黃 明，曾維友，張義剛，程玥晴，闞建全，彭先容，謝永紅*

（1.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，重慶 401329；2.江津區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，重慶江津 402260；3.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；4.豐都縣農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)保檢驗監(jiān)測站，重慶豐都 408200）

蕓香科（Rutaceae）花椒屬（ZanthoxylumL.）植物在全球范圍內(nèi)約有250 個種，廣泛分布于亞洲、美洲、非洲和大洋洲的亞熱帶和熱帶地區(qū)，以中國的花椒種質(zhì)資源最為豐富，已發(fā)現(xiàn)45 個種和13 個變種，主要分布于中國西南地區(qū)。目前，全球花椒的栽培種主要是花椒（Zanthoxylum bungeanum）和竹葉花椒（Zanthoxylum armatum）兩個種，規(guī)?；耘嗷ń返膰抑饕兄袊⒂《?、韓國和日本，中國的花椒栽培面積和產(chǎn)量均居全球首位?；ń吩谖覈A北、華中、華南、西北和西南地區(qū)均有大規(guī)模栽培，其中西南地區(qū)是我國花椒產(chǎn)業(yè)的主產(chǎn)區(qū)。近年來，隨著花椒消費的普及，花椒作為重要的香辛料經(jīng)濟林木，產(chǎn)業(yè)規(guī)模持續(xù)擴大，花椒產(chǎn)量以每年約20%的增速快速增長，在荒山治理，生態(tài)保護、脫貧攻堅及鄉(xiāng)村振興等方面都發(fā)揮了重要的作用[1-2]。

花椒的大小、顏色、香氣與麻味都是評價其品質(zhì)的重要指標。不同品種、不同產(chǎn)地、不同栽培環(huán)境下花椒的大小與顏色差異較大，而且采后加工與貯藏方法也會嚴重影響產(chǎn)品的表觀顏色。相對于花椒大小與顏色，香氣與麻味則是花椒作為香辛料的關(guān)鍵評價指標。香氣和麻味均來源于花椒果皮，構(gòu)成花椒果皮的主要化學(xué)成分是揮發(fā)油、酰胺類、生物堿、香豆素、黃酮類與脂肪類物質(zhì)，其中花椒揮發(fā)油是香氣的主要來源，烯烴類、醇類、酮類、酯類和環(huán)氧化合物是揮發(fā)油的主要組分，其中含量相對較高的是月桂烯、檸檬烯和芳樟醇[3]。芳樟醇、檸檬烯、乙酸芳樟酯和乙酸松油酯可能是區(qū)別不同竹葉花椒（Z.armatum）品種的特征揮發(fā)成分，但區(qū)別不同花椒（Z.bungeanum）品種的特征揮發(fā)物還不明確[4]。而溶于醇的酰胺類有機物是花椒麻味的主要來源，這類長鏈不飽和脂肪酸酰胺通常被稱為花椒麻味物質(zhì)或花椒麻素。我國花椒種質(zhì)資源果皮中酰胺類物質(zhì)含量分布區(qū)間是1.3～20.1 mg·g-1，平均含量為12.0 mg·g-1[5]?；ń仿槲段镔|(zhì)主要包括花椒素、異花椒素、雙氫花椒素、四氫花椒素、α-山椒素、γ-山椒素、脫氫γ-山椒素、羥基α-山椒素、羥基β-山椒素、羥基γ-山椒素等[6-7]。雖然花椒的麻味強度與酰胺類物質(zhì)的總量有一定的相關(guān)性，但不同酰胺類物質(zhì)的麻味強度卻不盡相同，所以不同花椒的麻味強度實際上是受這些酰胺類物質(zhì)的組成和含量的雙重影響[8-9]。

我國花椒種質(zhì)資源種類豐富、分布廣泛，蘊含了大量品質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì)。相對于日本、韓國等國家，我國花椒種質(zhì)資源的收集保存與選育工作雖然起步較晚，但通過近30年的努力探索，已取得顯著成就。前期對花椒種質(zhì)資源的評價主要集中在形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)和生理生化等方面，而近年來隨著分子標記、基因組測序技術(shù)與色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的運用普及，對花椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行了較為全面深入的評價[10-14]，也陸續(xù)選育出一批優(yōu)質(zhì)、多抗的種源或品種，為花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了重要支撐和保障。此外，我國科研工作者最近陸續(xù)對多個花椒種及其近緣種的全基因組進行了高質(zhì)量繪制與組裝，這也為深入挖掘花椒品質(zhì)性狀種質(zhì)及解析花椒品質(zhì)形成的分子機理奠定了重要基礎(chǔ)[15-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料

