王佳琦，王 欣，鄧小梅，吳藹民

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

花櫚木Ormosiahenryi為豆科Leguminosae 紅豆屬Ormosia重要木本藥用植物，主要產(chǎn)于東南亞和南美洲，屬于國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，在野外處于中度瀕危狀態(tài)[1]?；澳境Ｒ愿?、根皮及莖、葉入藥?！度珖?guó)中草藥匯編》記述，其性味歸經(jīng)為辛、溫，有毒，具有活血化瘀、祛風(fēng)、消腫之功。研究發(fā)現(xiàn)：紅豆屬植物含有生物堿、黃酮、苯丙素、萜類和揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，其中萜類化合物是一類重要的活性物質(zhì)[2]。迄今為止，已從紅豆屬不同植物中發(fā)現(xiàn)大量的萜類化合物，如丁香酚、苯乙醇、欖香素和棕櫚酸等化合物，并發(fā)現(xiàn)多種物質(zhì)具有消炎、抗氧化、抗菌的作用[3-4]。萜類物質(zhì)是多種藥用植物的主要活性化合物，并且是天然化合物中規(guī)模最大種類最多的一類物質(zhì)[5-6]，了解花櫚木中萜類物質(zhì)能夠提高對(duì)花櫚木的藥用認(rèn)知。

植物萜類化合物主要由甲基赤蘚糖磷酸酯 (MEP） 途徑或甲羥戊酸 (MVA） 途徑產(chǎn)生的二甲基烯丙基二磷酸酯 (DMAPP） 和異戊烯基二磷酸酯 (IPP） 生成[7]。萜類化合物分子骨架是基于異戊二烯或其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸C5 單元構(gòu)成的，根據(jù)骨架碳鏈長(zhǎng)度的不同，主要分為半萜、單萜、二萜、三萜等幾種類型的萜類化合物[8]。MEP 途徑僅發(fā)生在質(zhì)體中，MVA 途徑卻分布在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體之間[9]。IPP 與DMAPP 通過戊烯基轉(zhuǎn)移酶的催化，縮合產(chǎn)生萜類化合物前體物質(zhì)香葉酰二磷酸(GPP）、法呢基二磷酸 (FPP） 和香葉基香葉基焦磷酸 (GGPP）。其中GPP 是合成單萜類化合物前體物質(zhì)，GGPP 是合成二萜前體物質(zhì)，F(xiàn)PP 則是合成倍半萜和三萜化合物的前體物質(zhì)[10-11]。隨后通過萜類合成酶(TPS） 和氧角鯊烯環(huán)化酶 (OSCs） 催化前體形成不同種萜類化合物，這2 種酶的多樣性使得萜類化合物的種類有很多[12-13]。

TPS 基因家族主要分為7 個(gè)亞家族，分別命名為TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g 和TPS-h。其中TPS-a、TPS-b和TPS-g 屬于被子植物特有分支，這3 個(gè)分支完全由專門的單萜、倍半萜或二萜生物合成基因組成，主要在植物生態(tài)相互作用中起作用。TPS-d 是裸子植物特異性亞家族，主要包含特異性代謝的裸子植物TPSs[14]。TPS-c 和TPS-e/f 是被子植物與裸子植物所共有的亞家族，TPS-c 分支成員只包含“DXDD”序類，是單功能柯巴基焦磷酸合酶 (CPS）。與TPS-c 類似，TPS-e/f 分支成員只包含“DDXXD”序類，是單功能的貝殼杉烯合成酶 (KS）[15-16]。植物OSC 家族是一個(gè)超基因家族，主要包含達(dá)瑪烯二醇合成酶 (DS）[17]、β-香樹脂醇合成酶 (β-AS）[18]、α 香樹脂醇合成酶 (α-AS）[19]和羽扇豆醇合成酶 (LUS）[20]。近些年來對(duì)萜類的研究越來越廣泛，但是豆科植物花櫚木中的萜類化合物種類以及生物合成情況卻未見報(bào)道。

