唐 彬, 蔡 文, 徐姍姍, 江征慧, 未亞蘭, 江飛云

(華東師范大學(xué)附屬蕪湖醫(yī)院/安徽省蕪湖市第二人民醫(yī)院 婦科, 安徽 蕪湖, 241000)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的常見婦科惡性腫瘤,多見于圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性[1-2]。肥胖、糖尿病、高脂血癥、高雌激素水平等在內(nèi)的因素可增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險[3]。早期子宮內(nèi)膜癌患者的生存率可通過手術(shù)、化療、放療得到改善,但晚期患者的預(yù)后仍較差[2,4]。因此,探究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制并鑒別有效的治療靶點對改善子宮內(nèi)膜癌預(yù)后有重要意義[5]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員堿性亮氨酸拉鏈和W2結(jié)構(gòu)域2(BZW2)可參與調(diào)控細胞黏附,其機制可能與介導(dǎo)鈣黏蛋白有關(guān)。BZW2在多種癌癥中主要發(fā)揮致癌作用,但BZW2在子宮內(nèi)膜癌中的表達和作用尚不明確。Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路,參與調(diào)控多種生物學(xué)功能,如細胞增殖、凋亡、分化等[6]。Wnt/β-catenin通路失調(diào)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7]?；谏鲜鰣蟮?本研究探討B(tài)ZW2對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學(xué)行為的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系ESC購自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司; 人子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa購自北納生物; 人子宮內(nèi)膜癌細胞KLE、RL95-2、HEC-1-A購自美國菌種保藏中心; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Biowest公司; McCoy′s 5A培養(yǎng)基購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司; SKL2001購自大連美侖生物技術(shù)有限公司; siRNA-BZW2#1/2(siRNA-BZW2#1: 5′-GGCTCAAGATTAGATTATCGTCG-3′; siRNA-BZW2#2: 5′-CTGTGTGTTTTCAGCAAATGAAG-3′)和陰性對照siRNA-NC由武漢金開瑞生物工程有限公司構(gòu)建; LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司; Steadypure 通用RNA提取試劑、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混型 qPCR試劑盒購自艾科瑞生物; RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光液、碘化丙啶(PI)和核糖核酸酶(RNase)A均購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司; CCK-8試劑購自北京百瑞極生物科技有限公司; 基質(zhì)膠、Transwell小室購自美國BD公司; 抗BZW2(貨號ab254771)、抗Ki-67(貨號ab16667)、抗增殖細胞核抗原(PCNA, 貨號ab92552)、抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2, 貨號ab92536)、抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9, 貨號ab76003)、抗周期依賴性激酶4(CDK4, 貨號ab108357)、抗周期依賴性激酶6(CDK6,貨號ab124821)、抗β-catenin(貨號ab32572)、抗c-Myc(貨號ab32072)、抗磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β, 貨號ab75814)、抗GSK3β(貨號ab32391)、抗GAPDH(貨號ab9485)、抗Lamin B1(貨號ab229025)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(貨號ab6721)均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、處理和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染: 含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基用于ESC、Ishikawa、KLE、RL95-2細胞的培養(yǎng); 含10% FBS的McCoy′s 5A培養(yǎng)基用于HEC-1-A細胞的培養(yǎng)。孵育環(huán)境為37 ℃、5% CO2。將HEC-1-A細胞接種于6孔板中(5×104個/孔),嚴格按照LipofectamineTM3000說明書將siRNA-BZW2#1/2、siRNA-NC瞬時轉(zhuǎn)染至匯合度為60%～70%的細胞中,轉(zhuǎn)染持續(xù)48 h, 分為4組,分別為Control組、siRNA-NC組、siRNA-BZW2#1組、siRNA-BZW2#2組。為驗證BZW2通過Wnt信號進而參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌進展,加入40 μmol/L SKL2001對HEC-1-A細胞進行處理,分為4組, 分別為Control組、siRNA-NC組、siRNA-BZW2組、siRNA-BZW2+SKL2001組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR): 收集人子宮內(nèi)膜癌細胞(Ishikawa、KLE、RL95-2、HEC-1-A)及人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系ESC, 利用Steadypure通用RNA提取試劑和Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取總RNA并進行cDNA合成。在PCR反應(yīng)體系中按照說明書加入SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR試劑盒。采用2-△△Ct法進行分析并相對于GAPDH進行標準量化。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot): 人子宮內(nèi)膜癌細胞及人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系ESC或“1.2.1”分組HEC-1-A細胞加入100 μL預(yù)冷的RIPA裂解液進行充分裂解,并采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜, 5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,與一抗在4 ℃條件下孵育過夜。洗膜緩沖液(TBST)洗滌后,加入HPR標記的羊抗兔二抗,室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光試劑盒對蛋白條帶進行顯影,并拍照觀察。