5 種豐都花椒新鮮樣品：豐椒1 號、豐椒2 號、豐椒3號、豐椒4號、豐椒5號。所有花椒樣品均于2022年6 月21 日在重慶市豐都縣采摘，采摘后當(dāng)天冷藏運輸至實驗室進行檢測?；ń窐悠愤\至實驗室后各取一部分立即測定水分、百粒重及籽皮比重，剩余樣品貯藏于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)指標測定。

1.1.2 儀器設(shè)備

BSA124S-CW 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DZF-6020 鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Centrifuge 5810 離心機，艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司進口；PS-60AL 超聲儀，深圳市雷德邦電子有限公司；GCMS-QP2010 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.1.3 試劑藥品

甲醇：分析純，重慶市鈦新化工有限公司；甲醇：色譜純，重慶市鈦新化工有限公司；乙醚：分析純，重慶市鈦新化工有限公司；無水乙醇：分析純，重慶市鈦新化工有限公司；正癸烷標準品：≥99.0%，重慶市鈦新化工有限公司；羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ 山椒素標準品：≥98.0%，成都麥德生科技有限公司；檸檬烯標準品，重慶市躍翔化工有限公司；芳樟醇標準品，重慶朋強石油化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將新鮮花椒的梗、葉去除，干燥處理后分離籽和皮，計算籽與皮比重。揮發(fā)油的提取按照要求用整粒新鮮花椒進行，其余指標的測定用整粒鮮花椒粉碎后的冷凍花椒樣品進行。

1.2.2 花椒百粒重測定

參考中華人民共和國國家標準“GB/T 5519-2018谷物與豆類千粒重的測定”并做適當(dāng)修改，對花椒中百粒重進行測定。

1.2.3 花椒水分含量測定

參考中華人民共和國國家標準“GB 5009.3—2016 食品安全國家標準食品中水分的測定”對花椒中水分含量進行測定。

1.2.4 花椒總灰分含量測定

參考中華人民共和國國家標準“GB 5009.4—2016 食品安全國家標準食品中灰分的測定”對花椒中總灰分含量進行測定。

1.2.5 花椒醇溶抽提物測定

參考中華人民共和國國家標準“GB/T 12729.10-2008 香辛料和調(diào)味品醇溶抽提物的測定”對花椒中醇溶抽提物進行測定。

1.2.6 花椒不揮發(fā)乙醚抽提物測定

參考中華人民共和國國家標準“GB/T 12729.12-2008 香辛料和調(diào)味品不揮發(fā)性乙醚抽提物的測定”對花椒中不揮發(fā)性乙醚抽提物進行測定。

1.2.7 花椒麻味物質(zhì)（花椒酰胺）含量測定

參考中華人民共和國供銷合作行業(yè)標準“GH/T 1291-2020 花椒及花椒加工產(chǎn)品花椒酰胺總含量的測定高效液相色譜法”并做如下適當(dāng)修改，對花椒中主要花椒酰胺的含量進行測定。稱取0.5 g粉碎后的鮮花椒樣品與50 mL 甲醇混合，并在50 ℃和300 W 條件下超聲處理40 min。處理后的混合物于4 500 r·min-1離心10 min，保留離心后上清液，并將剩余沉淀物再次與30 mL 甲醇混合重復(fù)提取。取以上兩次提取得到的上清液混合并定容至100 mL，以0.22μm 有機濾膜過濾后即為提取的麻味素溶液。色譜分析使用安捷倫Eclipse XDB-C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為離子水(洗脫液A)和甲醇(洗脫液B)。柱溫40 ℃，檢測波長為270m m，流速為1 mL·min-1，進樣量為10 μL。梯度洗脫40 min。以羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-ε-山椒素及羥基-γ-山椒素的標準曲線計算麻味物質(zhì)含量。

1.2.8 花椒揮發(fā)油含量測定

參考中華人民共和國國家標準“GB/T30385-2013/ISO 6571：2008 香辛料和調(diào)味品揮發(fā)油含量的測定”對花椒中揮發(fā)油含量進行測定。收集的揮發(fā)油繼續(xù)用于其組成成分的測定。