本研究利用代謝組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)首次對(duì)花櫚木中的萜類物質(zhì)進(jìn)行鑒定，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，利用生物信息學(xué)方法分析花櫚木中萜類的主要合成情況，分析相關(guān)基因在花櫚木不同組織部位中的表達(dá)水平，為研究花櫚木的藥用活性物質(zhì)以及花櫚木中萜類的代謝調(diào)控途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年4 月23 日于華南農(nóng)業(yè)大學(xué) (中國(guó)廣州） 苗圃中采集3 年生花櫚木新鮮的根、莖、樹皮、老葉和幼葉5 個(gè)組織部位樣品，每樣品重復(fù)4 次，純凈水沖洗干凈，立即在液氮中冷凍，并分成2 個(gè)部分，一部分立即在-80 ℃下保存用于總RNA 提取，另一部分在真空下冷凍干燥用于代謝物提取。

1.2 代謝組測(cè)定

將采摘的根、莖、樹皮、老葉和幼葉樣品凍干磨粉后，精確稱量各個(gè)樣品粉末0.5 g，分別用5 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的HPLC 級(jí)甲醇提取過夜，其中內(nèi)標(biāo)為1 μmol·L-1的白楊素。4 ℃下12 000g離心30 min，取上清液裝入樣品瓶中，進(jìn)行超高效液相色譜質(zhì)譜 (UHPLC Q-TOF/MS） 分析。為了分離花櫚木不同器官的代謝物，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(Q Exactive Plus）進(jìn)行測(cè)定。為保證平行試驗(yàn)每個(gè)樣品平行4 針。將1 μL 樣品進(jìn)入2.1 mm×100.0 mm、1.9 μm 粒徑的Hypersil GOLD 色譜柱，柱溫30℃，流速0.3 mL·min-1。流動(dòng)相A 為體積分?jǐn)?shù)0.1%的HPLC 級(jí)甲酸，流動(dòng)相B 是HPLC 級(jí)乙腈。梯度洗脫：0～2.0 min，0～10%流動(dòng)相B；2.0～10.0 min，10%～55%流動(dòng)相B；10.0～10.1 min，55%～80%流動(dòng)相B；10.1～13.0 min，80%流動(dòng)相B；13.0～14.0 min，80%～95%流動(dòng)相B；14.0～18.0 min，95%～10%流動(dòng)相B。全掃描質(zhì)譜和數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)掃描(dd-MS2）的分辨率分別設(shè)置為70 000 和17 500，在正負(fù)離子模式下均使用加熱的ESI 源。在正負(fù)模式下，噴霧電壓被設(shè)定為3.5 和3.2 kV。毛細(xì)管溫度被設(shè)定為320℃，輔助氣體加熱器的溫度被設(shè)定為350 ℃。

使用Compound Discoverer 3.2 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，然后根據(jù)綜合分子量、質(zhì)荷比 (m/z）、保留時(shí)間(RT） 和二級(jí)光譜，與代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)mzCloud、mzVault 和Chemspider 進(jìn)行對(duì)比。

1.3 RNA 提取與文庫(kù)構(gòu)建

總RNA 由RNAprep Pure Assay 試劑盒提取，RNA 質(zhì)量用NanoPhotometer?分光光度計(jì)測(cè)定。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，樣品被送到百邁客生物技術(shù)公司。庫(kù)的制備在Illumina Hiseq 2000 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，并產(chǎn)生成對(duì)的讀長(zhǎng) (reads）。首先，使用內(nèi)部的perl 腳本處理fastq 原始數(shù)據(jù)，以去除含適配器的讀數(shù)、含ploy-N 的讀數(shù)和低質(zhì)量讀數(shù)。經(jīng)過Trinity 軟件組裝獲得一個(gè)非冗余的基因數(shù)據(jù)庫(kù) (universal gene,unigene），并進(jìn)一步使用HMMER軟件與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得unigene 的注釋信息。

