水平,也可有效評(píng)估患者的生活質(zhì)量[17]。但由于COPD是一種全身性疾病,病情受多種因素影響,單一肺功能檢測(cè)無(wú)法真實(shí)反映患者病情狀況,因此臨床在評(píng)估COPD病情程度時(shí),需要綜合其他指標(biāo)共同評(píng)價(jià)。mMRC量表在評(píng)估COPD患者呼吸困難的嚴(yán)重程度方面具有重要價(jià)值,CAT評(píng)分有助于監(jiān)測(cè)COPD加重后的恢復(fù)情況[18]。GOLD肺功能分級(jí)評(píng)估結(jié)合CAT評(píng)分和mMRC量表可能更有效地預(yù)測(cè)COPD的臨床病程。既往研究[19]證實(shí),肺組織中DCs成熟標(biāo)記物表達(dá)的增加與COPD的嚴(yán)重程度相關(guān),且在COPD患者的小氣道和肺泡中DCs成熟度顯著降低。Lourenco等[20]研究發(fā)現(xiàn),Th1、Th2及Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān),其表達(dá)水平可作為判斷COPD嚴(yán)重程度的指標(biāo)。在本研究中,穩(wěn)定期COPD患者痰液中CD83、CCR6及Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子與肺功能分級(jí)、CAT評(píng)分及mMRC量表有關(guān),痰液中CD83/CCR6比值隨著穩(wěn)定期COPD患者GOLD肺功能分級(jí)和CAT評(píng)分增加逐漸降低,而IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平逐漸升高;mMRC分級(jí)≥2級(jí)患者痰液CD83/CCR6比值顯著降低,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平則顯著升高。表明隨著COPD疾病嚴(yán)重程度的加重,患者痰液中的DCs的成熟度、Th細(xì)胞相關(guān)因子均會(huì)發(fā)生明顯變化。

綜上所述,穩(wěn)定期COPD患者和AECOPD患者痰液中CD83/CCR6比值降低,Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平升高,且這些指標(biāo)可反映COPD患者肺功能狀態(tài)、呼吸困難程度及生活質(zhì)量,提示其有作為預(yù)測(cè)COPD急性加重風(fēng)險(xiǎn)和病情程度的生物標(biāo)志物的潛力,有助于更精確和有效的疾病管理。但本研究未考慮治療前后指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,是局限性之一,后續(xù)研究需進(jìn)一步關(guān)注治療對(duì)CCR6、CD83和Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子的影響及在COPD發(fā)病中的潛在病理機(jī)制。