1.2.9 花椒揮發(fā)油組成成分測定

參考中華人民共和國供銷合作行業(yè)標準“GH/T 1294—2020 花椒揮發(fā)性成分的測定氣相色譜-質(zhì)譜法”并做如下做適當(dāng)修改，對花椒中揮發(fā)油組成成分與含量進行測定。準確吸取15μL 提取的青花椒揮發(fā)油，加入150 μL 正癸烷（0.01 g·mL-1）作為內(nèi)標物，用無水乙醇定容至5 mL 用于GC-MS 分析。GC-MS色譜條件：色譜柱為DB-5MS 石英毛細柱（30 m ×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：60 ℃保持10 min，先以2 ℃·min-1升至70 ℃，然后以10 ℃·min-1升至140 ℃，再以5 ℃·min-1升至170 ℃維持1 min，最后以15 ℃·min-1升至230 ℃并保持10 min；進樣口溫度：250 ℃；載氣：He；流速：3 mL·min-1；壓力：40.7 kPa；進樣量：5μL；進樣方式：以分流比5∶1 分流進樣。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度：230 ℃；電離能：80 eV；采集方式：Scan；掃描速度：1 666 u·s-1；質(zhì)量掃描范圍：35～500 m/z。揮發(fā)油樣品中成分的定性通過計算保留指數(shù)，由計算機檢索與NIST 08s.LIB和NIST 17.LIB譜庫匹配獲得，檸檬烯和芳樟醇采用外標法進行準確定量。定量分析按公式計算：

（1）式中，Cvo為揮發(fā)油組分濃度，Cd為正癸烷內(nèi)標濃度，mg·mL-1；ms1為揮發(fā)油組分峰面積，ms2為正癸烷內(nèi)標峰面積，ng·(mL-1·h-1)；V1為內(nèi)標物體積，V2為揮發(fā)油體積，mL。

1.2.10 花椒香氣感官評價

從西南大學(xué)本科學(xué)生中招募了50 名年齡18～20歲、擁有良好的感官敏銳度及經(jīng)常食用花椒的人作為培訓(xùn)對象。按照中華人民共和國國家標準“GB/T 16291.1—2012 感官分析選拔、培訓(xùn)與管理評價員一般導(dǎo)則第1 部分：優(yōu)選評價員”的基本要求，進一步篩選出13 名符合要求的評價員，組成了感官評價小組。參考本課題組之前建立的花椒麻感和香氣評價指標，對小組成員進行了總共30 h的培訓(xùn)。

通過小組討論將每種香氣屬性配有1～4 個參比，通過定量描述分析法（QDA 法）對多個評價指標進行評分（見表1）。最終的評估過程是在白色評價隔間中進行的。評價時，整顆新鮮花椒樣本以隨機順序依次呈現(xiàn)，所有樣本均采用三位數(shù)隨機編碼，以消除偏差。感官小組成員分別評估鮮花椒樣品中嗅聞到的香氣強度，且對在訓(xùn)練期間產(chǎn)生的每個香氣屬性都進行了評估。數(shù)值范圍為0～15，增量為0.5，其中0 表示無，15 表示極高。為了最大限度地減少評估員嗅覺疲勞的影響，每次會議都向每位小組成員提供熱毛巾。

表1 花椒香氣感官評價指標

1.2.11 花椒麻味感官評價

1.2.1 1.1 定量描述分析法（QDA法）

通過小組討論將每種麻感屬性配有1～4 個參比樣。通過定量描述分析法（QDA 法）對多個評價指標進行評分（見表2）。最終的評估過程是在白色評價隔間中進行的。評價人員在正式評價前先漱口，再將1顆鮮花椒果皮送至舌尖，左右牙齒各咀嚼3下后吐出。評價時，花椒樣本以隨機順序依次呈現(xiàn)，所有樣本均采用三位數(shù)隨機編碼，以消除偏差。感官小組成員分別評估樣品中感受到的麻感屬性，且對在訓(xùn)練期間產(chǎn)生的每個麻感屬性都進行了評估。數(shù)值范圍為0～15，增量為0.5，其中0表示無，15表示極高。

表2 花椒麻味感官評價指標

1.2.1 1.2 時間-強度法（TI法）

采用實驗室前期研究建立的鮮花椒麻度感官評價的15 cm 標記線性標度。由經(jīng)驗豐富的感官分析師統(tǒng)一評價小組的感覺測量范圍，建立3 點麻感標度及其標度值：“3 cm-微麻”“7.5 cm-較麻”“10 cm-麻”，并通過培訓(xùn)使評價員能夠很好地掌握麻度標度值對應(yīng)語義。實驗在經(jīng)過標準化設(shè)計的紙質(zhì)回答表上進行，由感官分析師進行統(tǒng)一計時，評價員在規(guī)定的時間點上參考15 cm 麻感強度參比標度進行強度估計。評價人員在正式評價前先漱口，再將1 顆鮮花椒果皮送至舌尖，左右牙齒各咀嚼3 下后吐出，同時由感官分析師計時，在感官評價回答表上進行，整體麻感強度記錄評價時間為入口開始計時，90 s 前每隔10 s 記錄口腔感知的整體麻感強度，90 s 后每隔30 s 記錄1 次，直至900 s實驗結(jié)束。每個樣品重復(fù)測定3次，樣品呈送符合隨機、平衡原則。在實驗過程中允許小組成員在實驗期間短暫休息，并在必要時離開感官實驗室進行調(diào)整，避免味覺疲勞給實驗結(jié)果造成不必要的誤差。

