張世侖，王大威，黃 波，靖 波，王秀軍

1. 海洋油氣高效開發(fā)全國重點實驗室，北京 102209；2.中海油研究總院有限責(zé)任公司，北京 100028

硫酸鹽還原菌（Sulfate-Reducing Bacteria，SRB）是一類利用硫酸根離子（SO42-）作為末端電子受體進行能量代謝并產(chǎn)生硫化氫（H2S）的厭氧微生物的統(tǒng)稱。許多SRB 也具有利用單質(zhì)硫、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等作為電子受體產(chǎn)生H2S 的能力。SRB 廣泛分布在海洋沉積物、稻田、深海熱泉、地下管道等厭氧或缺氧的環(huán)境中[1]。

向油藏中大量注水以提高地層壓力是油田開發(fā)的核心工藝技術(shù)之一。但是，隨著注水開發(fā)的不斷進行，注入水或驅(qū)油劑中含有的含硫化合物（SO42-）等物質(zhì)大量進入油藏環(huán)境，這些物質(zhì)能夠促進SRB生長繁殖，進而釋放大量H2S，導(dǎo)致石油開采、地面集輸系統(tǒng)的生產(chǎn)設(shè)備及管道腐蝕與損壞[2]。此外，硫化物會污染環(huán)境、危害身體健康，給油田帶來巨大的經(jīng)濟損失。調(diào)查研究顯示，管道腐蝕每年給我國油田造成的直接經(jīng)濟損失接近百億元，其中50%以上的經(jīng)濟損失是由SRB 引起的[3]。

開發(fā)解決微生物腐蝕與硫化物污染問題的新方法，是石油工業(yè)新技術(shù)研究的前沿和熱點。南海W油田經(jīng)過注水開發(fā)，已經(jīng)有多個采出井出現(xiàn)了H2S濃度升高的現(xiàn)象。目前，我們對W 油田微生物多樣性、SRB 代謝活性的認識有限，對微生物在該油田環(huán)境中的生長繁殖和次生H2S 問題進行研究具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源。海上高溫W 油田A 區(qū)塊（油藏溫度：75～130 ℃）產(chǎn)出井A2、A3、A5 采出液和緩沖罐、過濾器、下岸口等地面管線流程節(jié)點。

試劑與實驗設(shè)備。Veriti Fast PCR 儀（Applied Biosystems，美國）、SPINeasyTM水樣基因組DNA 提取試劑盒（MP Biomedicals，美國）、PCR 反應(yīng)混合物（大連寶生物工程有限公司，中國）、Illumina 測序平臺（北京奧維森基因科技有限公司，中國）、硫酸鹽還原菌測試瓶（北京華興世紀儀器有限公司，中國）、離子色譜儀ICS-6000（Thermo Fisher，美國）。

1.2 方法

采集樣品。取25 L 塑料桶，用95%酒精消毒3遍，開啟取樣閥，讓油田水樣流出10 min；將油水樣品裝滿單桶，盡可能排盡空氣，迅速將桶口密封，擰緊蓋子，運抵實驗室。

離子參數(shù)檢測。將樣品在14 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液過0.22 μm 硝酸纖維素濾膜，回收濾液，注入樣品定量環(huán)，用淋洗液將樣品溶液帶入分析柱中，待測離子由于在柱子上的保留特性不同而分離開來，以保留時間進行定性，以峰高或峰面積進行定量，測定樣品中的離子含量。

微生物菌體收集。對于水相部分，采用離心法（14 000 r/min，5 min）收集微生物菌體；對于油相部分，與異辛烷混合溶解后，將所得單一相進行離心（14 000 r/min，15 min）以獲取沉淀；將上層液過0.22 μm 硝酸纖維素濾膜，收取菌體。

