馬權(quán)，陳永良，王楷峰，田偉

基于NK細(xì)胞亞群與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究

馬權(quán)，陳永良，王楷峰，田偉

紹興市中心醫(yī)院泌尿外科，浙江紹興 312000

探討自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞亞群和調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞在前列腺癌患者外周血中的表達(dá)及其與前列腺癌的關(guān)系。選取2020年9月至2022年2月紹興市中心醫(yī)院收治的51例前列腺癌患者作為觀察組，52例同期健康體檢者作為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組患者外周血中NK細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞比例，分析不同TNM分期和Gleason評(píng)分的前列腺癌中NK細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞表達(dá)差異及相關(guān)性。觀察組CD56brightCD16-、CD56dimCD16+明顯小于對(duì)照組（<0.05），Treg細(xì)胞水平明顯大于對(duì)照組（<0.05）；不同TNM分期和Gleason評(píng)分的前列腺癌患者CD56brightCD16-、Treg細(xì)胞水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示，CD56brightCD16-與前列腺癌TNM分期及Gleason評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（<0.05），Treg細(xì)胞與前列腺癌TNM分期及Gleason評(píng)分呈正相關(guān)（<0.05）。CD56brightCD16-水平的下降以及Treg水平的升高，與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可能成為臨床評(píng)估前列腺癌惡性程度及判斷預(yù)后的特異性指標(biāo)，為前列腺癌的診治提供新思路。

NK細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；前列腺癌；免疫功能；流式細(xì)胞術(shù)

目前前列腺癌已成為我國(guó)男性泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，對(duì)男性健康造成嚴(yán)重威脅[1]。越來(lái)越多的研究表明，前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)[2-3]。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是具有直接殺傷功能的天然免疫細(xì)胞，主要分為CD56brightCD16–和CD56dimCD16+亞群，具有監(jiān)視惡性病變細(xì)胞的作用，構(gòu)成了機(jī)體抗腫瘤的第一道防線。CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞是具有免疫抑制能力的T細(xì)胞，既能防止人體產(chǎn)生自身免疫性疾病，又能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[3]。目前，NK細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展各階段關(guān)系的探討有限。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，探究NK細(xì)胞亞群（CD56brightCD16–和CD56dimCD16+）和CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞在前列腺癌患者外周血中的表達(dá)情況及其與前列腺癌各階段的關(guān)系，以期為前列腺癌的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2020年9月至2022年2月紹興市中心醫(yī)院收治的51例前列腺癌患者作為觀察組，52例同期健康體檢者作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)前列腺穿刺活檢確診為前列腺癌；②在檢查前未接受過(guò)前列腺癌相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有急性或慢性炎癥；②患自身免疫性疾病或接受過(guò)免疫調(diào)節(jié)類藥物；③患有其他惡性腫瘤；④臨床資料不完整。本研究經(jīng)紹興市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2023倫審論第004號(hào)），研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

觀察組患者穿刺前抽取新鮮外周血，對(duì)照組人群體檢時(shí)空腹抽取新鮮外周血，兩組均以乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）抗凝。流式細(xì)胞儀：NovoCyte 2060R[安捷倫生物（杭州）有限公司]、DiagCyto[科技（浙江）有限公司]。檢測(cè)試劑：CD3、CD4、CD16、CD25、CD56、CD127檢測(cè)試劑及溶血素[科技（浙江）有限公司]。取抗體（不同項(xiàng)目加入不同抗體）加入流式管中，將混勻后的EDTA抗凝血樣本置于流式管底部，低速渦旋混勻，室溫下避光孵育15min。加入2ml（1×）UB Lysis solution置于流式管中，低速渦旋混勻，室溫下避光孵育15min。室溫下300×離心5min，棄去上清，加入2ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），低速渦旋混勻。室溫下300×離心5min，棄去上清，加入500μl 1%多聚甲醛。上機(jī)檢測(cè)，如無(wú)法立即檢測(cè)，將樣本放置在2～8℃下避光儲(chǔ)存（在細(xì)胞收獲/染色/裂解程序的24h內(nèi)完成），上機(jī)檢測(cè)前渦旋混勻。核查檢測(cè)項(xiàng)目包括NK細(xì)胞亞群（CD56brightCD16-、CD56dimCD16+）、Treg細(xì)胞（CD4+CD25+CD127low）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。觀察組前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）、Treg大于對(duì)照組，觀察組CD56brightCD16–、CD56dimCD16+小于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較（）