1.4 差異基因和基因功能分析

以常用的基因表達(dá)水平估算方法中每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片斷(fragments per kilobase million，F(xiàn)PKM） 值進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。使用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR） ≤0.01 和 |log2CF| ≥2(CF為差異倍數(shù), fold change） 的閾值，寫入R 中的DESeq 2 包，對(duì)花櫚木不同部位樣本進(jìn)行差異基因表達(dá)分析[21]。使用TBtools 構(gòu)建差異顯著基因 (DEGs） 的熱圖，京都基因和基因組百科全書(KEGG）對(duì)DEGs 的富集分析是使用R 中的Cluster Profiler 包進(jìn)行的，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(WGCNA）是在R 包WGCNA 的幫助下進(jìn)行的，并使用相關(guān)P值建立統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組數(shù)據(jù)分析

根據(jù)總離子流圖所得到的化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量、出峰時(shí)間、二級(jí)碎片信息，與mzCloud 和mzVault 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共鑒定出15 種萜類化合物(表1）。為了分析花櫚木不同組織部位中萜類化合物的分布情況，對(duì)5 個(gè)部位的萜類化合物的相對(duì)含量進(jìn)行了熱圖分析(圖1A），發(fā)現(xiàn)不同部位的萜類相對(duì)含量差別較大。能明顯看出幼葉、老葉與根中萜類相對(duì)含量較高，與之相反的是莖與皮中相對(duì)含量比較少，并發(fā)現(xiàn)甘草次酸 (enoxolone）、齊墩果酸 (oleanolic acid）、芳樟醇 (linalool） 和二氫丹參酮Ⅰ (dihydrotanshinone Ⅰ） 等具有抗氧化、抗炎免疫調(diào)節(jié)、抗心血管疾病和鎮(zhèn)定作用的萜類化合物[22]，表明萜類化合物可能是花櫚木中主要的藥用活性物質(zhì)。

圖1 花櫚木不同組織中萜類化合物積累和TPS、OSC 基因表達(dá)量的熱圖Figure 1 Heat map of terpenoid accumulation and TPS and OSC gene expression in different tissues of O.henryi

表1 花櫚木中萜類化合物質(zhì)譜信息Table 1 Mass spectral information of terpenoids in O.henryi

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

為了篩選花櫚木中與萜類生物合成相關(guān)的潛在基因，利用RNA-seq 對(duì)花櫚木5 個(gè)部位的所有轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。使用Illumina Hiseq 2000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，在去除低質(zhì)量和短的讀數(shù)后，總共獲得了1.9～2.4 M 的高質(zhì)量待分析數(shù)據(jù)，共獲得96 302 個(gè)最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，并與NR、eggNOG、TrEMBL、Pfam、SwissProt、KEGG、COG、KOG 及GO 等9 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定編碼序類有47 809 條，并對(duì)其進(jìn)行功能注釋。計(jì)算出FPKM 值，代表每個(gè)基因的表達(dá)水平。對(duì)花櫚木5 個(gè)部位的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行差異基因分析，共得到13 840 個(gè)差異顯著基因 (DEGs）。在差異基因分析中發(fā)現(xiàn)，與其他3 個(gè)部位樣本相比，葉的特異差異基因更多，莖中的特異差異基因最少(圖2）。

圖2 花櫚木5 個(gè)組織中的差異基因韋恩圖Figure 2 Venn diagram of differential genes in five organs of O.henryi