樣品DNA 提取。將菌液置于離心管內(nèi)，14 000 r/min 離心10 min；將沉淀用1 mL Lysis 緩沖液沖洗，再用0.6 mL Lysis 緩沖液重懸，加入適量玻璃珠研磨1 min，再加入終質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的溶菌酶，37 ℃反應(yīng)1 h；最后加入120 μL 20%的SDS，65℃反應(yīng)1 h；后續(xù)提取操作步驟參照DNA 提取試劑盒說明書進行。

微生物群落組成分析。采用正向引物（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3’）、反向引物（5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’）對樣品DNA 進行16S rRNA 擴增[4]，反應(yīng)體系（去離子水12 μL，2×PCR 反應(yīng)混合物10 μL，正、反向引物各1 μL，DNA為1 μL），反應(yīng)程序（預(yù)變性94 ℃，2 min；32 個循環(huán)：變性94 ℃，40 s；退火55 ℃，40 s；延伸72 ℃，1 min；終延伸72 ℃，15 min）；PCR 產(chǎn)物送至北京奧維森基因科技有限公司，在“科”“屬”水平上著重分析SRB 群落的組成多樣性及其相對豐度情況。

SRB 數(shù)量測定。采用最大可能計數(shù)法（most probable number，MPN）測定樣品中SRB 的數(shù)量，參照行業(yè)標準SY/T 0532—2012《油田注入水細菌分析方法絕跡稀釋法》，每個待測樣品設(shè)置10 個稀釋梯度（100～10-9），每個稀釋度設(shè)置3 個平行樣。接種后的測試瓶置于培養(yǎng)箱中，75 ℃恒溫培養(yǎng)30 d，然后根據(jù)測試瓶的變黑（產(chǎn)生H2S）情況，查詢MPN 表以確定SRB 數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品離子參數(shù)分析

獲得W 油田產(chǎn)出井（A2、A3、A5）采出液和地面流程節(jié)點（緩沖罐、過濾器、下岸口）樣品的離子參數(shù)信息，結(jié)果見表1。由表1 可知，產(chǎn)出井（A2、A3、A5）樣品的SO42-平均質(zhì)量濃度為204.8 mg/L，地面三處節(jié)點樣品的SO42-平均質(zhì)量濃度為202.0 mg/L，說明從產(chǎn)出端到地面管線流程中，SO42-維持在較高的濃度水平上，具備產(chǎn)生H2S 的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 樣品離子參數(shù) 單位（mg/L）

2.2 SRB 數(shù)量測定

在采用MPN 法計數(shù)的第30 天，獲得W 油田產(chǎn)出井（A2、A3、A5）采出液和地面流程節(jié)點（緩沖罐、過濾器、下岸口）樣品中的SRB 數(shù)量，結(jié)果見表2。產(chǎn)出井采樣點的SRB 數(shù)量為102～103個/mL，地面管線流程中的SRB 數(shù)量升高，達到104～106個/mL，呈現(xiàn)出空間差異性。

表2 樣品SRB 數(shù)量測定 單位（個/mL）

2.3 SRB 群落組成分析

選擇測序所得有效序列，與核糖體RNA 數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得樣品微生物的菌種注釋信息?；诰N注釋信息和有效序列的豐度，對樣品SRB 的多樣性與相對豐度情況進行分析。如圖1 所示，產(chǎn)出井（CC）中的SRB 共有12 種，在樣品微生物總量中占比26.32%，其中Desulfonauticus 和Desulfovibrio 占比最高，分別為11.59%和11.46%。地面流程（DM）中的SRB 共有19 種，在樣品微生物總量中占比54.57%，其中Desulfacinum 和Thermovirga 占比最高，分別為10.16%和15.20%。

