曾鈺涵，趙心宇，胡 玉，魏登琴，尚 靜，常小麗

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/四川省玉米大豆帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)中心，成都 611130）

大豆根腐?。╯oybean root rot）是由多種病原菌獨(dú)立或復(fù)合侵染，進(jìn)而引起大豆根部和莖部腐爛的世界性土傳病害，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-3]。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的大豆根腐病菌主要包括鐮孢菌Fusariumsp.、腐霉菌Pythiumsp.、疫霉菌Phytophthorasp.和絲核菌Rhizoctonia solani[3-5]。我國(guó)各大豆產(chǎn)區(qū)，因生境、栽培方式、大豆品種等差異，引起根腐病的病原菌種類不同，其中以尖鐮孢菌F. oxysporum和腐皮鐮孢菌F. solani為優(yōu)勢(shì)病原菌[6]。目前生產(chǎn)上大豆根腐病的防治主要采取土壤處理、種子包衣和藥劑拌種[7-9]等多種防治方法，但化學(xué)藥劑使用不當(dāng)常帶來農(nóng)藥殘留、土壤污染、病原菌抗藥性等問題。生物防治因其環(huán)境友好、無殘留、低風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要技術(shù)，是植物病害綠色防控的發(fā)展趨勢(shì)，應(yīng)用前景廣闊[10]。

國(guó)內(nèi)關(guān)于大豆根腐病的生物防治有許多報(bào)道，目前研究較多、應(yīng)用較廣泛的是木霉菌Trichoderma[11]、芽孢桿菌Bacillus[12]、假單胞桿菌Pseudomonas[13]和鏈霉菌Streptomyces[14]等。邵紅濤等[11]篩選獲得3株木霉菌能夠顯著降低土壤中病原尖孢鐮孢菌的種群豐度，且對(duì)大豆幼苗具有促生作用。郭榮君等[12]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌菌株B006和B010對(duì)大豆根腐病菌F. oxysporum和F. solani具有拮抗。

鏈霉菌屬Streptomyces是放線菌門Actinobacteria 中最大最高等的一個(gè)類群，其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，是植物根際最常見的微生物之一[14]。鏈霉菌具有多種功能，有些能夠產(chǎn)生抗生素與植物生長(zhǎng)激素類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物對(duì)于生物與非生物逆境的抵御能力，如酸性瘡痂鏈霉菌Streptomyces acidiscabies[15]；有些能夠產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)、胞外水解酶，抑制多種病原菌的蛋白質(zhì)和核苷酸合成，裂解病原真菌細(xì)胞壁，從而阻礙病原真菌生長(zhǎng)[16-17]。由于鏈霉菌代謝物對(duì)病原菌特異性較強(qiáng)，對(duì)人畜無毒害作用，對(duì)環(huán)境無殘留、無污染等優(yōu)勢(shì)，近年來在土傳病害生物防治研究中引起廣泛關(guān)注，已被報(bào)道用于防治黃瓜枯萎病[17]、水稻白葉枯病[18]和香蕉枯萎病[19]等。弗吉尼亞鏈霉菌Streptomyces virginiae是一種土壤習(xí)居菌，多來源于森林土壤或植物根際，能夠產(chǎn)生多種次生代謝物、活性物質(zhì)，特別是產(chǎn)生抗生物維吉尼亞霉素virginiamycin，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用作動(dòng)物飼料添加劑，以促進(jìn)牲畜生長(zhǎng)和防止細(xì)菌感染，也能夠有效降解水體或土壤中的甾體化合物污染[20-21]，但關(guān)于該鏈霉菌在植物病害防治中的研究尚未見報(bào)道。

