陳廷慧，曾加慶，羅煒華，王婭玲，龔 霄,*，魏長賓

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東 湛江 524001；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；5.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524001）

黃秋葵（Abelmoschus esculentusL.Moench）為錦葵科一年生單子葉草本植物，又稱金花葵、補(bǔ)腎草、羊角豆、咖啡黃葵、毛茄等，普遍分布于熱帶和地中海氣候地區(qū)，在我國江西、山東、廣東、云南等省份均有種植[1-2]。黃秋葵是一種菜、花兼用型植物，可供食用部分為其嫩果莢，肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，其嫩果富含蛋白質(zhì)、多糖、VC、粗纖維、游離氨基酸以及多種微量元素，汁液含有豐富的果膠、多糖等，具有保護(hù)胃黏膜、降血脂、抗疲勞、抗腫瘤等功效[3-6]。但黃秋葵采收期在5—9 月，此時氣溫較高，其果實表面積較大、氣孔發(fā)達(dá)，水分損失及呼吸消耗極快，常溫放置極易出現(xiàn)失水萎蔫、表皮霉變、果肉木質(zhì)化等問題，失去商品價值，這嚴(yán)重制約了我國黃秋葵的流通和發(fā)展[7-9]。

溫度是熱帶果蔬貯藏品質(zhì)和周期的重要影響因素之一，適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏能有效抑制果蔬貯藏過程的代謝活動，顯著減緩營養(yǎng)成分的流失，從而延長果蔬的貯藏期[10]。程志華等[11]通過測定不同貯藏溫度條件下番荔枝果實的生理生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)4 ℃貯藏可以有效減緩番荔枝木質(zhì)素的積累，較好地保持果實品質(zhì)，有效延緩果實木質(zhì)化現(xiàn)象。李宣林等[12]發(fā)現(xiàn)，筇竹筍采后極易老化腐爛，低溫處理可以有效減緩其木質(zhì)化進(jìn)程，延長貯藏周期。然而，在獼猴桃[13]、枇杷[14]、茄子[15]等果蔬的低溫貯藏研究中發(fā)現(xiàn)，低溫會刺激果蔬體內(nèi)木質(zhì)素的生物合成，嚴(yán)重影響果蔬的食用品質(zhì)。張碧青等[16]和辛松林等[17]研究了不同貯藏溫度對采后黃秋葵貯藏品質(zhì)的影響，結(jié)果均表明低溫貯藏（4～9 ℃）可以延緩黃秋葵采后貯藏期間發(fā)生的品質(zhì)劣變，顯著延長其貯藏周期。但是，不同貯藏溫度下黃秋葵采后品質(zhì)劣變和木質(zhì)化相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制尚未闡述清楚。本研究以黃秋葵為試驗材料，分別置于4 ℃和25 ℃下貯藏，探究不同貯藏溫度對黃秋葵采后營養(yǎng)品質(zhì)、木質(zhì)素含量、纖維素含量以及抗氧化酶活性的影響，以期為黃秋葵采后貯藏提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

黃秋葵，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所提供；無水乙醇、考馬斯亮藍(lán)、2,6-二氯靛酚、葡萄糖、溴乙酰、正己烷、冰醋酸、氫氧化鈉、鄰苯二甲醛、番紅O染色劑、固綠FCF染色劑、蒽酮、L-苯丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑等，均為市售分析純；聚乙烯（PE）塑料薄膜袋，購自河北網(wǎng)世包裝有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780型紫外可見分光光度計，日本島津公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；TP-214型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；3-30K型低溫高速離心機(jī)，德國Sigma公司；DHG-9033BS-III型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；BX53M型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；HT-7700型透射電子顯微鏡，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

選擇大小、成熟度基本一致，無病蟲害和機(jī)械損傷的黃秋葵果實，隨機(jī)分成兩組，每組200 個，分為3個平行，并用聚乙烯塑料薄膜袋（厚度0.03 mm，規(guī)格500 mm×800 mm）扎好，分別置于溫度4、25 ℃，相對濕度80%條件下貯藏。25 ℃處理在0、1、3、6、9、11、12 d取樣和測定相關(guān)指標(biāo)，4 ℃處理在0、3、7、9、13、17、21、23 d取樣用于各項指標(biāo)的測定，每個平行重復(fù)3次。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 失重率