1.2.12 試驗數(shù)據(jù)處理

通過主成分分析(PCA)對QDA 數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)使用每個香氣屬性或麻感屬性的小組平均數(shù)據(jù)得分。運用XLSTAT 對TI 數(shù)據(jù)進行非線性曲線擬合。所有顯著性檢驗均采用GrapPad Prism 8 軟件，在5%的顯著性水平下進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒百粒重、籽皮比及水分、總灰分、醇溶提取物、不溶性乙醚抽提物含量

測定結(jié)果顯示（見表3），5 種鮮花椒的百粒重與籽皮比在統(tǒng)計學(xué)上均沒有顯著差異；豐椒2 號的含水量顯著高于豐椒4號和豐椒5號，豐椒1號的總灰分含量最高，其次是豐椒2號、豐椒4號和豐椒5號，豐椒3號的總灰分含量最低，說明豐椒1號中的礦物質(zhì)含量最高；豐椒3 號和豐椒4 號的醇溶抽提物含量最低，而豐椒1 號和豐椒5 號的醇溶抽提物含量最高，說明豐椒1號和豐椒5號中的有機物質(zhì)含量最高；豐椒5號的不揮發(fā)性乙醚抽提物含量最高，其次是豐椒1 號和豐椒2號，豐椒3號和豐椒4號的不揮發(fā)性乙醚抽提物含量最低，說明豐椒5 號中的不揮發(fā)性有機物質(zhì)含量最高，但按照中華人民共和國國家標準《花椒》（GB/T30391-2013），這5 種鮮花椒的不揮發(fā)性乙醚抽提物均達到了“鮮花椒一級標準”。

表3 花椒百粒重、籽皮比及水分、灰分、醇溶提取物與不溶性乙醚抽提物含量測定結(jié)果

2.2 花椒揮發(fā)油含量與組成成分

5 種花椒揮發(fā)油含量測定結(jié)果顯示（見表4），豐椒3號、豐椒4號和豐椒5號鮮花椒的揮發(fā)油含量都顯著高于豐椒2 號，這說明豐椒2 號的香氣最弱。按照中華人民共和國國家標準《花椒》（GB/T30391-2013）,這5 種花椒的香氣均達到了“鮮花椒一級標準”。揮發(fā)油組成成分測定結(jié)果顯示，從5種花椒的揮發(fā)油中共分析鑒定出26種物質(zhì)，其中桉葉油醇、檸檬烯、α-松油醇、乙酸松油酯、β-月桂烯、檜烯、α-蒎烯、4-萜品醇、芳樟醇的含量都超過了10 mg·mL-1，可能是這5 種鮮花椒的揮發(fā)油中的主體香氣物質(zhì)；其中豐椒1 號的桉葉油醇、檜烯、α-松油醇、4-萜品醇、乙酸松油酯的含量均高于其他花椒，這表明豐椒1號的香味可能最為濃郁，但5種鮮花椒揮發(fā)油中各種香氣物質(zhì)的比例和組成差異較大，其香氣特征也應(yīng)有較大不同。

表4 花椒揮發(fā)油總含量與組成成分測定結(jié)果

2.3 花椒香氣特性

5 種鮮花椒香氣的定量評價分析（QDA）結(jié)果如圖1 所示，其中與香氣相關(guān)的屬性為刺鼻、甜香、生青、香樟氣味、松香、花香香氛、柑橘香和薄荷香。豐椒1號（花椒1）在除甜香外的所有其他屬性指標上均獲得了最高的分數(shù)，這說明豐椒1 號具有較優(yōu)的整體香氣。

圖1 5種鮮花椒香氣特性雷達圖

進一步使用主成分分析法（PCA）分析5 種鮮花椒樣品與其香氣感官特征屬性之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)（見圖2），5種鮮花椒樣品的香氣特征各有不同，其中豐椒4號（花椒4）與其他花椒樣品距離最遠，也與各香氣感官屬性距離最遠，說明其香氣特征與其他5 種鮮花椒樣品差距最大，香氣強度相對較弱。值得注意的是，相較于其他花椒樣品，豐椒1號（花椒1）距離薄荷香、刺鼻、柑橘香、香樟氣味、花香香氛和整體香氣強度的距離均是最短的，說明豐椒1 號具有最強的薄荷香、刺鼻、柑橘香、香樟氣味、花香香氛及整體香氣強度。