本研究基于課題組前期從四川帶狀套作大豆根際分離獲得的一株具有生防潛力的細(xì)菌菌株IRHB 47，擬進(jìn)一步明確其抑菌活性、根腐病防效、分類地位、生物學(xué)特性及環(huán)境適應(yīng)性，以期為大豆根腐病防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：大豆根際細(xì)菌菌株IRHB 47 分離自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安教學(xué)農(nóng)場(chǎng)的玉米大豆帶狀套作田，栽培方式為周年玉米與大豆輪作，根腐病發(fā)生率為5%～20%；試驗(yàn)所用14 種常見農(nóng)作物病原菌（包括5 種大豆根腐病常見致病菌）的詳細(xì)信息見表1，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 本研究的14種常見農(nóng)作物病害病原菌Table 1 Pathogenic fungi of 14 agricultural crops used in this study

供試大豆：南豆12，前期鑒定為鐮孢菌根腐病中感品種[5]，用于安全性和盆栽防效試驗(yàn)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya agar，1/2 TSA）：胰蛋白胨7.5 g、大豆胨2.5 g、氯化鈉2.5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL；蛋白酶測(cè)定培養(yǎng)基：脫脂奶粉1.2 g、瓊脂1.0 g，水100 mL；肉膏蛋白胨（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、酵母膏1 g、水1 000 mL；酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基：牛肉浸粉0.3 g、酪蛋白1.0 g、NaCl 0.5 g、NaH2PO40.2 g、溴百里酚藍(lán)0.005 g、瓊脂1.5 g、水100 mL；幾丁質(zhì)酶活性培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.2 g、MgSO40.05 g、KH2PO40.1 g、NaCl 0.05 g、膠體幾丁質(zhì)3.0 g、剛果紅0.02 g、瓊脂1.5 g、水100 mL；纖維素酶鑒定培養(yǎng)基：KH2PO40.1 g、酵母浸粉0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g、CMC-Na 1.0 g、MgSO40.02 g、剛果紅0.02 g、瓊脂1.5 g、水100 mL；固氮作用測(cè)定培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g、MgSO40.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO?5.0 g、甘露醇10.0 g、CaSO40.1 g、瓊脂15.0 g；解磷作用測(cè)定培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO40.3 g、MnSO40.03 g、K2SO40.3 g、FeSO40.03 g、Ca3(PO4)25.0 g、瓊脂15.0 g；高粱粒培養(yǎng)基：將高粱粒煮至七成熟后濾水、取適量放入150 mL錐形瓶中（總體積的1/3），用封口膜和牛皮紙封口；以上培養(yǎng)基均在121 ℃，高壓滅菌30 min后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 IRHB47菌株的拮抗能力測(cè)定

采用平板對(duì)峙法測(cè)定IRHB 47對(duì)5種大豆根腐病常見病原菌及9種常見植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)的拮抗作用。各待測(cè)病原菌在PDA 平板上活化培養(yǎng)3～5 d，打菌餅（直徑5 mm）并接種于含有1/2 TSA固體培養(yǎng)基的平板中心。將LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)的IRHB47 菌液，在距平板中心點(diǎn)左右各4 cm 處平行劃線，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)3～7 d。以在1/2 TSA培養(yǎng)基平板上僅接種各病原菌作為空白對(duì)照。各處理3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。待空白對(duì)照組各病原菌菌絲長(zhǎng)滿平板時(shí)，測(cè)量病原真菌直徑，并參照下列公式計(jì)算相對(duì)抑制率。

1.2.2 IRHB47對(duì)大豆幼苗的安全性測(cè)定

選取健康、大小一致的南豆12種子，依次用30%H2O2溶液處理10 min，無菌水沖洗3次，滅菌濾紙擦凈種子表面殘留水分，然后種臍朝下擺放裝有滅菌蛭石的磁盤中，其上覆蓋2 cm 厚的滅菌蛭石，待保濕催芽。用接種環(huán)挑取LB 斜面上保存的IRHB47菌落，置于150 mL LB 液體培養(yǎng)基150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h；隨后5 000 r/min 離心10 min，棄上清，收集菌體；最后，用50～120 mL PBS 緩沖液沖洗菌體，獲得OD600值為0.3、0.5、0.8 和1.0 的IRHB47 菌懸液，待用。

