次仁央宗, 王朝華

(西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院 消化科, 西藏 拉薩, 850000)

胃癌發(fā)病率高,其早期臨床癥狀不明顯,確診時(shí)多為晚期[1]。目前,胃癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等手段,但由于晚期、耐藥和復(fù)發(fā)率高,患者5年生存率較低[2]。胃癌已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有共價(jià)閉環(huán)的非編碼RNA,由于其環(huán)狀結(jié)構(gòu), circRNA非常穩(wěn)定,此外circRNA序列高度保守,并以組織或細(xì)胞特異性的方式表達(dá)[3-4]。研究[5]表明, circ_0000885在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào),可作為骨肉瘤預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。下調(diào)circ_0000885可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[6]。沉默circ_0000885可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力[7]。然而, circ_0000885在胃癌中作用的相關(guān)研究較少。此外,通過Circinteractome預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn),微小RNA(miR)-944在circ_0000885上有結(jié)合位點(diǎn)。研究[8]表明, miR-944在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下降,過表達(dá)miR-944可抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制其表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。盡管已有研究確定miR-944在胃癌中的作用,但circ_0000885在胃癌中的作用以及miR-944是否參與其調(diào)控作用還尚未闡明。因此,本研究探討circ_0000885在胃癌AGS細(xì)胞增殖和凋亡中的作用以及circ_0000885與miR-944之間是否存在靶向關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究共招募30例在本院收治的胃癌患者(2017年1月—2019年1月),患者術(shù)前均未接受放療和化療,手術(shù)獲得胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織后, -80 ℃保存,每例患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料

人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、N87、SNU-484購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù); 胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司; 由日本Takara公司提供Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒; 上海晶抗生物工程有限公司提供MTT和Annexin V-FITC/PI試劑盒; RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司; 美國(guó)Invitrogen公司提供Lipofectamine2000試劑。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AGS細(xì)胞,根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,將si-NC、si-circ_0000885、pcDNA、pcDNA-circ_0000885、miR-NC、miR-944、si-circ_0000885與anti-miR-NC、si-circ_0000885與anti-miR-944轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞,分別記為si-NC組、si-circ_0000885組、pcDNA組、pcDNA-circ_0000885組、miR-NC組、miR-944, si-circ_0000885+anti-miR-NC組或si-circ_0000885+anti-miR-944組,未處理的細(xì)胞設(shè)為NC組。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0000885和miR-944的表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,將合成的cDNA用作PCR擴(kuò)增的模板,分別以GAPDH和U6為內(nèi)參,檢測(cè)circ_0000885和miR-944的表達(dá)水平,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。circ_0000885上游引物: 5′-ACTGCCAGAAAGTGTGTCCC-3′; 下游引物: 5′-CGGGCCTCGTTTTGAACATC-3′。miR-944上游引物: 5′-GCCGAGAAATTATTGTACAT-3′; 下游引物: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。GAPDH上游引物: 5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′; 下游引物: 5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′。U6上游引物: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′; 下游引物: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5 MTT

取各組AGS細(xì)胞懸液(2.5×104個(gè)/mL), 96孔板每孔加入100 μL, 隨后向每個(gè)孔中加入20 μL MTT (5 mg/mL), 37 ℃孵育4 h, 棄細(xì)胞上清液,用DMSO溶解MTT晶體,并在450 nm處測(cè)量吸光度。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

收集各組細(xì)胞,重懸于1×結(jié)合緩沖液,并用Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)各5 μL, 在20 ℃下染色15 min, 通過FACScan流式細(xì)胞儀對(duì)樣品凋亡進(jìn)行分析。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

用1×細(xì)胞裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白。將每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)(50 μg)進(jìn)行電泳,并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。隨后5%脫脂牛奶封閉,一抗4 ℃孵育過夜。然后,山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。ECL底物試劑盒用于進(jìn)行信號(hào)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè), Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 circ_0000885和miR-944在胃癌組織中的表達(dá)

相較于癌旁組織,胃癌組織中circ_0000885高表達(dá), miR-944低表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。與GES-1細(xì)胞比較,胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、N87、SNU-484中, circ_0000885表達(dá)升高, miR-944表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。circ_0000885在AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平高于HGC-27、N87、SNU-48細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇AGS細(xì)胞,見表2。

表1 circ_0000885和miR-944在胃癌組織中的表達(dá)

表2 circ_0000885和miR-944在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 敲減circ_0000885對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組比較, si-circ_0000885組的circ_0000885表達(dá)降低, AGS細(xì)胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); NC組和si-NC組各指標(biāo)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表3。

A: 細(xì)胞凋亡流式圖; B: 增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。圖1 敲減circ_0000885對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表3 circ_0000885敲低對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 circ_0000885靶向調(diào)控miR-944的表達(dá)

