袁稚雯，王士巖，2，朱小燕，2*，李相前，2*

1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省益生制劑重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003

畢赤酵母（Pichia pastoris）作為單細(xì)胞真核生物之一，是能利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌[1]。酵母水解物（Yeast hydrolysates，YH）通過酵母與蛋白酶酶解得到，因?yàn)榻湍讣?xì)胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分[2]，常用于微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵[3]。隨著國內(nèi)生物酶制劑的發(fā)展，現(xiàn)在可以使用生物酶法提取酵母浸出物和水解物[4]。酶促能夠加速細(xì)胞壁裂解，使其內(nèi)部細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)被大量釋放[5]。外加酶能縮短水解時(shí)間，提高水解效率，達(dá)到酵母細(xì)胞壁溶解的目的，多種外加酶一起搭配作用，會有更好的破壁效果[6-7]。目前，我國在研究酵母水解物時(shí)，主要采用的方法有：鹽溶法、外加酶解法和復(fù)合促溶法[8-11]等。因能顯著提高酵母細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的獲得率[12]，減少溶解所需時(shí)間，外加酶法已經(jīng)成為當(dāng)下的熱門使用方法[13]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：畢赤酵母，為本實(shí)驗(yàn)室保藏；

酶制劑：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶，購買于銳陽生物科技有限公司，詳情見表1；

表1 酶解酵母細(xì)胞所用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶

培養(yǎng)基配制：

YPD 液體培養(yǎng)基，酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，pH 自然，115 ℃滅菌20 min。

YPD 固體培養(yǎng)基，酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，pH 自然，115 ℃滅菌20 min。

在超凈工作臺中，將實(shí)驗(yàn)室保藏的畢赤酵母菌株挑取一環(huán)菌劃線分離于YPD 固體培養(yǎng)基平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)48～72 h；挑取單個(gè)菌落放至5 mL YPD 試管培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，250 r/min，30 ℃，24 h；從5 mL YPD 試管培養(yǎng)基中吸取100 μL 菌液轉(zhuǎn)入100 mL YPD 培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，250 r/min，30 ℃，24 h；將100 mL 菌液完全倒入1 L YPD 培養(yǎng)液中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，250 r/min，30 ℃，24 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

酵母發(fā)酵液→洗滌離心（8 000 r/min）×3 次→洗凈的酵母泥→配制酵母懸浮液（包含4% NaCl）→自溶→滅酶（105 ℃，20 min）→冷卻離心→水解產(chǎn)物的檢測。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 酵母水解物中氨基氮的測定

將5 mL 上清液稀釋至100 mL，加水混合；然后，將20 mL 稀釋液加入燒杯，并在磁力攪拌器上加入60 mL 水；將0.05%氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴到pH 8.2，中和上清液中的游離酸。

加入10 mL 甲醛混合，并將0.05%氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴到pH 9.2，以測定氨基酸態(tài)氮。

空白實(shí)驗(yàn)，在80 mL 水中加入0.05%氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入10 mL 甲醛，用于比較去氫氧化鈉的體積結(jié)果。結(jié)果將用于評估酵母水解物中游離酸和氨基酸態(tài)氮的含量，以研究酵母的代謝特性。

計(jì)算公式

式中：X 為樣品中氨基氮含量（mg/100 mL）；V1為空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.2 所用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；V2為樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至pH 9.2 所用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；C為氫氧化鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。

1.2.2.2 酵母水解物中固形物的測定

取酵母水解液10 000 r/min 離心10 min，取得5 mL 上清液放置105 ℃烘箱烘干至恒重。

計(jì)算公式

式中：M3為酵母在發(fā)酵后自溶并產(chǎn)生上清液的總質(zhì)量（g）；W1為上清液中固體物質(zhì)的含量（%）；M4為發(fā)酵過程中添加到反應(yīng)中的外加物質(zhì)（如營養(yǎng)物質(zhì)等）的干重（g）；M2為發(fā)酵前酵母的干重（g）。