設(shè)置OD600值為0.3、0.5、0.3～0.8、0.8 和1.0 共5個(gè)處理，以PBS 緩沖液浸種為對(duì)照（CK），分別以不同OD600的菌懸液連續(xù)3 d澆灌在滅菌蛭石中催芽的大豆種子，其中，OD600=0.3～0.8處理采用菌懸液梯度澆灌處理，即為第1 天OD600=0.3，第2 天OD600=0.5，第3天OD600=0.8。每個(gè)處理30粒種子，每天各處理澆灌菌懸液30 mL。各處理于28 ℃、16 h 光/8 h 暗條件下培養(yǎng)3 d，觀察大豆出芽及健康情況，參照下列公式計(jì)算各處理發(fā)芽率。

取上述各處理出芽狀況一致的種子，移栽入裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆（直徑230 mm，高210 mm）中，每盆2 株，每處理20 株，隨機(jī)澆灌各處理對(duì)應(yīng)濃度菌懸液，每株10 mL。盆栽苗置于28 ℃、16 h光/8 h暗的條件下培養(yǎng)14 d后，移出幼苗洗凈根部，吸干水分，測(cè)量各處理大豆幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)（株高、莖粗、葉面積、地上干重、地下干重），明確各菌懸液處理對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)的影響。

1.2.3 IRHB 47 菌懸液對(duì)大豆根腐病的盆栽防效測(cè)定

參照Chang X.等[6]方法稍作修改，將120 g 高粱粒煮熟后裝入250 mL 的三角瓶，高壓蒸汽滅菌2次，待用。將尖孢鐮孢在28 ℃下于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，取6 個(gè)菌餅接種到滅菌高粱粒培養(yǎng)基中，于28 ℃暗培養(yǎng)7～10 d，待高粱粒表面長(zhǎng)滿菌絲體。將帶菌高粱粒轉(zhuǎn)置25 ℃烘箱中烘干12 h，后經(jīng)粉碎機(jī)制成粉末擴(kuò)繁體。取1 g粉末擴(kuò)繁體接入9 mL無菌水，于28 ℃、150 r/min條件下振蕩30 min，逐級(jí)梯度稀釋至10-4。吸取100 μL懸液涂布于PDA平板，計(jì)算不同梯度擴(kuò)繁體的孢子量，以每g 擴(kuò)繁體中包含的孢子數(shù)量約為3×105用于后續(xù)接種。隨后，將帶菌高粱擴(kuò)繁體與營(yíng)養(yǎng)土以15∶100質(zhì)量比混合，制成病原菌接種土壤。參照1.2.2的方法，以安全性測(cè)試中最適菌懸液濃度（OD600=0.5）處理大豆，試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)處理：①F.o，正常催芽大豆播種于尖孢鐮孢菌接菌的培養(yǎng)基質(zhì)中；②IRHB 47+F.o，IRHB 47 預(yù)處理后的催芽大豆移栽入尖孢鐮孢菌接菌培養(yǎng)基質(zhì)中，用于檢測(cè)生防菌對(duì)大豆植株的預(yù)防作用；③F.o+IRHB 47，正常催芽大豆播種于尖孢鐮孢菌接菌的培養(yǎng)基質(zhì)，生長(zhǎng)1 d 后，每株幼苗補(bǔ)充10 mL IRHB 47 菌懸液，用于檢測(cè)生防菌對(duì)大豆植株的治療作用。

所有植株置于人工氣候培養(yǎng)箱，于28 ℃、16 h光/8 h暗的條件培養(yǎng)。每個(gè)處理10盆，每盆2株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。接種2 周后，測(cè)定不同處理大豆生長(zhǎng)指標(biāo)（株高、莖粗、葉面積、地上/地下干重等），參照Chang X.等[6]的方法調(diào)查大豆根腐病發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)、死亡率和防治效果。