通過Circinteractome的預(yù)測(cè), miR-944被發(fā)現(xiàn)在circ_0000885上有結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。轉(zhuǎn)染miR-944, WT-circ_0000885組的熒光素酶活性減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 但不影響MUT-circ_0000885組(P<0.05), 見表4。circ_0000885上調(diào)或下調(diào)可分別抑制和促進(jìn)細(xì)胞中miR-944的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表5。

圖2 circ_0000885的序列中含有與miR-944互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 circ_0000885調(diào)控miR-944表達(dá)

2.4 過表達(dá)miR-944對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-NC組比較, miR-944組的miR-944表達(dá)升高, AGS細(xì)胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); NC組和miR-NC組各指標(biāo)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表6。

表6 過表達(dá)miR-944對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 miR-944敲低逆轉(zhuǎn)了敲減circ_0000885對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

相較于si-circ_0000885+anti-miR-NC組, si-circ_0000885+anti-miR-944組的miR-944表達(dá)降低, AGS細(xì)胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平升高,凋亡率和Bax蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); si-circ_0000885組和si-circ_0000885+anti-miR-NC組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表7。

A: 細(xì)胞凋亡流式圖; B: 增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。圖3 過表達(dá)miR-944對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

A: 細(xì)胞凋亡流式圖; B: 增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。圖4 下調(diào)miR-944逆轉(zhuǎn)了敲減circ_0000885對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表7 下調(diào)miR-944逆轉(zhuǎn)了敲減circ_0000885對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

circRNA異常表達(dá)與胃癌的惡性表型密切相關(guān)。如circPTK2在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào),上調(diào)circPTK2可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而抑制circPTK2表達(dá)則效果相反[9]。circ_0000751低表達(dá)與胃癌患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、腫瘤體積和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈反比,過表達(dá)circ_0000751可抑制胃癌腫瘤的進(jìn)展、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。circPTK2表達(dá)下調(diào)與胃癌患者的低生存率相關(guān),過表達(dá)circPTK2在體內(nèi)外可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、集落形成、DNA合成、侵襲、異種移植瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移,而下調(diào)circPTK2則結(jié)果相反[11]。過表達(dá)或上調(diào)circDIDO1可抑制或促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[12]。circ_0006470在胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高,沉默circ_0006470可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13]。下調(diào)circ-HN1可通過miR-485-5p/GSK3A通路抑制胃癌進(jìn)展[14]。敲除circ_0091994可通過誘導(dǎo)凋亡降低胃癌細(xì)胞的活力[15]。circ-RNF111敲低可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,減弱細(xì)胞糖酵解、增殖以及移動(dòng)能力[16]。本研究中,胃癌組織和細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、N87、SNU-484中高表達(dá)circ_0000885, 敲減circ_0000885降低了AGS細(xì)胞OD值以及PCNA、Bcl-2 表達(dá)水平,升高了細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)水平,提示敲減circ_0000885可抑制AGS細(xì)胞增殖,并促進(jìn)凋亡。

研究[6]表明, circ_0000885可作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA調(diào)控微小RNA(miRNA)表達(dá)來影響骨肉瘤細(xì)胞的惡性行為。通過Circinteractome預(yù)測(cè)網(wǎng)站,本研究發(fā)現(xiàn), miR-944在circ_0000885上存在結(jié)合位點(diǎn),隨后,本研究證實(shí)miR-944是circ_0000885的靶基因,且circ_0000885負(fù)向調(diào)控胃癌細(xì)胞中miR-944的表達(dá)。研究[17]顯示, miR-944在人類多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用。肺腺癌組織和細(xì)胞低表達(dá)miR-944, 上調(diào)miR-944可抑制癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)。上調(diào)miR-944可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,而敲除miR-944表達(dá)則結(jié)果相反[18]。miR-944在三陰性乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá),其過表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的侵襲、遷移、和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。與既往研究一致,本研究也證實(shí)miR-944在為胃癌中發(fā)揮抗癌作用。胃癌組織和細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、N87、SNU-484中低表達(dá)miR-944, 過表達(dá)miR-944降低了AGS細(xì)胞OD值以及PCNA、Bcl-2 表達(dá)水平,升高了細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)水平。進(jìn)一步回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)miR-944逆轉(zhuǎn)了敲減circ_0000885對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響,OD值以及PCNA、Bcl-2 表達(dá)水平升高,凋亡率和Bax表達(dá)水平降低。

綜上所述,胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)circ_0000885, 低表達(dá)miR-944。miR-944是circ_0000885的功能靶標(biāo),敲低circ_0000885可通過靶向上調(diào)miR-944抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),提示circ_0000885可能是胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。但本研究?jī)H限于體外實(shí)驗(yàn),其在體內(nèi)的作用還有待進(jìn)一步研究。