2.3 參與萜類生物合成相關(guān)基因表達(dá)分析

根據(jù)其他物種萜類生物合成信息，花櫚木萜類物質(zhì)合成途徑大致可分為萜類前體物質(zhì)的合成、萜骨架的合成和后修飾3 個(gè)階段，其中萜類化合物的前體GPP、FPP 和GGPP 主要來自植物的MVA 和MEP 途徑。MVA 通路共鑒定到8 個(gè)基因，包括2 個(gè)乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶 (AACT,c68943.graph_c2,c73242.graph_c0）、2 個(gè)羥甲基戊二酰輔酶A 合成酶 (HMGS,c57495.graph_c0,c70166.graph_c1）、1 個(gè)羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶 (HMGR,c68938.graph_c1）、1 個(gè)甲羥戊酸激酶 (MK,c70988.graph_c0）、1 個(gè)磷酸甲羥戊酸激酶 (PMK,c71400.graph_c0）、1 個(gè)甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶 (MVD,c76163.graph_c2）；MEP通路共鑒定到10 個(gè)基因，包括4 個(gè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS,c62607.graph_c0,c70494.graph_c2,c75298.graph_c5,c75577.graph_c0）、1 個(gè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶 (DXR,c71705.graph_c2），1 個(gè)4-焦磷酸胞苷-2-甲基-D-赤蘚醇激酶 (CMK,c73279.graph_c4）、1 個(gè)2-甲基-D-赤蘚醇-2,4-環(huán)焦磷酸合酶(MDS,c62387.graph_c0）、1 個(gè)羥甲基丁烯基-4-焦磷酸合酶 (HDS,c56719.graph_c0）、2 個(gè)羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶 (HDR,c29394.graph_c0,c70095.graph_c0）。為了更直觀地比較萜類生物合成途徑主要基因在不同組織中的表達(dá)情況，采用FPKM 值對(duì)花櫚木不同組織部位的合成途徑基因表達(dá)量作圖。發(fā)現(xiàn)參與MVA 途徑的基因在幼葉中表達(dá)量普遍較高，MEP 途徑相關(guān)基因在老葉中表達(dá)量較高，與萜類相對(duì)含量比較對(duì)應(yīng)，可能與葉中的萜類化合物的積累有關(guān)(圖3）。還檢測(cè)出2 個(gè)異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶 (IPPI,c31804.graph_c0,c89450.graph_c0），它們?cè)谌~中的表達(dá)量并不高，可能這些基因與萜類化合物相對(duì)含量并不密切相關(guān)。

圖3 花櫚木萜類骨架生物合成途徑Figure 3 Terpene skeleton biosynthesis pathway of O.henryi

MVA 和MEP 這2 個(gè)途徑后生成萜類化合物的前體，還需要3 個(gè)比較重要的酶參與：香葉基二磷酸合成酶 (GPPS）、法尼基二磷酸合成酶 (FPPS） 和香葉基香葉基焦磷酸合成酶 (GGPPS）。在花櫚木的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共檢測(cè)到2 個(gè)FPPS 基因 (c86328.graph_c0,c75342.graph_c0），2 個(gè)GPPS 基因 (c36059.graph_c0,c76294.graph_c0），5 個(gè)GGPPS 基因 (c55157.graph_c0,c71336.graph_c0,c65845.graph_c2,c63610.graph_c0,c69470.graph_c0），表達(dá)情況如圖3 所示。2 個(gè)GGPPS 基因c55157.graph_c0 和c69470.graph_c0 在幼葉中表達(dá)量比較高，多數(shù)二萜在幼葉中的積累量也是最多的(圖1），可能這2 個(gè)基因是花櫚木二萜物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶基因。TPSs 是催化合成不同種單帖、二萜和倍半萜類化合物的酶，OSCs 可以催化合成三萜類化合物，在花櫚木轉(zhuǎn)錄組中還鑒定出6 個(gè)TPSs 和8 個(gè)OSCs 基因，其表達(dá)譜如圖1B 所示。這些基因的表達(dá)在花櫚木中出現(xiàn)了組織差異性，每個(gè)組織中都有其表達(dá)量高的基因，其中與MVA 和MEP 途徑基因表達(dá)情況相似：在幼葉和老葉中表達(dá)量高的基因占比較大。這些TPSs 和OSCs 的組織差異表達(dá)可能是導(dǎo)致花櫚木中萜類多樣性和具有不同積累模式的主要原因。

