唐 婷,韋柳葉,黃金梅 綜述,唐乾利 審校

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,南寧 530000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院/桂西高發(fā)病防治重點實驗室,廣西百色 533000)

創(chuàng)面愈合是不利因素對機(jī)體造成的局部或大面積組織細(xì)胞損傷時出現(xiàn)的一種先天自適應(yīng)性防御反應(yīng),由多種信號相關(guān)通路及相關(guān)蛋白、因子相互作用。其中內(nèi)在和外在因素影響而愈合遲緩、中斷或停滯的非癌性創(chuàng)面被國際傷口感染協(xié)會(International Wound Infection Institute,IWII)稱為慢性創(chuàng)面。慢性難愈合創(chuàng)面具有病因復(fù)雜、并發(fā)癥多、病程長、復(fù)發(fā)率高等特點[1-2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),由基因控制的細(xì)胞自主有序的程序性死亡過程,即細(xì)胞凋亡,可及時清除體內(nèi)多余的細(xì)胞及受損細(xì)胞,調(diào)節(jié)機(jī)體正常發(fā)育和生命活動,在創(chuàng)面愈合過程中起著關(guān)鍵作用[3],且細(xì)胞凋亡的各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有一個共同的通路交匯點,而該交匯點受B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白調(diào)節(jié)。另有學(xué)者研究指出,可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白中凋亡抑制因子與凋亡誘導(dǎo)因子的比例抑制細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的目的。本文對Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控機(jī)制及其在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,以期為Bcl-2家族蛋白在慢性難愈性創(chuàng)面治療中的應(yīng)用提供參考。

1 Bcl-2家族蛋白

1.1 Bcl-2家族蛋白概述

1984年,Bcl-2基因被首次在人類B細(xì)胞淋巴瘤的第14號和第18號染色體易位斷裂點t(14,18)上分離獲得[4],且研究發(fā)現(xiàn)染色體易位使14號染色體上免疫球蛋白重鏈基因與Bcl-2基因異常融合形成的并列式頭尾結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致Bcl-2蛋白過度表達(dá)。1986年,有學(xué)者[5-6]成功克隆出Bcl-2轉(zhuǎn)錄的cDNA序列,并從其堿基序列中衍生出Aa序列。1988年,REED等[7]研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2基因具有潛在致癌性,并確認(rèn)其是一種原癌基因。此后大量研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2基因的編碼產(chǎn)物Bcl-2蛋白是細(xì)胞內(nèi)完整的膜蛋白,具有抗凋亡特性,能夠抑制線粒體活性氧產(chǎn)生,與細(xì)胞程序性死亡密切相關(guān),為后續(xù)研究Bcl-2蛋白與線粒體相關(guān)的細(xì)胞程序性死亡奠定了基礎(chǔ)[8]。另外,自Bcl-2被發(fā)現(xiàn)以來,又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Bcl-xL、Bcl-2相關(guān)X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein gene,Bax)等與Bcl-2高度同源的其他分子,它們具有與Bcl-2相似的成孔細(xì)菌毒素結(jié)構(gòu)域,且具有人工合成膜形成離子通道的能力,為Bcl-2的后續(xù)研究指明了新的方向[9-10]。

1.2 Bcl-2結(jié)構(gòu)與分類

Bcl-2基因存在于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上,相對分子質(zhì)量為26×103,全長約250 kb,由3個外顯子和2個啟動子組成,能夠被染色體易位機(jī)制激活,可編碼Bcl-2α和Bcl-2β兩種蛋白,其中Bcl-2α是抗凋亡作用的主要蛋白,可由p53、激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、活化T細(xì)胞核內(nèi)因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)和環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件(cAMP response element,CRE)等多種轉(zhuǎn)錄因子觸發(fā)。

截至目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)27種Bcl-2家族同源蛋白,并根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能將其分為兩類:一類是Bcl-2折疊蛋白,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、骨髓細(xì)胞白血病蛋白-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)、Bfl-1/A1、Bcl-B共6種抗凋亡蛋白及Bcl相關(guān)蛋白Bax、Bak、Bok共3種促凋亡蛋白;另一類是促凋亡“BH3-only”蛋白,包括Bim、Bad、Bmf、Bid、Bik、Noxa、Puma、Hrk等,僅含有促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性所必需的致死性結(jié)構(gòu)域BH3基因序列[11-15]。

2 Bcl-2在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜而精細(xì)的程序性細(xì)胞死亡過程,在胚胎發(fā)生、免疫、組織發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定維持等方面發(fā)揮著重要作用[16]。相關(guān)研究證實,細(xì)胞凋亡過度或凋亡過少等病理狀態(tài)均可誘發(fā)慢性難愈合創(chuàng)面、癌癥等的形成。Bcl-2作為與細(xì)胞凋亡最密切相關(guān)的基因,在多孔動物(海綿)、刺胞動物(?？?、珊瑚、水母)、扁殼動物及哺乳動物等多種多細(xì)胞動物中均有發(fā)現(xiàn),可通過啟動Bcl-2家族及半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族相關(guān)凋亡因子的釋放,以及與特定因子相互結(jié)合后控制線粒體外膜(mitochondrial outer membrane,MOM)的完整性而調(diào)控細(xì)胞凋亡過程[17-18]。