1.2.4 IRHB 47的分子鑒定

挑取IRHB 47 菌株的單菌落，置于裝有100 μL PrepMan Μltra 的離心管中，渦旋振蕩混勻30 s 后，置于100 ℃水浴10 min，12 000 r/min 離心3 min；取10 μL上清液，加入490 μL ddH2O混勻，用作PCR擴(kuò)增的模板。通過擴(kuò)增16S rRNA基因序列對(duì)IRHB 47進(jìn)行分子鑒定，擴(kuò)增引物為27F（AGAGTTTGATC CTGGCTCAG）和1492R（CTACGGCTACCTTGTTAC GA）[22]。PCR 擴(kuò)增體系包括菌液模板12.5 μL，引物各0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O2至25.0 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)，72 ℃保存10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的片段大小，隨后送往上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序所得序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLASTn同源性比對(duì)，下載序列相似性較高的參考序列，并采用ClusterW 進(jìn)行序列編輯，最后通過MEGA 7.0軟件中的鄰位法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定IRHB 47的分類地位。

1.2.5 IRHB 47菌株形態(tài)及生長(zhǎng)特性

挑取實(shí)驗(yàn)室保存IRHB 47 菌株接種于NA 固體培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落大小、形態(tài)、色澤等特征，逐日記錄菌落生長(zhǎng)情況，并參照方中達(dá)[23]方法采用結(jié)晶紫草酸銨染色法進(jìn)行革蘭氏染色。取已活化的IRHB47 菌懸液10 μL 接種于含150 mL LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于150 r/min，28 ℃下振蕩培養(yǎng)，于接種后0～96 h 取菌懸液，以無菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定OD600值，根據(jù)測(cè)定數(shù)值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 IRHB47菌株生物學(xué)特性測(cè)定

固氮作用測(cè)定：采用稀釋劃線法將IRHB 47 接種于固氮作用測(cè)定培養(yǎng)基上，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)，若菌株能夠在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，則將新長(zhǎng)出的菌落在新的培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)3次，若菌株仍能生長(zhǎng)，表明其具有固氮作用。

溶解磷作用、蛋白酶、酪蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶測(cè)定：將室內(nèi)保存的IRHB 47菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)，獲得OD600=0.3 的菌懸液，待用。將直徑5 mm 的濾紙片輕放在各指標(biāo)測(cè)定培養(yǎng)基中心，使其緊貼培養(yǎng)基表面。取0.5 μL OD600=0.3 的菌懸液浸濕濾紙片，將IRHB 47菌株接種于各測(cè)定指標(biāo)相應(yīng)培養(yǎng)基，在28 ℃下黑暗培養(yǎng)3～7 d，通過觀察透明圈的有無，判斷是否具有水解酶產(chǎn)生或解磷作用。

1.2.7 IRHB 47菌株的環(huán)境耐受性檢測(cè)

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定不同LB 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)水平、NaCl 濃度、初始pH對(duì)IRHB 47菌落生長(zhǎng)的影響。挑取IRHB 47 單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中富集，待OD600=0.2～0.3 時(shí)，取10 μL 菌液，分別接種于不同處理下的LB無菌液體培養(yǎng)基中。以LB為對(duì)照，設(shè)置0%、6.25%、12.5%、25%、50%和100%共6 個(gè)LB 營(yíng)養(yǎng)水平；設(shè)置0%、1%、2%、4%、6%、8%和10%共7 個(gè)NaCl 濃度；設(shè)置5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0 共6 個(gè)pH 水平。每個(gè)處理5 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次。所有處理均在28 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)36 h后，測(cè)定菌液OD600值，明確其環(huán)境耐受性。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 進(jìn)行整理與編輯，采用DPS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.0作圖，其中顯著性分析采用鄧肯氏（Duncan's）多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 IRHB47 菌株對(duì)大豆根腐病菌和其他主要農(nóng)作物病原菌的拮抗效果