2.2 觀察組不同TNM分期及Gleason評(píng)分患者NK細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞水平比較

觀察組不同TNM分期及GLeason評(píng)分患者CD56brightCD16–、Treg細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），不同TNM分期及GLeason評(píng)分患者CD56dimCD16+比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見表2、表3。

表2 不同TNM分期前列腺癌患者外周血中NK細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞水平比較（）

表3 不同Gleason評(píng)分前列腺癌患者外周血中NK細(xì)胞亞群以及Treg細(xì)胞水平比較（）

2.3 NK細(xì)胞亞群與Treg細(xì)胞水平與前列腺癌TNM分期及Gleason評(píng)分的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD56brightCD16–與前列腺癌TNM分期及Gleason評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（<0.05），Treg細(xì)胞與前列腺癌TNM分期及Gleason評(píng)分呈正相關(guān)（<0.05），CD56dimCD16+與前列腺癌TNM分期及Gleason評(píng)分無(wú)顯著相關(guān)（>0.05），見表4。

表4 前列腺癌患者外周血中NK細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞水平與前列腺癌TNM分期及Gleason評(píng)分的相關(guān)性分析

3 討論

隨著人口老齡化、飲食習(xí)慣的改變，前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，已成為男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。目前已有研究表明，適應(yīng)性或先天性免疫細(xì)胞參與了前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療[4]。因此，及時(shí)了解前列腺癌患者免疫狀態(tài)具有十分重要的意義。

NK細(xì)胞是一種先天性淋巴細(xì)胞，占循環(huán)淋巴細(xì)胞5%～20%，具有細(xì)胞毒作用和免疫調(diào)節(jié)功能，無(wú)需致敏，即可非特異性地識(shí)別并快速消滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還能分泌細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)適應(yīng)性免疫抵抗腫瘤，在免疫監(jiān)視和免疫清除方面發(fā)揮重要作用。在人體內(nèi)，NK細(xì)胞由位于骨髓中的CD34+造血干細(xì)胞分化而來(lái)，主要特征為CD3-CD56+淋巴細(xì)胞群。根據(jù)CD56表達(dá)水平可分為CD56bright和CD56dim兩種亞型，CD56brightCD16-具有高分泌細(xì)胞因子的作用和較低的細(xì)胞毒性，而CD56dimCD16+具有更高的細(xì)胞毒性[5]。NK細(xì)胞抗腫瘤功能主要通過(guò)釋放穿孔素及顆粒酶裂解靶細(xì)胞、受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、分泌各種細(xì)胞因子及通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。NK細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活性的降低使得抗腫瘤能力弱化，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體患癌風(fēng)險(xiǎn)升高[6]。目前已有研究表明，較低的NK細(xì)胞活性與前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)升高及術(shù)后切緣陽(yáng)性密切相關(guān)，NK細(xì)胞水平的降低與前列腺癌進(jìn)展呈正相關(guān)[7-9]。有研究基于外周血NK細(xì)胞亞群的變化建立機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)，認(rèn)為其可能成為前列腺癌診斷的新方法。Koo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌患者中NK細(xì)胞亞群CD56brightCD16–的減少可能先于NK細(xì)胞活性值的降低，且隨著病情加重，CD56brightCD16–水平也隨之逐漸降低，這或許是NK細(xì)胞功能障礙背后的機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌患者外周血中CD56brightCD16–、CD56dimCD16+明顯低于健康人群，且隨著前列腺癌的進(jìn)展及Gleason評(píng)分的升高，CD56brightCD16–水平也隨之下降，這些NK細(xì)胞亞群的降低可能導(dǎo)致NK細(xì)胞活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。