為了進(jìn)一步了解研究中6 個(gè)TPSs 的假設(shè)功能，根據(jù)其蛋白序列，將其與已經(jīng)在擬南芥Arabidopsis thaliana、葡萄Vitisvinifera和番茄Lycopersiconesculentum等物種中確定的TPS 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4）。發(fā)現(xiàn)與之前報(bào)道相似，花櫚木中的TPSs 主要分布在TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-e 和TPS-g 亞家族。c70917.graph_c0 和c72335.graph_c1 被分類到TPS-b 中，可能這2 個(gè)基因在功能上比較類似；c64128.graph_c1 被分到TPS-e 亞家族，說明c64128.graph_c1 可能在花櫚木中行使著KS 酶功能；c73567.graph_c1 則被分到TPS-c 亞家族中，表明它可能有著CPS 酶的功能。為了進(jìn)一步推測(cè)花櫚木OSCs 的功能，對(duì)每個(gè)基因再次進(jìn)行了美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)注釋，發(fā)現(xiàn)除c71944.graph_c0 基因是編碼LUC 的基因外，其他7 個(gè)都是編碼β-AS 的基因。

圖4 花櫚木TPS 基因家族分析Figure 4 Analysis of TPS gene family of O.henryi

2.4 萜類生物合成相關(guān)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析與鑒定

為進(jìn)一步分析萜類化合物合成相關(guān)基因，利用WGCNA 對(duì)確定的全部DEGs 進(jìn)行了共表達(dá)分析。這些DEGs 被聚類為10 個(gè)分支，每個(gè)不同顏色標(biāo)記的模塊代表了1 個(gè)分支(圖5）。模塊是由具有相似表達(dá)模式的基因簇組成的，MEturquoise 模塊包含的基因數(shù)量最多(3 761 個(gè)基因），而MEmagenta 模塊的基因數(shù)量最少(104 個(gè)基因）。其中有7 個(gè)模塊與一些特定的萜類化合物表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)＞0.80）(圖5）。除了c63712.graph_c0 基因外，共有5 個(gè)TPSs 和8 個(gè)OSCs 基因表達(dá)差異明顯，推測(cè)這13 個(gè)差異表達(dá)的TPSs 和OSCs 可能是導(dǎo)致花櫚木5 個(gè)組織部位萜類化合物組成差異的重要候選基因。其中，MEturquoise 模塊中共有2 個(gè)TPSs 和4 個(gè)OSCs 基因；MEblue 模塊有2 個(gè)TPSs 和3 個(gè)OSCs 基因。MEturquoise 和MEbrown 與三萜類化合物的相關(guān)性較強(qiáng)(相關(guān)性系數(shù)＞0.90），而MEblue、MEblack和MEpink 模塊與倍半萜化合物有相關(guān)性，其中MEblue 模塊也與二萜和單萜具有相關(guān)性。二氫丹參酮Ⅰ這個(gè)二萜化合物與MEyellow 和MEgrey 2 個(gè)模塊都具有正相關(guān)性。這些正相關(guān)的模塊表明：這些基因在調(diào)節(jié)花櫚木萜類化合物的生物合成中具有潛在的作用。

圖5 花櫚木中基因與萜類化合物的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析Figure 5 Co-expression network analysis of genes and terpenoids in O.henryi

