俞悅,張宇,陳雨婷,倪心冉,趙衛(wèi)紅

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年腎科,南京 210029)

衰老會引起各器官功能減退,導致衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。腎臟是最容易衰老的器官之一[1],探究腎臟衰老的發(fā)生機制,對延緩腎臟衰老相關(guān)疾病的發(fā)生并尋找可能的治療靶點有重要意義。研究表明,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)水平隨年齡的增長而下降,煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)作為NAD+補救合成途徑的重要前體,具有抗炎、抗氧化、減少DNA損傷、恢復線粒體功能等作用,可延緩年齡相關(guān)的器官功能衰退[2]。然而,NMN在腎臟衰老中的作用機制尚不明確。因此,本研究采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)誘導小鼠腎臟衰老模型,初步探究NMN對D-gal誘導腎臟衰老的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要材料

24只SPF級雄性C57BL/6小鼠,6～8周齡,由南京醫(yī)科大學動物研究中心提供。飼養(yǎng)于溫度(22.0℃±2.0℃)、相對濕度(45%～55%)、特定光照周期(光照/黑暗:12h/12h)的通風環(huán)境中,所有實驗小鼠均可自由飲水進食。本研究中所有動物實驗相關(guān)操作均獲得南京醫(yī)科大學動物福利和倫理管理委員會批準。

D-gal、NMN(Sigma,美國);p16抗體(CST,美國);p21、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Proteintech,中國);β-肌動蛋白(β-actin)抗體(Servicebio,中國);衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-related β-galactosidase,SA-β-gal)染色試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白測定試劑盒(碧云天,中國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、模型建立及干預 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機分為4組:對照組;NMN組;D-gal組;D-gal+NMN組,每組6只。D-gal組給予D-gal[300mg/(kg·d)]頸背部皮下注射8周,建立衰老腎臟模型;NMN組給予NMN[100mg/(kg·d)]腹腔注射8周;D-gal+NMN組同時給予D-gal[300mg/(kg·d)]和NMN[100mg/(kg·d)]注射8周;對照組給予等量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)皮下注射8周。實驗中,小鼠定期稱量體質(zhì)量。造模完成后,麻醉處死各組小鼠,收集腎臟組織標本。

1.2.2 HE及Masson染色 將甲醛固定過夜的組織制成4μm石蠟切片,經(jīng)脫蠟、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、脫水封片,在顯微鏡高倍鏡視野下拍照觀察。Masson染色完成后,鏡下隨機選取15個視野,以單個視野下呈現(xiàn)藍色的區(qū)域(去除大血管)為膠原陽性表達,用Image Pro Plus 6.0分析陽性面積占比,取均值比較。

1.2.3 SA-β-gal染色 將冰凍切片按衰老染色試劑盒說明書進行染色,顯微鏡下可觀察到表達β-半乳糖苷酶的藍色區(qū)域,即為衰老染色陽性表達,運用Image Pro Plus 6.0分析陽性面積占比。

1.2.4 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟復水、抗原修復、血清封閉,一抗p16、p21(1∶100)4℃孵育過夜;次日加二抗,37℃孵育30min;二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木精復染,脫水后封片,光鏡下觀察棕黃色區(qū)域代表蛋白陽性表達,運用Image Pro Plus 6.0分析陽性面積占比。

1.2.5 Western blot 提取組織總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度及制樣。取20μg/孔蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),經(jīng)上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉,加一抗p16(1∶1000)、p21(1∶1000)、IL-β(1∶1000)、TNF-α(1∶1000)、SIRT1(1∶1000)、NF-κB(1∶1000),GAPDH(1∶100000)、β-actin(1∶1000)4℃孵育過夜。次日洗膜后加二抗(1∶20000)室溫孵育1h后,洗膜后曝光顯影,采用ImageJ v.1.8.0軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 NMN對D-gal誘導衰老小鼠體質(zhì)量的影響

實驗期間小鼠體質(zhì)量均隨時間而增加,但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),且組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05;圖1)。提示NMN對D-gal誘導衰老小鼠的體質(zhì)量未產(chǎn)生明顯影響。

圖1 4組小鼠體質(zhì)量變化情況

2.2 NMN對D-gal誘導衰老腎臟病理結(jié)構(gòu)的影響

HE染色可見,與對照組相比,D-gal組腎小球分布稀疏、球體縮小,腎小管管腔排列紊亂、明顯擴張;而D-gal+NMN組腎小球形態(tài)較前恢復,腎小管管腔排列規(guī)則,且擴張減少。Masson染色示,D-gal組腎臟膠原纖維含量較對照組和NMN組明顯增加,而D-gal+NMN組腎臟纖維化程度較D-gal組降低(P<0.05;圖2)。提示NMN可以改善D-gal誘導的腎臟衰老病理改變,并緩解腎臟纖維化。