Treg是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群，具有抑制自身免疫及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的作用，目前認(rèn)為CD4+CD25+CD127low是較理想的檢測(cè)Treg的分子表面標(biāo)志。近年來(lái)研究顯示，在多種實(shí)體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了浸潤(rùn)性Treg，其水平與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[11]。去除Treg細(xì)胞或封閉其抑制功能，可增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)，提示機(jī)體可能處于一種免疫抑制狀態(tài)，更是Treg細(xì)胞參與腫瘤免疫逃逸的有力佐證[12]。2006年，Miller等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織中的Treg細(xì)胞水平顯著升高，其具有免疫抑制作用，參與了早期前列腺癌的形成。Davidsson等[14]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中，Treg細(xì)胞水平往往與Gleason評(píng)分及病理分期呈負(fù)相關(guān)，并且Treg細(xì)胞的存在可能促使前列腺癌形成。此外，與健康人群相比，前列腺癌患者外周血中Treg細(xì)胞顯著升高，免疫抑制功能也更強(qiáng)[13，15-16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，前列腺癌患者外周血Treg細(xì)胞水平明顯升高，并且隨著前列腺癌的進(jìn)展及Gleason評(píng)分的升高，Treg細(xì)胞水平也隨之升高，提示前列腺癌患者免疫功能失調(diào)與外周血Treg細(xì)胞水平升高有關(guān)，前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展與機(jī)體免疫功能抑制有密切相關(guān)。

綜上所述，NK細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞能較好地反映前列腺癌患者免疫功能狀態(tài)，CD56brightCD16-和Treg參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，可能成為臨床評(píng)估前列腺癌惡性程度及判斷預(yù)后的特異性指標(biāo)，為前列腺癌的診治提供新思路。但是本研究是回顧性研究，樣本量較小，存在一定的偏差，因此，NK細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞在前列腺癌外周血的表達(dá)及相關(guān)性有待于大樣本、多中心的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Prostate cancer risk assessment based on NK cell subsets and regulatory T cells

Department of Urology, Shaoxing Central Hospital, Shaoxing 312000, Zhejiang, China

To investigate the expression of natural killer (NK) cell and regulatory T (Treg) cell in peripheral blood of patients with prostate cancer and their relationship with prostate cancer.Fifty-one patients with prostate cancer who were admitted to Shaoxing Central Hospital from September 2020 to February 2022 were selected as the observation group, and 52 healthy subjects who underwent physical examination during the same period were selected as the control group. Flow cytometry was used to detect the proportion of NK cell subsets and Treg cell in peripheral blood of the two groups, and to analyze the difference and correlation of NK cell subsets and Treg cell expression in prostate cancer with different TNM stages and Gleason score.The levels of CD56brightCD16-and CD56dimCD16+in the observation group were significantly lower than those in the control group (<0.05), and the levels of Treg cell were significantly higher than those in the control group (<0.05). There were significant differences in CD56brightCD16-and Treg cell levels in prostate cancer patients with different TNM stage and Gleason score (<0.05). Spearman correlation analysis showed that CD56brightCD16-was negatively correlated with TNM stage and Gleason score (<0.05), while Treg cell was positively correlated with TNM stage and Gleason score (<0.05).NK cell subsets and Treg cell can better reflect the immune function of prostate cancer patients and are closely related to the occurrence and development of prostate cancer. They may become specific indicators for clinical evaluation of the malignancy degree and prognosis of prostate cancer, and provide new ideas for diagnosis and treatment of prostate cancer.

NK cells; Regulatory T cells; Prostate cancer; Immune function; Flow cytometry

R737

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.29.003

浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床科研基金項(xiàng)目（2019ZYC-A146）；柯橋區(qū)社發(fā)類經(jīng)費(fèi)自籌科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020KZ07）

陳永良，電子信箱：729917300@qq.com

（2023–01–12）

（2023–09–05）