1.2.2.3 酵母水解物中蛋白質(zhì)含量的測定

采用凱氏定氮法測定；樣品處理；將酵母水解物置于真空冷凍干燥機(jī)至恒重，備用。消化。

稱取干燥至恒重的酵母水解物0.1 g，移入干燥凱氏燒瓶中，加入0.2 g 硫酸鉀-硫酸銅混合物，并加入消化液5 mL 和玻璃珠1 粒，搖勻；將燒瓶至60°角固定在鐵架上，每個(gè)瓶口放一小漏斗，把操作放置于通風(fēng)櫥內(nèi)，使用電爐加熱消化，同時(shí)控制火力，不要讓液體沖到瓶頸，一般控制在200 ℃；待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，使瓶內(nèi)液體微微沸騰，大約至400 ℃維持2～3 h；待消化液呈藍(lán)綠色澄清透明狀，再繼續(xù)加熱0.5 h；?；鹄鋮s后，將消化液移入100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，備用；另取一干燥的凱氏燒瓶，以1 mL 蒸餾水替換干燥的酵母水解物樣品作為空白對照，其他操作均相同。

（1）標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨樣品的蒸餾

先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液（0.3 mg N/mL）實(shí)驗(yàn)2～3次；取3 個(gè)50 mL 的錐形瓶，分別準(zhǔn)確加入2%硼酸5～10 mL，加入混合指示劑；用表面皿覆蓋備用；用吸量管吸取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液，由加樣漏斗傾入至反應(yīng)室，再用1 mL 蒸餾水清洗漏斗；取1 個(gè)盛有硼酸-混合指示劑的錐形瓶，置于冷凝管下端，使冷凝管器管口下端浸沒在硼酸溶液的液面下，用量筒從漏斗加入30%氫氧化鈉5～10 mL，隨即將自由夾夾緊，漏斗加入少量蒸餾水作水封；加熱蒸汽發(fā)生器使其產(chǎn)生蒸汽，待第1 滴蒸餾液從冷凝柱下端滴下時(shí)，繼續(xù)蒸餾5 min，然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再繼續(xù)蒸餾2 min，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管口外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸餾器洗凈。

（2）樣品消化液及空白液的蒸餾

取50 mL 錐形瓶數(shù)個(gè)，各加入2%硼酸溶液5～10 mL 和指示劑1～2 滴，用表面皿覆蓋備用；用吸量管分別吸取5～10 mL 樣品消化液和空白液，按照上述操作步驟進(jìn)行蒸餾。

滴定：蒸餾完畢，用微量酸式滴定管，分別以0.010 0 mol/L HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，待錐形瓶內(nèi)液體的顏色由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色（或淡紫色），即滴定終點(diǎn)。分別記錄樣品消化液蒸餾物及空白消化液蒸餾物的HCl 使用量，分別為V1和V2。

計(jì)算公式

式中：X 為樣品中蛋白質(zhì)的含量（%）；V1為加入樣品后消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積（mL）；V2為空白實(shí)驗(yàn)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積（mL）；C 為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，表示單位體積中含有鹽酸的物質(zhì)的量（mol/L）；0.014 為每毫升鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中相當(dāng)于氮的克數(shù)；m 為樣品的質(zhì)量（g）；F 為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為6.25。

2 結(jié)果與討論

2.1 自溶對畢赤酵母破壁的影響

2.1.1 不同溫度對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖1 可知，在其他影響因素保持不變的情況下，溫度為50 ℃時(shí)，酵母細(xì)胞具有最高的氨基氮和固形物得率，這是細(xì)胞內(nèi)酶活性的最佳溫度。因此，本實(shí)驗(yàn)中的最佳破壁溫度為50 ℃，此時(shí)細(xì)胞具有最佳的破壁效果。

圖1 不同溫度對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.1.2 不同pH 對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖2 可知，在其他影響因素保持不變的情況下，當(dāng)pH 為6.0 時(shí)，酵母細(xì)胞釋放的氨基氮和固形物得率最佳。因此，最適破壁的pH 為6.0。