采用稱量法進(jìn)行測定，計算公式如下：

1.2.2.2 果實細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

石蠟切片觀察：采用康云艷等[18]的方法制作切片，并用番紅-固綠染色劑染色，后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。番紅能夠?qū)⒅参锝M織木質(zhì)化的部分染成紅色，固綠則將富含纖維素組織的細(xì)胞壁染成藍(lán)綠色。透射電鏡觀察（TEM）：參考Deng 等[19]的方法制作切片。

1.2.2.3 葉綠素含量

參考謝宇奇[20]的方法進(jìn)行測定。

1.2.2.4 可溶性蛋白含量

參考曹建康等[21]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定。

1.2.2.5 VC含量

參考陳文烜[22]的測定方法，采用2,6-二氯靛酚滴定法進(jìn)行測定。

1.2.2.6 木質(zhì)素含量

參考陳發(fā)河等[23]的方法，并稍加修改。取3 g黃秋葵樣品，加5 mL 95%乙醇勻漿，4 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液，用95%乙醇清洗管底沉淀物3次，再用正己烷與無水乙醇體積比為2∶1的溶液清洗3次，置于50 ℃烘箱中干燥后，加入25%溴乙酰冰醋酸溶液使其溶解，70 ℃水浴加熱30 min，加入0.9 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，再加入0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸，并用冰醋酸定容至10 mL，然后以4 000 r/min離心5 min，吸取上清液用冰醋酸稀釋30倍后在280 nm處測定吸光度值，以O(shè)D280nm/g表示木質(zhì)素含量。

1.2.2.7 纖維素含量

參考曹建康等[21]的方法，采用蒽酮比色法測定。

1.2.2.8 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

參考王玲等[24]的方法進(jìn)行測定，以每克樣品每小時反應(yīng)體系在290 nm 處吸光度值變化0.01為一個酶活性單位（U）。

1.2.2.9 多酚氧化酶（PPO）活性

參照崔志寬[25]的方法。記錄反應(yīng)體系在波長420 nm 處的吸光度值，以每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活性單位（U）。

1.2.2.10 過氧化物酶（POD）活性

參照Giménez 等[26]的測定方法，以1 min 內(nèi)反應(yīng)體系在470 nm 處的吸光度值增加0.01 為1 個過氧化物酶活性單位（U）。

1.2.2.11 超氧化物歧化酶（SOD）活性

參照黃余年[27]的測定方法，以每克樣品在反應(yīng)體系中對氮藍(lán)四唑光化還原抑制率為50%時所對應(yīng)的SOD量為一個酶活性單位，結(jié)果以U/g表示。

1.2.2.12 過氧化氫酶（CAT）活性

參照Gao等[28]的方法，以240 nm處吸光度值每分鐘減少0.01作為一個CAT活性單位（U）。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2010 軟件統(tǒng)計和整理，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan法檢驗差異顯著性，并采用Origin 2022軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下黃秋葵失重率的變化

失重率是反映果蔬貨架品質(zhì)和采后失水程度的一項重要指標(biāo)，失重率越高表明果蔬體內(nèi)水分損失越嚴(yán)重。如圖1 所示，在整個貯藏期間，不同貯藏溫度的黃秋葵采后失重率均表現(xiàn)出上升的趨勢。黃秋葵在25 ℃貯藏條件下的失重率上升速度最快，貯藏12 d 時達(dá)到了28.7%，其果肉纖維化嚴(yán)重，此時不適于食用。而4 ℃貯藏條件下的黃秋葵果實貯藏23 d時失重率僅為26.6%。由此表明，低溫貯藏能夠顯著減緩黃秋葵體內(nèi)水分的流失，保持較好的品質(zhì)。

圖1 不同貯藏溫度下黃秋葵失重率的變化Fig.1 Changes of weight loss rate of okra at different storage temperatures