圖2 4組小鼠腎臟組織病理變化

2.3 NMN對D-gal誘導衰老腎臟SA-β-gal活性及衰老相關(guān)基因表達的影響

對腎臟組織的衰老染色發(fā)現(xiàn),D-gal組較對照組及NMN組的SA-β-gal陽性率明顯增加,而D-gal+NMN組的SA-β-gal陽性率較D-gal組明顯減少(P<0.05;圖3A,圖3E),且SA-β-gal染色陽性主要分布在腎小管。結(jié)合免疫組化及Western blot發(fā)現(xiàn),與對照組及NMN組相比,D-gal組腎臟的衰老蛋白p16、p21表達增加,且主要位于腎小管;D-gal+NMN組的p16、p21表達較D-gal組明顯下調(diào)(P<0.05;圖3B,圖3C,圖3F,圖3G)。同時,Western blot示,與對照組相比,D-gal組抗衰老蛋白SIRT1表達下調(diào),而D-gal+NMN組的SIRT1的表達較D-gal組明顯增加(P<0.05;圖3D)。表明NMN干預可以降低D-gal誘導衰老腎臟的SA-β-gal活性和衰老蛋白的表達,并且促進抗衰老指標SIRT1表達。

圖3 4組小鼠腎臟組織衰老染色及衰老基因表達

2.4 NMN對D-gal誘導衰老腎臟組織炎癥相關(guān)指標的影響

為初步探討NMN對D-gal誘導腎臟衰老保護作用的機制,本研究采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,D-gal組腎臟炎癥指標TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達均顯著上調(diào)(P<0.05);與D-gal組相比,D-gal+NMN組腎臟組織TNF-α、IL-1β、NF-κB表達顯著下調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05;圖4)。提示NMN改善D-gal誘導的腎臟衰老可能是通過抑制NF-κB介導的炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用。

圖4 4組小鼠腎臟組織炎癥相關(guān)蛋白表達

3 討 論

腎臟衰老時會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的改變[3],包括腎小球硬化、腎小管擴張及腎間質(zhì)纖維化等病理改變。細胞衰老是腎臟衰老的重要驅(qū)動因素,且主要以腎小管細胞衰老為主[4]。D-gal可誘發(fā)嚙齒類動物產(chǎn)生類似自然衰老的表現(xiàn)[5]。本研究應(yīng)用D-gal誘導的腎臟衰老模型初步探討NMN對腎臟衰老的作用及其可能機制。

NAD+是氧化還原反應(yīng)的重要輔酶,參與新陳代謝、DNA損傷修復等過程[6]。NMN可以提高衰老體內(nèi)下降的NAD+水平,通過抗炎、線粒體保護等機制發(fā)揮對衰老神經(jīng)血管、眼、生殖系統(tǒng)等的保護作用[2]。既往研究顯示,補充NMN可提高老年小鼠腎臟中的NAD+和SIRT1水平,對急性腎臟損傷后的慢性腎臟纖維化有保護作用[7,8]。此外,NMN還可改善糖尿病腎病模型鼠的腎功能[9]。本研究中,給予D-gal模型小鼠NMN處理后,D-gal誘導的腎小球萎縮、腎小管纖維化等病理改變好轉(zhuǎn),SA-β-gal活性及p16、p21的表達水平顯著降低,表明補充NMN可以改善腎臟衰老。

全身慢性炎癥是衰老相關(guān)疾病的重要原因,包括腎臟衰老及慢性腎臟病[10]。SIRT1作為NAD+依賴的去乙?；?在調(diào)節(jié)細胞衰老及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。NMN對衰老腎臟和年齡相關(guān)疾病的保護作用依賴SIRT1的上調(diào)[8,9]。SIRT1與NF-κB信號通路以相互拮抗的方式維持細胞和組織內(nèi)的能量代謝和免疫反應(yīng)平衡。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1可以使NF-κB內(nèi)RelA/p65亞基的賴氨酸310位點去乙酰化,抑制NF-κB依賴性基因的轉(zhuǎn)錄活性和降低下游抗凋亡基因和促炎基因的表達。RelA/p65在賴氨酸310位點的去乙酰化還促進了賴氨酸314和315位點的甲基化,使RelA/p65發(fā)生泛素化和降解,對炎癥反應(yīng)起到抑制作用,如改善衰老血管的內(nèi)皮功能障礙[12,13]。調(diào)節(jié)SIRT1-NF-κB軸可降低肝炎中的炎癥反應(yīng),并且也被證實可以改善順鉑誘導的急性腎損傷[14,15]。在本研究D-gal誘導腎臟衰老模型中,可見炎癥因子增加,補充NMN可以下調(diào)炎癥因子,提示可能與改變SIRT1和NF-κB途徑有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),NMN處理后可以減低NF-κB,緩解SIRT1的下降。

綜上,衰老腎臟可見炎癥因子升高,SIRT1下調(diào),NF-κB上調(diào),通過補充NMN可以增加SIRT1,減輕炎癥反應(yīng),從而減輕腎臟衰老相關(guān)病理損傷,改善腎臟衰老,NMN緩解腎臟衰老的機制有待進一步研究。