1.2.4 CCK-8檢測細胞活力: 在96孔板中配備轉(zhuǎn)染后的HEC-1-A細胞,每孔約4×103個細胞。利用450 nm的酶標儀分析光密度(OD)值之前,滴入10 μL CCK-8進行2 h孵育。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力: 在6孔板中配備轉(zhuǎn)染后的HEC-1-A細胞,每孔約200個細胞。2周后利用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞,多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色,利用光學(xué)顯微鏡進行克隆數(shù)統(tǒng)計。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移: 在6孔板中配備轉(zhuǎn)染后的HEC-1-A細胞,使用移液器在匯合度為90%的細胞中形成劃痕,利用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育經(jīng)PBS沖洗后的細胞。分別于0、24 h時取樣拍照,計算細胞遷移率。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲: 在鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室和下室內(nèi)分別配備轉(zhuǎn)染后的HEC-1-A細胞和500 μL含10% FBS的McCoy′s 5A培養(yǎng)基。24 h后,拭去殘留細胞,細胞經(jīng)固定和染色后,于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期: 收集轉(zhuǎn)染后的HEC-1-A細胞,加入預(yù)冷體積分數(shù)70%的乙醇進行固定,并將細胞重懸于PI/RNase A染色緩沖液中,黑暗中孵育30 min。流式細胞儀上機檢測。

1.2.9 數(shù)據(jù)庫分析: 通過GSEA分析BZW2在Wnt信號通路中的富集度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 BZW2在子宮內(nèi)膜癌細胞中表達呈上升趨勢

通過RT-qPCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn), BZW2在人子宮內(nèi)膜癌細胞(Ishikawa、KLE、RL95-2、HEC-1-A)中的表達較人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系ESC增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1A、圖1B)。后續(xù)選擇BZW2相對表達量最高的HEC-1-A細胞進行實驗。

A: RT-qPCR檢測子宮內(nèi)膜癌細胞中BZW2 mRNA表達水平。B: Western blot檢測BZW2在子宮內(nèi)膜癌細胞中的蛋白表達水平。與ESC比較, ???P<0.001。圖1 BZW2在子宮內(nèi)膜癌細胞系中表達增加

2.2 BZW2缺失抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖

為闡明BZW2對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的影響,本研究構(gòu)建BZW2干擾質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染至HEC-1-A細胞,RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果表明,與siRNA-NC組比較, siRNA-BZW2#1組、siRNA-BZW2#2組的BZW2mRNA和BZW2蛋白表達均下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2A、2B), 故后續(xù)實驗選擇干擾效率較為顯著的siRNA-BZW2#2質(zhì)粒。siRNA-BZW2組較si-NC組細胞活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2C)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明,與si-NC組相比, siRNA-BZW2組細胞克隆形成能力減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2D)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),敲低BZW2導(dǎo)致增殖相關(guān)Ki-67和PCNA蛋白表達下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2E)。

A: RT-qPCR檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后BZW2的mRNA表達水平; B: Western blot檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后BZW2的蛋白表達水平; C: CCK-8檢測HEC-1-A細胞活力; D: 克隆形成實驗檢測HEC-1-A細胞克隆形成能力; E: Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白表達水平。與siRNA-NC組比較, ???P<0.001。圖2 BZW2缺失抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖

2.3 BZW2缺失抑制子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和遷移

劃痕實驗顯示,與si-NC組相比, siRNA-BZW2組遷移細胞數(shù)目大幅度下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖3A)。此外, siRNA-BZW2組較si-NC組侵襲細胞數(shù)目降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖3B)。Western blot分析發(fā)現(xiàn),干擾BZW2可抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2和MMP9表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖3C)。

2.4 BZW2缺失誘導(dǎo)G0/G1期細胞阻滯

如圖4A所示,流式細胞分析結(jié)果表明, siRNA-BZW2組較si-NC組G1期細胞數(shù)量增加, S期和G2期細胞數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4A)。Western blot分析周期相關(guān)蛋白CDK4和CDK6表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn), siRNA-BZW2組較si-NC組CDK4和CDK6蛋白表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4B)。

A: 流式細胞術(shù)檢測HEC-1-A細胞周期; B: Western blot檢測周期相關(guān)蛋白表達水平。與siRNA-NC組比較, ???P<0.001。圖4 BZW2 缺失誘導(dǎo)G0/G1期細胞阻滯

2.5 BZW2缺失抑制Wnt/β-catenin通路

經(jīng)GSEA分析發(fā)現(xiàn), BZW2顯著富集于Wnt信號通路中(圖5A)。進一步Western blot分析結(jié)果揭示,與si-NC組比較, siRNA-BZW2組β-catenin、c-Myc、p-GSK3β蛋白表達減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 而添加Wnt/β-catenin信號通路激動劑SKL2001后,上述蛋白表達再次增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖5B)。

A: GSEA分析檢測BZW2在Wnt信號通路中的富集度; B: Western blot檢測Wnt信號通路相關(guān)蛋白表達水平。與siRNA-NC組比較, ???P<0.001; 與siRNA-BZW2組比較, ###P<0.001。圖5 BZW2缺失抑制Wnt/β-catenin通路