2.2 采后黃秋葵果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

從番紅-固綠染色的石蠟切片結(jié)果中可知，木質(zhì)化細(xì)胞呈紅色，纖維素細(xì)胞組織呈藍(lán)綠色。新鮮黃秋葵果實的細(xì)胞壁很薄，不同貯藏溫度下的果實細(xì)胞壁均出現(xiàn)了增厚（圖2），此結(jié)果與李永平等[29]的報道一致。與4 ℃貯藏的果實相比，25 ℃貯藏的果實細(xì)胞壁增厚顯著，木質(zhì)化細(xì)胞組織更多（圖2B和圖2C）。經(jīng)透射電鏡觀察，新鮮黃秋葵果實的細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿且完整，細(xì)胞壁顏色較淺（圖2D）。4 ℃和25 ℃貯藏后的果實細(xì)胞出現(xiàn)變形，大量木質(zhì)素顆粒沉積在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)，細(xì)胞壁呈現(xiàn)不均勻增厚，結(jié)果與程志華等[11]對番荔枝木質(zhì)化細(xì)胞的觀察結(jié)果一致。綜合觀察結(jié)果表明，低溫貯藏能有效抑制黃秋葵果實采后細(xì)胞壁的增厚，從而延緩果實采后木質(zhì)化進(jìn)程。

圖2 不同貯藏溫度下黃秋葵果實細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes of cell structure of okra fruits at different storage temperatures

2.3 不同貯藏溫度下黃秋葵葉綠素含量的變化

黃秋葵采后果皮顏色變化與葉綠素含量密切相關(guān)，總?cè)~綠素含量由葉綠素a和葉綠素b的含量共同決定。由圖3可以看出，在整個貯藏過程中，不同貯藏溫度下黃秋葵的葉綠素a（圖3A）、葉綠素b（圖3B）和總?cè)~綠素（圖3C）含量均呈現(xiàn)先增加后減少的特點。貯藏0～9 d 時，4 ℃貯藏的黃秋葵果實總?cè)~綠素含量高于25 ℃貯藏的黃秋葵，隨后4 ℃貯藏黃秋葵果實總?cè)~綠素含量急劇下降，最后降至0.074 mg/g，可能是低溫脅迫破壞了葉綠素超微結(jié)構(gòu)，使葉綠素被降解。結(jié)果表明，低溫能有效保留貯藏前期黃秋葵果實中的葉綠素含量。

圖3 不同貯藏溫度下黃秋葵葉綠素含量的變化Fig.3 Changes of chlorophyll content of okra at different storage temperatures

2.4 不同貯藏溫度下黃秋葵可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

可溶性蛋白質(zhì)參與果蔬體內(nèi)多種新陳代謝的調(diào)控過程，與其成熟、衰老、抗逆性等密切相關(guān)[30]。由圖4可知，兩組黃秋葵采后可溶性蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢，可能是果實體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成與分解相關(guān)酶在果實衰老過程中不斷調(diào)控的結(jié)果。25 ℃貯藏條件下，可溶性蛋白質(zhì)含量從初值0.59 mg/g 降至第12 天的0.24 mg/g；4 ℃條件下貯藏于第9天出現(xiàn)高峰（0.76 mg/g），隨后不斷降低，貯藏第23天降至0.39 mg/g。整體來看，在整個貯藏期間，4 ℃貯藏的黃秋葵果實的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于25 ℃處理組（P＜0.05）。因此，低溫可以延緩可溶性蛋白的損耗，更有利于保持黃秋葵的品質(zhì)。

圖4 不同貯藏溫度下黃秋葵可溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of soluble protein content of okra at different storage temperatures

2.5 不同貯藏溫度下黃秋葵VC含量的變化

VC 是一種還原劑，能夠清除果實內(nèi)部自由基。新鮮水果貯藏一段時間后，氧氣與VC氧化酶會破壞VC 的活性，導(dǎo)致VC 含量逐漸下降，因此貯藏時間越長，損失也越多[31]。由圖5 可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下黃秋葵的VC 含量均呈下降趨勢。貯藏12 d 時，25 ℃貯藏條件的黃秋葵果實VC含量下降了43.46%，而在4 ℃貯藏13 d的黃秋葵僅下降了10.25%，這主要是因為低溫抑制了VC氧化酶的活性，減緩了VC的損耗。在整個貯藏期間，4 ℃貯藏的黃秋葵VC 含量顯著高于25 ℃貯藏的黃秋葵（P＜0.05），說明4 ℃貯藏能夠有效減緩黃秋葵果實VC含量的損失，更好地保留其營養(yǎng)品質(zhì)。