上述模塊的分析結(jié)果表明：MEturquoise 模塊富集了最多的TPSs 和OSCs，并且該模塊與烏蘇酸和甘草次酸呈正相關(guān)，相關(guān)性分別為0.95 和0.93(圖5）；MEblue 也富集到了較多的TPSs 和OSCs 基因，并且與一些倍半萜和二萜成正相關(guān)，所以對(duì)這2 個(gè)模塊開展進(jìn)一步的分析。在MEturquoise 模塊中發(fā)現(xiàn)：基因主要富集在次生代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，共檢測(cè)到105 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能參與TPSs 的調(diào)控(圖6 A和圖6 B）：bHLH、WRKY 和MYB 家族數(shù)量最多，分別有10、9 和8 個(gè)，此外C2H2、mTERF、FAR1 和bZIP 家族數(shù)量也達(dá)到了6～7 個(gè)。通過對(duì)MEblue 模塊基因進(jìn)行KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)基因主要富集在DNA 復(fù)制、同源重組和修復(fù)通路，并檢測(cè)到152 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，數(shù)量最多的是bHLH 和MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子 (圖7 A 和圖7 B）。為了進(jìn)一步研究MEturquoise 模塊中轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)TPSs 和OSCs 基因的關(guān)系，構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)圖，選擇了與MEturquoise 模塊中TPSs 和OSCs 基因相關(guān)性較強(qiáng)的34 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 (邊緣權(quán)重≥0.4），包括MYB、WRKY、bHLH、C3H、DBB、HB-HD-ZIP 和一些其他家族的轉(zhuǎn)錄因子(圖8）。最終利用Cytoscape 插件CytoHubba 的Degree 算法分析識(shí)別到了6 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，即HBHD-ZIP (c64527.graph_c1）、GRF (c76195.graph_c0）、DBB (c66970.graph_c2）、DBB (c75593.graph_c0）、HB-HD-ZIP (c63393.graph_c0）和C3H (c70385.graph_c1）。這些轉(zhuǎn)錄因子在花櫚木中可能與萜類化合物的合成基因有著密切的關(guān)系。

圖7 MEblue 模塊基因分析Figure 7 MEblue module gene analysis

圖8 萜類化合物合成相關(guān)酶基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Figure 8 Network diagram of terpenoid synthesis-related enzyme genes and transcription factor correlation

3 討論

目前，天然植物次生代謝物已被廣泛應(yīng)用于抗癌藥和治療感染性疾病的藥物[23]。根據(jù)合成起始分子不同，植物次生代謝物可以分為生物堿、萜類、苯丙烷類三大類化合物[24]。萜類一直是天然產(chǎn)物中重要的藥用化合物，具有多種藥理活性，如紫杉醇可以抗腫瘤，青蒿素屬于抗瘧疾特效藥物，雷公藤內(nèi)酯能夠抗炎等[25-26]，但藥用木本植物花櫚木中的萜類還沒有過報(bào)道。本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)分析了花櫚木中萜類物質(zhì)在不同部位的積累情況，共檢測(cè)出比較確定的15 種萜類化合物，并發(fā)現(xiàn)了甘草次酸、齊墩果、芳樟醇和二氫丹參酮Ⅰ等具有抗氧化、抗炎免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)定等藥用活性的萜類化合物[27]。通過對(duì)花櫚木不同組織部位的萜類代謝物熱圖分析發(fā)現(xiàn)，萜類化合物積累具有明顯組織特異性，主要積累在幼葉和老葉中，其他部位中積累較少，可能為了保護(hù)葉片免遭危害[28]。今后在提取和分析花櫚木藥用物質(zhì)時(shí)應(yīng)該更多利用它的葉片。

近些年來，RNA-Seq 高通量測(cè)序技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于藥用植物基因信息解讀、新基因發(fā)掘與基因功能研究中。人們已對(duì)藥用植物連翹Forsythiasuspense、銀杏Ginkgobiloba、款冬Tussilagofarfara等進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的研究，獲得了大量有用的基因信息[29-30]。這使得闡明藥用植物中活性物質(zhì)的合成及積累規(guī)律成為可能，為增加次生代謝物積累、改善藥用植物品質(zhì)提供更多途徑。本研究采用RNA-Seq 對(duì)花櫚木5 個(gè)不同組織部位進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得96 302 個(gè)，在經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后共注釋了47 809 條轉(zhuǎn)錄本。利用FPKM 值對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析比較，共獲得顯著差異基因13 840 個(gè)。韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)大量基因表達(dá)具有組織特異性，并通過注釋信息在差異顯著的基因中共鑒定出49 個(gè)與萜類化合物生物合成相關(guān)的基因，包括29 個(gè)萜類骨架生物合成途徑的酶基因，6 個(gè)單帖、倍半萜和二萜生物合成酶基因，8 個(gè)三萜生物合成酶基因以及6 個(gè)可能參與萜類生物合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)花櫚木的萜類合成有了初步的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)研究提供了信息資源。