圖1 SRB 豐度分布

圖2 揭示了該高溫油田中嗜熱型SRB 的相對豐度，產(chǎn)出井（CC）樣品中包含5 種嗜熱型SRB，分別為Archaeoglobus、Thermodesulfobacterium、Thermotoga、Thermovirga 和Thermodesulforhabdus，在樣品微生物總量中占比3.14%。與產(chǎn)出井相比，地面流程（DM）中新增了Desulfothermus 和Pseudothermotoga 兩種嗜熱SRB，共計7 種。這些嗜熱SRB 在樣品微生物總量中占比33.08%，其中Thermodesulfobacterium、Thermotoga、Thermovirga 及Thermodesulforhabdus 增幅顯著，占比由0.08%、1.14%、0.82%、0.01%分別增加至7.72%、2.17%、15.20%、6.72%。

圖2 耐溫嗜熱型SRB 豐度對比

如圖3 所示，地面流程組（DM）樣品的Chao1 指數(shù)、Observed species 值和PD whole tree 值均高于產(chǎn)出井（CC）樣品，表明地面流程組樣品的菌種豐富程度（菌種總數(shù)）高于產(chǎn)出井，而地面流程組樣品的Shannon 指數(shù)值低于產(chǎn)出井，意味著產(chǎn)出井的微生物多樣性更高，具有更大的發(fā)現(xiàn)新菌種的潛力。

圖3 產(chǎn)出井與地面流程組樣品微生物多樣性對比

3 結(jié)論

W 油田采樣位點處的SRB 數(shù)量較高，MPN 計數(shù)法結(jié)果顯示，產(chǎn)出井采樣點的SRB 數(shù)量為102～103個/mL，地面管線流程中的SRB 數(shù)量升高，達到104～106個/mL，呈現(xiàn)出空間差異性。高通量測序結(jié)果表明，W 油田水樣中的SRB 群落組成存在差異，在各個采樣位點中，均發(fā)現(xiàn)了高豐度的SRB，其為優(yōu)勢微生物類群，產(chǎn)出井樣品中SRB 的相對豐度為26.32%，管線流程中SRB 的相對豐度上升至54.57%，且耐熱菌種的占比增幅顯著。

4 討論

本研究運用高通量測序技術(shù)解析南海W 油田產(chǎn)出井和地面管線流程中的微生物多樣性及SRB群落組成。研究結(jié)果為深入了解該高溫油藏的微生物多樣性提供了重要的數(shù)據(jù)支撐，也加深了人們對酸敗的海上油田環(huán)境中SRB 群落組成及空間異質(zhì)性的認識。

然而，不同油田儲層的物理化學(xué)性質(zhì)差異較大，導(dǎo)致采出水的水質(zhì)、微生物群落組成差別也很大。同時，化學(xué)品的大量使用導(dǎo)致油氣儲層和開采系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得生物系統(tǒng)不穩(wěn)定，難以預(yù)測。因此，有必要在更長的時間尺度上開展對該油田內(nèi)源微生物多樣性的動態(tài)變化監(jiān)測。

油藏內(nèi)130 ℃的高溫并不能完全殺死SRB，這些微生物細胞可能會以芽孢休眠體的形式存在，在油藏內(nèi)不具有產(chǎn)生H2S 的代謝活性[5]。但隨著采出液的運移，井筒環(huán)境溫度逐漸降低，SRB 恢復(fù)代謝活性并開始生長繁殖，逐漸成為優(yōu)勢微生物種群，且多數(shù)為耐溫嗜熱型菌種（圖2）。圖中，Thermotoga 是嗜熱厭氧菌，能夠還原單質(zhì)硫、硫代硫酸鹽[6]；Thermodesulfobacterium，熱脫硫桿菌，為嗜熱菌，將單質(zhì)硫、硫酸鹽作為電子受體[7]；Thermovirga 能夠還原單質(zhì)硫， 但無法還原硫代硫酸鹽[8]；Pseudothermotoga 以單質(zhì)硫、硫代硫酸鹽為電子受體[9]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了除常見SRB 類群以外的其他產(chǎn)硫化氫微生物Deferribacteraceae 為嗜熱菌，可利用單質(zhì)硫作為電子受體[10]。上述這些硫/硫酸鹽還原微生物對該高溫油田次生硫化氫的貢獻值得研究。