圖2 PCA分析5種鮮花椒及其香氣特性載荷圖

2.4 花椒麻味物質(zhì)（花椒酰胺）含量

花椒麻味物質(zhì)含量測定結(jié)果顯示（見表5），豐椒5號的麻味物質(zhì)總含量最高，豐椒2號和豐椒2號麻味物質(zhì)總含量最低；4 種主要麻味物質(zhì)（花椒酰胺）的含量在5種鮮花椒中均存在顯著差異，值得注意的是，豐椒5 號的4 種主要花椒酰胺含量均高于其他花椒樣品，說明豐椒5號的麻味最厚重。

表5 5種鮮花椒主要麻味物質(zhì)（花椒酰胺）含量測定結(jié)果

2.5 花椒麻感特性

5種鮮花椒麻感定量評價分析（QDA）結(jié)果如圖3所示，其中與麻感相關(guān)的屬性為麻木感、刺痛感、灼熱感、振動感、垂涎感和苦味，豐椒5號（花椒5）在除刺痛感外的所有其他屬性上均獲得了較高的分數(shù)，說明豐椒5號具有較優(yōu)的整體麻感。

圖3 5種鮮花椒麻感特性雷達圖

進一步使用主成分分析（PCA）法分析這5 種鮮花椒樣品與其麻味感官屬性之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)（見圖4），5 種鮮花椒的麻感特征各有不同，其中豐椒2 號（花椒2）與其他花椒樣品的距離最遠，也與各麻味感官屬性距離最遠，說明其麻感特征與其他花椒樣品差距最大。值得注意的是，相較于其他花椒樣品，豐椒5號（花椒5）距離垂涎感、麻木感、振動感、灼熱感的距離均是最短的，說明豐椒5號具有極強的垂涎感、麻木感、振動感、灼熱感。

圖4 PCA分析5種鮮花椒與其麻感特性載荷圖

2.6 花椒麻感-時間特征

對5種鮮花椒樣品的整體麻感強度進行了時間-強度（TI）方法的測定，結(jié)果如圖5所示。5種鮮花椒樣品具有相似的麻感-時間特性，均呈現(xiàn)麻感強度快速上升然后緩慢下降的趨勢特點，花椒入口后麻感一直快速持續(xù)上升，120～210 s 時麻感達到最強值，隨著時間進一步延長，麻感逐漸降低，麻感消失時間在780～900 s。

圖5 5種鮮花椒入口時間-整體麻感強度TI曲線圖

運用XLSTAT 軟件對5 種鮮花椒樣品的TI 曲線進行分析，并提取出6 個特征參數(shù)，分別為麻感最大強度（Imax）、最大麻感強度出現(xiàn)的時間（tmax）、最大麻感強度持續(xù)時間（tpl）、麻感總體持續(xù)時間（tT）、曲線下面積（ms,uc）、麻感感知增加率（rinc）。結(jié)果顯示（見表6），5 種鮮花椒樣品中，豐椒5 號（花椒5）的麻感最大、強度最高，且最大麻感強度出現(xiàn)的時間最晚，麻感總體持續(xù)時間最長。

表6 5種鮮花椒樣品TI曲線的特征參數(shù)

3 結(jié)論

5 種鮮花椒的顆粒大小和籽皮比均沒有顯著差異，豐椒1號中的礦物質(zhì)含量最高，豐椒1號和豐椒5號中的有機物質(zhì)含量最高，豐椒5 號中的不揮發(fā)性有機物質(zhì)含量最高。5 種鮮花椒樣品的香氣優(yōu)劣順序為豐椒1號＞豐椒3號、豐椒5號（但香氣特性有一定差異）＞豐椒2號（但其香氣特性與豐椒3號最近）＞豐椒4號（且其香氣特性與其他5種明顯不一樣）。5種鮮花椒樣品的麻味優(yōu)劣順序為豐椒5號＞豐椒1號和豐椒3號＞豐椒2號和豐椒4號，豐椒5號中主要麻味物質(zhì)的含量均高于其他花椒樣品。

從香氣和麻味這兩個指標綜合分析，豐都縣5 種鮮花椒樣品中，綜合品質(zhì)較好的為豐椒1 號和豐椒5號，其中豐椒1 號的香氣品質(zhì)最好，豐椒5 號的麻味品質(zhì)最好。