平板對(duì)峙結(jié)果如圖1所示，IRHB 47對(duì)5個(gè)大豆根腐病致病菌和9個(gè)種常見病原菌菌絲生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用（圖1）。其中，IRHB47菌株對(duì)大豆根腐病強(qiáng)致病菌尖孢鐮孢菌F. oxysporum的菌絲生長(zhǎng)抑制率為51.43%，對(duì)其余4種根腐病致病菌的抑制率達(dá)51.04%～72.40%；對(duì)草莓灰霉病灰葡萄孢菌Botrytis cinerea和大豆白絹病齊小菌核菌Sel-erotium rolfsii的抑制率最高，分別達(dá)98.80% 和88.76%，但對(duì)柑橘褐斑病交鏈格孢菌Alternaria alternate(Citrus)的抑菌率較差，為38.58%（圖2）。

圖1 IRHB 47與14種主要農(nóng)作物病原菌的平板對(duì)峙結(jié)果Figure 1 Plate confront culture between IRHB47 and 14 agricultural pathogen fungi

圖2 IRHB 47對(duì)14種主要農(nóng)作物病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率Figure 2 Inhibition rate of IRHB 47 on 14 agricultural pathogen fungi

2.2 IRHB 47菌懸液對(duì)大豆幼苗的安全性測(cè)定

采用不同IRHB 47菌懸液濃度對(duì)表面消毒的大豆種子連續(xù)澆灌3 d 催芽，測(cè)定其安全性，結(jié)果表明，與對(duì)照組（CK）相比，不同菌懸液澆灌處理對(duì)種子發(fā)芽率無顯著影響，發(fā)芽率為77.78%～83.33%（表2）。各處理組的大豆幼苗生長(zhǎng)14 d 后，與對(duì)照組相比，OD600為0.5和0.3～0.8，2個(gè)處理組對(duì)大豆幼苗的株高、根長(zhǎng)、葉面積、地上干重、地下干重?zé)o顯著影響（P＜0.05）（表2），但OD600為0.3的處理組顯著降低了大豆幼苗的葉面積、地上干重和地下干重，而OD600為0.8 和1.0 的處理組則抑制了大豆幼苗的株高和根長(zhǎng)。結(jié)果表明，采用IRHB 47菌懸液OD600為0.5和0.3～0.8的2種澆灌處理方式對(duì)大豆發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)安全，其中以O(shè)D600=0.5處理為最佳。

表2 不同IRHB 47菌懸液處理后大豆發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)Table 2 Germination rate and growth index of soybean seedlings after different treats of IRHB47 suspension

2.3 IRHB 47 菌懸液對(duì)大豆根腐病病情及生長(zhǎng)的影響

盆栽試驗(yàn)測(cè)定IRHB 47 對(duì)大豆根腐病的防效，結(jié)果如圖3 和表3 所示，與尖孢鐮孢菌F. oxysporum單獨(dú)接種（F.o）相比，生防菌IRHB 47 無論預(yù)處理（IRHB 47+F.o）還是在病原菌接種后再處理（F.o+IRHB 47），均影響了大豆幼苗生長(zhǎng)及根系發(fā)育，降低了大豆根腐病的病情指數(shù)與死亡率，2個(gè)IRHB 47處理組的防效分別為40.90%與44.45%。與尖孢鐮孢菌接種（F.o）處理相比，2 個(gè)IRHB 47 處理組病情指數(shù)分別為48.00%和45.45%，均顯著降低，表明IRHB 47 的預(yù)防與治療效果顯著；植株死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，根腐病尖孢鐮孢菌接種處理死亡率為40%；而IRHB 47+F.o 和F.o+IRHB 47 這2 個(gè)處理組中植株死亡率分別降至12%和10%。綜上表明，IRHB 47生防處理對(duì)根腐病具有預(yù)防和治療雙重效果，且治療效果更佳。

圖3 不同IRHB 47處理14 d時(shí)大豆幼苗生長(zhǎng)情況Figure 3 Soybean seedlings at 14 days after differenttreatments with IRHB47

表3 IRHB 47菌懸液對(duì)大豆根腐病的盆栽試驗(yàn)防效Table 3 Effects of IRHB47 suspension on soybean root rot in pot trials