圖2 不同pH 對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.1.3 不同懸浮液底物體積分?jǐn)?shù)對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖3 可知，體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，自溶破壁效果最佳，酵母細(xì)胞的氨基氮和固形物得率最高。因此，本實(shí)驗(yàn)中的最佳破壁懸浮液底物體積分?jǐn)?shù)為10%。

圖3 不同懸浮液底物體積分?jǐn)?shù)對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.1.4 不同作用時(shí)間對畢赤酵母自溶破壁的影響

由圖4 可知，在其他影響因素保持不變的情況下，當(dāng)作用時(shí)間為30 h 時(shí)，酵母細(xì)胞的氨基氮和固形物得率最高。因此，本實(shí)驗(yàn)中的最佳作用時(shí)間為30 h。

圖4 不同作用時(shí)間對畢赤酵母自溶破壁的影響

2.2 不同蛋白酶對畢赤酵母水解的影響

實(shí)驗(yàn)研究表明，相對于其他蛋白酶水解的研究，使用木瓜蛋白酶的效果最好。如圖5 所示，氨基氮得率為4.5%，固形物得率為59%。表2 可見，國際水解蛋白委員會關(guān)于酵母水解物化學(xué)指標(biāo)中，對氨基酸的建議標(biāo)準(zhǔn)為>3.5%（不含NaCl），添加木瓜蛋白酶的效果能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的粗蛋白含量為45.38%。國際水解蛋白委員會對于酵母水解物化學(xué)指標(biāo)當(dāng)中總氮的建議標(biāo)準(zhǔn)為>9.0%（不含NaCl），因此，添加木瓜蛋白酶的效果能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 不同蛋白酶自溶水解的影響

表2 酵母水解物的化學(xué)指標(biāo)

2.3 木瓜蛋白酶水解條件的優(yōu)化

2.3.1 添加量

蛋白酶的添加量對酵母自溶破壁存在一定影響，添加量不同對其破壁的影響程度不同。由圖6 可知，當(dāng)木瓜蛋白酶的添加量在0.5%時(shí)，氨基氮得率為4.2%，固形物得率56%。故確定木瓜蛋白酶的添加量為0.5%。

圖6 木瓜蛋白酶的添加量對酶促溶的影響

2.3.2 pH

木瓜蛋白酶pH 在5.0～7.0，不同的pH 對其破壁的影響程度不同。由圖7 可知，pH 在6.0 時(shí)，氨基氮得率為4.0%，固形物得率55%。故確定pH 對木瓜蛋白酶的影響在6.0。

圖7 pH 對木瓜蛋白酶酶促溶的影響

2.3.3 溫度

木瓜蛋白酶的適宜溫度在50～58 ℃，不同溫度的影響如圖8 所示。當(dāng)溫度在52 ℃時(shí)，氨基氮得率為4.5%，固形物得率為60%。故確定在52 ℃下木瓜蛋白酶作用效果最佳。

圖8 溫度對木瓜蛋白酶酶促溶的影響

2.3.4 作用時(shí)間

作用時(shí)間對于木瓜蛋白酶酶活起到的作用也不同，如圖9 所示。在作用時(shí)間為30 h 時(shí)，木瓜蛋白酶的酶活發(fā)揮最高價(jià)值，其氨基氮得率為4.5%，固形物得率為59%。相比其他作用時(shí)間，30 h 是最佳時(shí)間。

圖9 作用時(shí)間對木瓜蛋白酶酶促溶的影響

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母的自溶水解條件在50 ℃、pH 6.0，作用時(shí)間為30 h、4% NaCl，酵母懸浮液終體積分?jǐn)?shù)為10%最佳，氨基氮得率為2.2%，固形物得率為30%。木瓜蛋白酶（8×105U/g）在添加量為0.5%、52℃、pH 6.0、作用時(shí)間30 h、4% NaCl、酵母懸浮液終體積分?jǐn)?shù)為10%的氨基氮得率為4.5%，固形物得率為59%，粗蛋白含量為45.38%。