2.6 SKL2001部分逆轉(zhuǎn)了BZW2干擾對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用

為驗證BZW2是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路進而參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展,本研究利用SKL2001對細胞進行處理,并分為Control組、siRNA-BZW2組及siRNA-BZW2+SKL2001組。CCK-8結(jié)果表明,與Control組相比, BZW2缺失導(dǎo)致細胞活性下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 與siRNA-BZW2組相比, siRNA-BZW2+SKL2001組中細胞活性有所提升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖6A)?？寺⌒纬蓪嶒炞C明, siRNA-BZW2組較Control組克隆形成數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); siRNA-BZW2+SKL2001組較siRNA-BZW2組克隆形成數(shù)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖6B)。Western blot分析同樣發(fā)現(xiàn),與Control組比較, siRNA-BZW2組Ki-67和PCNA蛋白表達減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 與siRNA-BZW2組相比, siRNA-BZW2+SKL2001組Ki-67和PCNA蛋白表達再次上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)(圖6C)。此外,與Control組相較, siRNA-BZW2組遷移和侵襲細胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); siRNA-BZW2+SKL2001組較siRNA-BZW2組遷移和侵襲細胞數(shù)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖6D、6E)。Western blot分析結(jié)果同樣表明, siRNA-BZW2組較Control組MMP2、MMP9蛋白表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 而siRNA-BZW2+SKL2001組較siRNA-BZW2組MMP2、MMP9蛋白表達增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖6F)。

2.7 SKL2001部分逆轉(zhuǎn)了BZW2干擾對子宮內(nèi)膜癌細胞周期的作用

流式細胞術(shù)和Western blot分析結(jié)果表明,與si-NC組比較,siRNA-BZW2組G0/G1期細胞占比高, S期和G2期細胞占比低,且CDK4和CDK6蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與siRNA-BZW2組比較, siRNA-BZW2+SKL2001組G1期細胞占比下降, S期細胞占比升高,且CDK4和CDK6蛋白表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)(圖7A、7B)。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是引起女性死亡的重要原因之一[8]。雖然已有報道[9]揭示基因表達異常與子宮內(nèi)膜癌的惡性生物學(xué)特征的相關(guān)性,但腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)機制仍亟待闡明。因此,探究潛在的新型腫瘤生物標志物對子宮內(nèi)膜癌診斷和靶向治療具有重要意義。

BZW2可在惡性腫瘤中作為致癌因子驅(qū)動特定的細胞生物活動。本研究同樣表明,BZW2在子宮內(nèi)膜癌細胞中表達上調(diào),且敲低BZW2表達可導(dǎo)致增殖、遷移和侵襲細胞數(shù)目下降。增殖相關(guān)蛋白Ki-67和PCNA表達增加與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后相關(guān)[10]。此外,轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2和MMP9[11]在子宮內(nèi)膜癌組織中異常表達并與子宮內(nèi)膜異位癥的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)[12]。同樣,干擾BZW2可導(dǎo)致Ki-67、PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達顯著下降。以上實驗結(jié)果均表明敲低BZW2可通過抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移和侵襲,從而發(fā)揮抑癌作用。

細胞周期的快速運轉(zhuǎn)是腫瘤細胞增殖的重要機制[13]。細胞周期包括G1/S期、G2/M期重要檢查點,任意階段的細胞周期調(diào)控異常都會導(dǎo)致細胞周期停滯,并抑制細胞增殖[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn),BZW2缺失可導(dǎo)致肌層浸潤性膀胱癌G1期細胞停滯; 研究[16]表明,敲低BZW2表達可促進骨肉瘤G2/M期細胞停滯。本研究結(jié)果揭示,抑制BZW2可導(dǎo)致G0/G1期細胞比例增加, S期和G2期細胞比例減少。CDK4和CDK6是細胞周期的核心調(diào)控因子,且CDK4/6抑制劑可抑制子宮內(nèi)膜癌腫瘤生成[17-18]。本研究中,功能喪失實驗結(jié)果表明,敲低BZW2后CDK4和CDK6蛋白表達呈現(xiàn)顯著下降趨勢。

GSEA分析數(shù)據(jù)表明, BZW2顯著富集于Wnt信號通路中; 且沉默BZW2可顯著減少子宮內(nèi)膜癌細胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、p-GSK3β/GSK3β表達; 而Wnt/β-catenin信號通路激動劑SKL2001可再次促進以上蛋白表達。本研究結(jié)果顯示,SKL2001可部分恢復(fù)BZW2缺失對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移、侵襲及細胞周期的影響。

綜上所述, BZW2缺失可阻礙子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移、侵襲,并誘導(dǎo)細胞周期阻滯,其機制可能與Wnt/β-catenin信號通路失活有關(guān),表明BZW2可作為診斷子宮內(nèi)膜癌的分子標志物及治療子宮內(nèi)膜癌的潛在分子靶標。