2.1 Bax/Bak的促凋亡作用

Bax和Bak是Bcl-2家族中發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用的主要蛋白,是調(diào)控線粒體細(xì)胞凋亡過程的重要組成部分[19]。正常情況下,Bax主要位于細(xì)胞質(zhì)中,Bak主要位于線粒體膜上,當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡刺激后,細(xì)胞質(zhì)中的Bax遷移并作用于MOM形成孔狀通道,使激活Caspase家族的凋亡因子逃逸,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Bak可直接在線粒體內(nèi)與自身或Bax蛋白結(jié)合形成線粒體跨膜通道而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.2 Bcl-2蛋白的抗氧化作用

相關(guān)研究顯示,Bcl-2蛋白過度表達(dá)和磷酸化均可減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)氧化物的形成,進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡,其作用機(jī)制可能與細(xì)胞生長、增殖、DNA修復(fù)有關(guān)。CHANVORACHOTE等[20]的實驗表明Bcl-2的抗氧化作用是間接的,即可能在于抑制超氧陰離子的產(chǎn)生而不是直接清除活性氧。細(xì)胞色素C作為呼吸鏈中重要的電子傳遞體,它從線粒體內(nèi)膜上的釋放會阻斷電子向下游傳遞并危及呼吸鏈的功能,導(dǎo)致超氧陰離子的加速產(chǎn)生。而Bcl-2蛋白可以抑制細(xì)胞色素C的釋放,從而通過抑制超氧陰離子的產(chǎn)生,進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡。此外,線粒體的巰基可能組成了細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位的傳感器,Bcl-2可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)等抗氧化劑的外泄,促進(jìn)谷胱甘肽進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),降低細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位,從而抑制細(xì)胞凋亡[21]。因此,Bcl-2蛋白的性質(zhì)遠(yuǎn)非僅僅是一種抗氧化劑。

2.3 Bcl-2、Bcl-X1和Bax的協(xié)同抗凋亡作用

Bcl-2家族蛋白在促進(jìn)細(xì)胞生長和生存方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,凋亡的內(nèi)在途徑主要是通過阻斷Bcl-2家族促凋亡蛋白,從而抑制細(xì)胞凋亡[22]。Bcl-2家族蛋白中Bcl-2、Bcl-X1和Bax相互作用,在線粒體上形成離子通道并降低線粒體膜通透性(mitochondrial membrane permeabiliti,MMP),進(jìn)而影響巨孔的形成。同時,細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)膜上釋放,激活Caspase-9,隨后細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子(Apaf-1)結(jié)合并激活Caspase-3,而活化的Caspases-3降解底物后,其蛋白降解產(chǎn)物又引起線粒體通透性改變,抑制線粒體釋放促凋亡蛋白,并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生[23-24]。

2.4 BH4結(jié)構(gòu)域維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定

Bcl-2蛋白的BH4結(jié)構(gòu)域主要是作為控制細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號的關(guān)鍵決定因素出現(xiàn)的,可特異性靶向作用于1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors,IP3Rs)和ryanodine受體(ryanodine receptors,RyRs)等多個細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運通道,促使Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)釋放至細(xì)胞基質(zhì),并介導(dǎo)Ca2+通過線粒體外膜進(jìn)入線粒體的電壓依賴性陰離子通道[25](voltage-dependent anion channels,VDACs)而維持線粒體內(nèi)鈣離子穩(wěn)定,阻止線粒體膜電位下降和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放,從而抑制細(xì)胞凋亡;亦或與膜糖蛋白復(fù)合物結(jié)合,形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜鈣通道,進(jìn)而抑制鈣介導(dǎo)的凋亡起始階段[26-27]。

3 Bcl-2在創(chuàng)面修復(fù)中的作用

近年來,關(guān)于創(chuàng)面修復(fù)的細(xì)胞凋亡機(jī)制成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點之一,細(xì)胞的增殖和凋亡參與調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中的多個環(huán)節(jié)而影響其預(yù)后。細(xì)胞凋亡是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象,就創(chuàng)面修復(fù)而言,一般經(jīng)歷炎癥期、肉芽組織形成期和上皮化的過程。組織損傷與修復(fù)的整個過程均有細(xì)胞凋亡機(jī)制參與,特別是上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞在組織修復(fù)中增殖與凋亡之間的平衡決定和影響著創(chuàng)面修復(fù)的進(jìn)程、結(jié)局和預(yù)后。細(xì)胞凋亡分為三個基本時相,即啟動(誘導(dǎo))相、效應(yīng)(調(diào)控)相、清除(降解)相。啟動相接受體內(nèi)外死亡信號指令如加熱、輻射、毒素、腫瘤壞死因子等,經(jīng)過凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Bcl-2途徑)到達(dá)效應(yīng)相。效應(yīng)相時眾多促凋亡和抗凋亡基因相互制約處于動態(tài)平衡中,一旦進(jìn)入清除相,Bcl-2激活Caspase-3,進(jìn)而激活核酸內(nèi)酶,激活的DNA酶游離出來使DNA降解,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28-29]。