圖5 不同貯藏溫度下黃秋葵VC含量的變化Fig.5 Changes of vitamin C content in okra at different storage temperatures

2.6 不同貯藏溫度下黃秋葵木質(zhì)素和纖維素含量的變化

木質(zhì)素和纖維素是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，是引起果蔬木質(zhì)化和纖維化的重要因素。由圖6可以看出，不同貯藏溫度下黃秋葵的木質(zhì)素和纖維素含量均隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)增加的趨勢。整體來看，25 ℃貯藏的黃秋葵木質(zhì)素和纖維素含量積累速率比4 ℃貯藏的要快，均在貯藏第9 天時達(dá)到峰值（7.23 OD280nm/g和9.25 mg/g），而4 ℃貯藏23 d的黃秋葵木質(zhì)素和纖維素含量分別為6.14 OD280nm/g和8.99 mg/g。結(jié)果表明，低溫貯藏能有效抑制黃秋葵果實木質(zhì)素和纖維素合成速率，較好地保持果實的商品價值。

圖6 不同貯藏溫度下黃秋葵木質(zhì)素（A）含量和纖維素（B）含量的變化Fig.6 Changes of lignin content(A)and cellulose content(B)of okra at different storage temperatures

2.7 不同貯藏溫度下黃秋葵PAL活性的變化

PAL 是催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在木質(zhì)素沉積中扮演著重要角色。由圖7可知，在整個貯藏期間，不同貯藏溫度下黃秋葵果實PAL活性均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。在25 ℃貯藏0～3 d時，黃秋葵果實PAL活性緩慢下降，隨后緩慢上升，至第9 天時活性最高（14.27 U/g），而后活性逐漸降低。4 ℃貯藏0～7 d 時，黃秋葵果實PAL 活性迅速下降，可能是較低的貯藏溫度有效抑制了果實體內(nèi)PAL活性，而隨后活性急劇上升，至第17天出現(xiàn)最大值（20.86 U/g），17 d 后活力逐漸下降。綜上可知，在貯藏過程中，黃秋葵果實PAL活性逐漸升高，木質(zhì)素合成增加，但在果實體內(nèi)合成大量木質(zhì)素之后，又會反饋抑制PAL 活性，防止木質(zhì)素的過度積累。在貯藏9 d 后，4 ℃貯藏的黃秋葵PAL 活性顯著高于25 ℃貯藏，可能是不適當(dāng)?shù)牡蜏丶ぐl(fā)了冷敏感黃秋葵果實中PAL活性，促進(jìn)了木質(zhì)素的合成，從而提高了果實的抗逆性，該結(jié)果與李甜竹等[32]的報道一致。

圖7 不同貯藏溫度下黃秋葵PAL活性的變化Fig.7 Changes of PAL activity of okra at different storage temperatures

2.8 不同貯藏溫度下黃秋葵抗氧化酶活性的變化

抗氧化酶對植物細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以減輕活性氧的傷害，且抗氧化酶和抗冷性呈正相關(guān)[33]。PPO是一類在植物中廣泛分布的含銅氧化還原酶，其活性與果實褐變程度有關(guān)。由圖8A可知，不同貯藏溫度的黃秋葵PPO 活性均隨貯藏時間延長整體呈波動上升的趨勢，這可能是果實體內(nèi)自身代謝不斷反饋調(diào)節(jié)的結(jié)果。貯藏0～13 d時，4 ℃貯藏的黃秋葵果實PPO活性顯著低于25 ℃組（P＜0.05）；貯藏第17 天時，4 ℃貯藏的PPO活性急劇上升至峰值（17.30 U/g），顯著高于25 ℃貯藏11 d 時的高峰值（16.00 U/g）（P＜0.05），可能與貯藏后期低溫環(huán)境引起果實體內(nèi)生理紊亂有關(guān)。綜上表明，4 ℃低溫貯藏可抑制黃秋葵果實PPO活性的上升，有利于延緩果實褐變進(jìn)程。