先前的研究表明：MVA 途徑在許多植物的三萜生物合成中起主導(dǎo)作用，如人參Panaxginseng、三七P.notoginseng和茶樹Camelliasinensis等植物[31-32]，MEP 途徑通常有助于單萜類化合物和二萜類化合物的生物合成[33]。但是本研究利用熱圖對(duì)萜類生物合成基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：MVA 途徑相關(guān)酶基因大多數(shù)在幼葉中表達(dá)量較高，MEP 途徑多數(shù)相關(guān)基因則集中在老葉中表達(dá)。根據(jù)相應(yīng)FPPS、GPPS 和GGPPS 酶基因的表達(dá)情況，以及花櫚木中三萜主要在老葉中積累，而二萜、倍半萜和單萜在幼葉中積累較多的情況，推測(cè)在花櫚木中三萜類化合物前體可能主要由MEP 途徑生成，而二萜、單帖和倍半萜的前體物質(zhì)則主要由MVA 途徑提供。由圖4 看出：花櫚木的TPS 基因在進(jìn)化上相對(duì)于各種模式植物來說是相對(duì)分離的，也進(jìn)一步印證了其萜類的合成具有特殊性。也有可能由于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的限制，部分基因沒有檢測(cè)到，且研究中還沒有檢測(cè)到所有的萜類物質(zhì)，從而導(dǎo)致判斷出現(xiàn)誤差，所以后續(xù)還需要大量的試驗(yàn)來驗(yàn)證其功能，判斷花櫚木中萜類的具體合成情況。

基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控一直是植物代謝研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。對(duì)不同植物的研究表明：參與萜類生物合成的轉(zhuǎn)錄因子主要分布在bHLH、AP2/ERF、bZIP 和WRKY 家族中，如在西洋參P.quinquefolius中轉(zhuǎn)錄因子PqWRKY1 是三萜人參皂苷生物合成相關(guān)的正調(diào)節(jié)因子[34]，在艾葉Artemisiaargyi中AarbHLHs的基因表達(dá)與1, 8-桉樹烯或β-石竹烯的含量變化呈顯著相關(guān)[35]。本研究利用WGCNA 對(duì)差異基因和萜類化合物進(jìn)行了相關(guān)性分析，篩選出一些可能對(duì)萜類生物合成的關(guān)鍵酶基因表現(xiàn)重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族，如MYB、WRKY、bHLH 和HB-HD-ZIP 轉(zhuǎn)錄因子。有研究預(yù)測(cè)傳統(tǒng)中藥走馬胎Ardisiakteniophylla中AP2/ERF、MYB、WRKY 和bHLH 轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控萜類合成，預(yù)測(cè)赤桉Eucalyptuscamaldulensis中WRKY、MYB、NAC 和bHLH 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)萜類生物合成中的關(guān)鍵酶基因表現(xiàn)出重要的調(diào)控作用[36]。這和本研究預(yù)測(cè)的結(jié)果基本相同。經(jīng)過分析進(jìn)一步篩選出6 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子處于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的中心位置，推測(cè)這些候選轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控了萜類化合物的生物合成，后續(xù)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

本研究通過代謝組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)花櫚木葉中萜類相對(duì)含量最高，并鑒定出49 個(gè)與萜類化合物生物合成相關(guān)的基因。預(yù)測(cè)了可能調(diào)控萜類化合物生物合成的上游轉(zhuǎn)錄因子。本研究為花櫚木資源活性成分萜類化合物的積累狀況、生物合成及調(diào)控提供了大量的信息，彌補(bǔ)了花櫚木萜類合成研究中的空白，為進(jìn)一步開展花櫚木的主要藥用活性物質(zhì)研究提供基礎(chǔ)。