關(guān)于創(chuàng)面愈合過程中細(xì)胞凋亡時的形態(tài)學(xué)及生化變化受Bcl-2家族調(diào)控的研究較多。鄭敏等[30]的研究顯示,糖尿病足創(chuàng)面的發(fā)生及發(fā)展可能與Bcl-2水平降低及Bax水平升高造成的組織細(xì)胞凋亡率上升有關(guān);李金鳳等[31]通過建立大鼠燒傷創(chuàng)面模型觀察油桐花水提物對燒傷創(chuàng)面Bcl-2、Bax表達(dá)水平的影響發(fā)現(xiàn),油桐花水提物可通過提高抗凋亡因子Bcl-2水平、降低促凋亡因子Bax水平而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合;曾娟妮等[32]的研究發(fā)現(xiàn),美洲大蠊提取液可通過提高Bcl-2水平、降低Bax及Caspase-3水平而調(diào)控透明質(zhì)酸和蛋白聚糖的表達(dá),促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面的愈合。這些研究表明促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax比例來調(diào)控細(xì)胞凋亡。

YAN等[33]的研究發(fā)現(xiàn),片仔癀可降低糖尿病潰瘍小鼠創(chuàng)面組織中活性氧自由基水平,促使ROS/Bcl-2/Bax/Caspase-3通路失活而減少表皮成纖維細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步驗證了Bcl-2蛋白過度表達(dá)可降低氧自由基的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。DING等[34]的研究顯示,經(jīng)Bcl-2修飾的脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)可上調(diào)Bcl-2及旁分泌因子水平,通過含孔支架遷移提高細(xì)胞存活率,延緩ADSCs凋亡,進(jìn)而促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合?？傮w而言,Bcl-2-ADSCs-scaffold可以有效加快愈合過程,促進(jìn)創(chuàng)面植入后的新生血管形成,縮短創(chuàng)面愈合時間。

4 小結(jié)與展望

隨著Bcl-2家族蛋白研究的不斷深入,越來越多的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族蛋白可通過Bax/Bak發(fā)揮促凋亡作用、抗氧化作用、協(xié)同促凋亡作用、維持細(xì)胞鈣離子穩(wěn)定等參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié),在創(chuàng)面修復(fù)和再生的不同階段發(fā)揮作用。但迄今為止有關(guān)Bcl-2/Caspase信號通路促進(jìn)創(chuàng)面愈合的應(yīng)用研究多停留在動物實驗層面,在人體中的應(yīng)用研究較少。

創(chuàng)面再生在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一直是一個迫切需要解決的問題,人們?yōu)榇送度肓舜罅康木蜁r間。在各種基因中過表達(dá)Bcl-2可以促進(jìn)細(xì)胞生存,誘導(dǎo)各種創(chuàng)面再生過程。同時,Bcl-2信號通路的激活可誘導(dǎo)多個信號通路發(fā)生相應(yīng)的變化,進(jìn)而參與創(chuàng)面愈合的整個過程,這是Bcl-2多效性效應(yīng)的基礎(chǔ)。鑒于Bcl-2在創(chuàng)面修復(fù)和再生的不同階段發(fā)揮著不同的作用,對創(chuàng)面修復(fù)的研究可能會集中抑制Bcl-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo),未來的治療有望在創(chuàng)面修復(fù)給予Bcl-2抑制劑,加速創(chuàng)面愈合進(jìn)程,減輕患者疼痛。進(jìn)一步研究Bcl-2可能是更容易實現(xiàn)創(chuàng)面再生的重要途徑,研發(fā)促進(jìn)Bcl-2生成劑的藥物應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù),未來也是一種無限可能。

綜上所述,Bcl-2在創(chuàng)面修復(fù)中體現(xiàn)的作用,不僅僅是通過升高Bcl-2的濃度,降低Bax水平,還可以通過各種外部因素刺激其活性,抑制下聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。目前大量研究比較散在,沒有形成網(wǎng)絡(luò)整體性研究,要么是終點研究,未見時效關(guān)系,對于創(chuàng)面更是如此,因此探索以Bcl-2為基點的具有網(wǎng)絡(luò)整體及時效性的研究可能是未來研究方向。