圖8 不同貯藏溫度下黃秋葵抗氧化酶活性的變化Fig.8 Changes of antioxidant enzyme activity of okra at different storage temperatures

POD、SOD、CAT 是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，可以清除活性氧和自由基，使其活性維持在較低水平，從而減輕對細(xì)胞組織的傷害，使果實采后耐貯性增強(qiáng)[34]。由圖8B可知，在整個貯藏期間，不同貯藏溫度的黃秋葵POD活性總體均呈現(xiàn)波動下降的趨勢。但是4 ℃貯藏的黃秋葵果實POD 活性在整個貯藏過程中顯著高于25 ℃組（P＜0.05），表明低溫貯藏能有效減緩POD 活性的降低，保持黃秋葵采后品質(zhì)。

如圖8C所示，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下黃秋葵SOD 活性均呈先上升后波動下降的趨勢，這可能與果實在成熟衰老過程中不斷進(jìn)行自我調(diào)節(jié)有關(guān)。在貯藏前期，不同貯藏溫度的黃秋葵果實SOD 活性急劇上升至最大值，25 ℃貯藏1 d 時出現(xiàn)峰值（1 535.99 U/g），4 ℃貯藏在第3 天時出現(xiàn)峰值（1 608.42 U/g），可能是果實采摘后出現(xiàn)傷口，促進(jìn)了自由基和過氧化氫的生成，誘導(dǎo)提高體內(nèi)SOD活性，增強(qiáng)果實的防御能力[35]。在整個貯藏期間，4 ℃貯藏的黃秋葵果實SOD 活性始終顯著高于25 ℃組（P＜0.05），表明低溫貯藏能使果實SOD 活性保持在相對較高的水平，從而保持較好的貯藏品質(zhì)。

圖8D 顯示了不同貯藏溫度的黃秋葵CAT 活性的變化，在整個貯藏期間，25 ℃貯藏的黃秋葵CAT活性表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，在貯藏第3 天時，出現(xiàn)最大值，為39.74 U/mg pro，可能是果實在貯藏過程中產(chǎn)生了較多的活性氧和自由基，誘導(dǎo)CAT的合成。4 ℃貯藏的黃秋葵CAT活性呈先下降后上升的趨勢，在貯藏第9天時活性最低（20.88 U/mg pro），貯藏21 d時達(dá)最高（48.75 U/mg pro），可能是果實在低溫環(huán)境中激發(fā)了CAT活性，進(jìn)而提高了果實的抗逆性。值得注意的是，在貯藏后期4 ℃貯藏的黃秋葵果實CAT活性顯著高于25 ℃貯藏（P＜0.05），說明低溫貯藏有助于保持較高的抗氧化酶活性，有利于清除黃秋葵體內(nèi)的活性氧和自由基，減輕其對細(xì)胞的傷害，從而延緩果實衰老進(jìn)程，保持較好的貯藏品質(zhì)。

3 結(jié)論

黃秋葵采后在常溫貯藏條件下極易出現(xiàn)失水、萎蔫、霉變、種子褐變、果肉嚴(yán)重木質(zhì)化等情況，影響其商品和食用價值。溫度是影響果蔬采后貯藏品質(zhì)的重要因素之一，適當(dāng)?shù)牡蜏啬芙档凸卟珊筚A藏期間的代謝活動，較好地保持其采后品質(zhì)，從而延長貯藏期。本研究結(jié)果表明，4 ℃貯藏能有效減緩黃秋葵果實采后水分損失，延緩可溶性蛋白和VC 的降解，抑制PAL和PPO活性的上升，抑制木質(zhì)素和纖維素的積累與葉綠素分解，保持較高的抗氧化酶（CAT、SOD、POD）活性，從而延緩黃秋葵果實木質(zhì)化、褐變等品質(zhì)劣變進(jìn)程，較好地保持了黃秋葵采后貯藏品質(zhì)，延長其貯藏期。本研究有利于推動黃秋葵保鮮技術(shù)的積極發(fā)展，為黃秋葵的貯藏保鮮提供了一定的理論支撐。