表4 IRHB 47菌株代謝產(chǎn)物分析Table 4 Analysis of metabolites of IRHB 47 strain

對(duì)3 個(gè)處理的大豆幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，與根腐病尖孢鐮孢菌接種處理（F.o）相比，生防菌IRHB 47 預(yù)防處理和治療處理組的大豆幼苗株高、根長(zhǎng)、葉面積、地上干重和地下干重均顯著提高。結(jié)果表明，IRHB 47 不僅對(duì)根腐病預(yù)防治療效果顯著，而且有效緩解了根腐病侵染對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響。

2.4 IRHB47菌株的鑒定

對(duì)菌株IRHB 47 的16S rDNA序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、純化、測(cè)序后，在NCBI中經(jīng)BLASTn比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，IRHB 47 與弗吉尼亞鏈霉菌Streptomyces virginiaeSZN124序列同源性最高，相似度達(dá)99%以上。從NCBI中選擇與菌株IRHB 47同屬的9株菌、不同屬的6 株菌建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株IRHB 47 與MW391663.1Streptomyces virginiaeSZN124 聚在一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，因此初步鑒定菌株IRHB 47為弗吉尼亞鏈霉菌Streptomyces virginiae（圖4）。

圖4 基于16s rDNA基因序列構(gòu)建的IRHB 47系統(tǒng)進(jìn)化聚類樹Figure 4 Phylogenetic tree of IRHB 47 based on 16s rDNA gene sequence

2.5 IRHB 47菌株的形態(tài)特征及生物學(xué)特性分析

經(jīng)在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)并獲得單菌落，發(fā)現(xiàn)IRHB 47 的菌落邊緣整齊、質(zhì)地致密、不透明，表面堅(jiān)實(shí)、干燥、有皺縮，菌落較小且不蔓延。同時(shí)，該菌可產(chǎn)生黃色色素，滲透入培養(yǎng)基內(nèi)（圖5-A）。革蘭氏染色反應(yīng)顯示其為革蘭氏陽性菌（圖5-B）。在LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗培養(yǎng)條件下，菌株IRHB 47 菌液濃度從第6 小時(shí)開始增加，12～24 h 為生長(zhǎng)高峰期，在72 h 后進(jìn)入生長(zhǎng)平緩期，OD600值增長(zhǎng)明顯減慢，84 h后進(jìn)入衰亡期（圖5-C）。

圖5 菌株IRHB 47的菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果及生長(zhǎng)曲線Figure 5 Colonial morphological characteristics，gram staining reaction and growth curve of the strain IRHB 47

測(cè)定菌株IRHB 47 對(duì)pH、LB 和NaCl 不同脅迫處理的耐受性，結(jié)果顯示，菌株IRHB 47 對(duì)酸、堿的耐受性良好，以pH=7～8 為最適生長(zhǎng)pH（圖6-A）。IRHB 47對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求較低，在LB液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)含量達(dá)到6.25%時(shí)均可生長(zhǎng)（圖6-B）。對(duì)NaCl脅迫的耐受性較差，高鹽濃度下不能生長(zhǎng)，僅在含有低于4% NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（圖6-C）。結(jié)果表明，菌株IRHB 47 對(duì)低營(yíng)養(yǎng)和pH 環(huán)境耐受性較好，不耐高鹽脅迫（圖6-D）。

圖6 Streptomyces virginiae IRHB 47 對(duì)不同 pH、LB、NaCl脅迫處理的耐受性及雷達(dá)Figure 6 Stress tolerance of Streptomyces virginiae IRHB 47 to different pH, LB, NaCl treatments and radar charts

對(duì)IRHB 47 菌株代謝產(chǎn)物分析，結(jié)果如圖7 所示，5 d 后觀察發(fā)現(xiàn)IRHB 47 菌株在酪蛋白培養(yǎng)基、蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)生清晰的透明降解圈，表明IRHB 47菌株能夠產(chǎn)生酪蛋白酶和蛋白酶。但其在無氮、含磷培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)，說明該菌株不具備固氮、解磷作用；在幾丁質(zhì)酶、纖維素酶培養(yǎng)基上沒有產(chǎn)生降解圈，說明該菌株不能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶或產(chǎn)美能力較弱（表3）。

圖7 IRHB 47產(chǎn)生蛋白酶與酪蛋白酶Figure 7 IRHB 47 produces protease and caspase

3 討論與結(jié)論

利用有益微生物對(duì)病原菌的營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)，抑菌殺菌活性，以及誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等作用，降低病原菌數(shù)量或減弱病原菌致病活力，來減少土傳病害發(fā)生，是近年來土傳病害綠色生態(tài)防控的熱點(diǎn)[24-25]。本試驗(yàn)基于前期套作大豆根際獲得一株具有根腐病生防潛力的菌株IRHB 47，進(jìn)一步明確了IRHB 47 對(duì)5 種大豆根腐病病原菌和9 種其余農(nóng)作物病原菌均表現(xiàn)良好抑菌作用，抑菌譜廣；IRHB 47種子處理和接種后灌根處理均顯著降低了南豆12根腐病的病情指數(shù)和死亡率，防控率達(dá)40.9%以上；經(jīng)形態(tài)及分子鑒定，該菌株為弗吉尼亞鏈霉菌Streptomyces virginiae，具有耐低營(yíng)養(yǎng)脅迫和酸堿的特性，且能產(chǎn)生蛋白酶和酪蛋白酶，誘導(dǎo)植物抗性。前人研究已表明，鏈霉菌是防治植物病害的重要生防資源[14]。已鑒定鏈霉菌如毒淀粉酶產(chǎn)色鏈霉S.diastatochramogenes[16,26]、白刺鏈霉菌S. albospinus[27]、楊浦鏈霉菌S. yangpuensis[28]等被用于水稻白葉枯菌、石斛鐮刀菌根腐病、草莓根腐病、苦瓜枯萎病菌等病害的防治。本研究從套作大豆根際篩選獲得的IRHB 47，是一株弗吉尼亞鏈霉菌，對(duì)大豆根腐病尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、亞洲鐮孢菌、禾谷鐮孢菌及藤倉(cāng)鐮孢菌的菌絲抑制作用明顯；同時(shí)，對(duì)大豆白絹病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、柑橘炭疽病菌等其他9中常見植物病原菌抑菌效果顯著。盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株IRHB 47 無論用于播種前的種子處理還是播種后接種病原菌的灌溉處理均能有效降低根腐病的病情指數(shù)和死亡率，表明該菌株對(duì)大豆根腐病兼具預(yù)防和治療作用，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用潛力。

此外，有些生防鏈霉菌兼具促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。如C. Dimkpa 等[15]分離獲得了產(chǎn)異羥肟酸型嗜鐵素的酸性瘡痂鏈霉菌S. acidiscabies，該菌能夠促進(jìn)鎳離子脅迫下豇豆的生長(zhǎng)。A. Z. Htwe 等[29]發(fā)現(xiàn)灰黃鏈霉菌Streptomyces griseoflavusP4 能刺激大豆根瘤形成，提高其固氮作用，促進(jìn)大豆生長(zhǎng)。與前人研究存在差異，本試驗(yàn)篩選獲得弗吉尼亞鏈霉菌Streptomyces virginiaeIRHB 47 浸泡處理大豆種子后，對(duì)大豆的發(fā)芽率無顯著影響，但I(xiàn)RHB 47低濃度（OD600=0.3）和高濃度（OD600＞0.8）菌懸液處理不同程度影響了株高、根長(zhǎng)、葉面積、地上和地下生物量，表明該菌株對(duì)大豆幼苗無明顯促生作用，不是根際促生菌。

本研究鑒定獲得的弗吉尼亞鏈霉菌IRHB47良好的大豆根腐病防效，但其抑菌拮抗活性成分，以及在大豆根際根內(nèi)定殖影響根腐病發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，有必要進(jìn)一步解析IRHB 47 菌株發(fā)酵液抑菌拮抗活性成分，研究其生防機(jī)制，并開展田間防效驗(yàn)證及應(yīng)用研究。