張紅艷,韓姍姍,冉淦僑,胡云紅,殷 紅,張 強

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所,陜西 西安 710043;2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心,陜西 西安 710043)

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展,我國畜禽養(yǎng)殖行業(yè)存在著疫病頻發(fā)、濫用抗生素、養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化等諸多問題。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告明確要求,退出除中藥外所有促生長類藥物飼料添加劑品種。隨著飼料禁抗令的正式出臺,以替代抗生素為核心優(yōu)勢與特點,如中草藥、生物發(fā)酵飼料、益生菌、酶制劑、酸化劑、植物提取物等一大批綠色、健康、安全的無抗飼料添加劑產(chǎn)品受到業(yè)界的高度關(guān)注。

天然植物中草藥具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用小、無抗藥性等優(yōu)勢,可在飼料中長期添加使用。我國《飼料原料目錄》收錄的中草藥包括黃柏、黃芩、苦參、金銀花、連翹、板藍根、魚腥草、紫蘇、蒲公英、柴胡、白芷等清熱解毒、抗菌消炎類中藥,也包括黃芪、山藥、當歸、杜仲、甘草、白術(shù)、黨參、仙茅等補虛扶正、調(diào)節(jié)陰陽類中藥,此外還有神曲、麥芽、谷芽、山楂、大蒜等理氣消食、健脾益胃類中藥。

中草藥富含的黃酮、多糖、苷類、生物堿以及揮發(fā)油等活性成分,具有抑菌殺菌、提高畜禽機體免疫力和抗氧化能力,且毒副作用小,在防治動物疾病方面具有十分理想的作用,在一定程度上能代替抗生素的使用。李秀富等[1]探究了復(fù)方中藥(CCM)對肉仔雞免疫性能的影響,結(jié)果表明:日糧中添加復(fù)方中藥(CCM)能提高肉雞的免疫器官指數(shù)和新城疫抗體效價,且添加1%CCM的試驗組效果最優(yōu)。劉玉華等[2]選用6種中藥對雞白痢沙門氏菌進行體外抑菌實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn):雞白痢沙門氏菌對黃芩、連翹、黃連3種藥物高度敏感,對夏枯草中度敏感。曹春雷等[3]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥提取物能顯著提高凌云烏雞的產(chǎn)蛋性能。夏軍[4]研究發(fā)現(xiàn)飼喂添加60 g/L的復(fù)方中藥制劑人工乳可治療豬流行性腹瀉。矯松君等[5]研究表明,發(fā)酵富鍺中藥對育肥豬的日糧養(yǎng)分消化率、生長性能和屠宰率均有顯著提高。隋鵬飛[6]觀察和研究了中藥代替抗生素治療豬氣喘病的作用,結(jié)果顯示采用復(fù)合中藥治療的病豬病情控制效果要優(yōu)于對照組,恢復(fù)速度快且精神狀態(tài)也較好。

中藥提取物是目前國際天然醫(yī)藥保健品市場上一種新的產(chǎn)品形態(tài),是采用先進的工藝技術(shù)對中藥材或中藥復(fù)方進行提取分離加工得到的一種藥效相對明確的中藥產(chǎn)品。大量研究表明,中藥提取物有效成分有生物堿、多糖、黃酮、皂甙、揮發(fā)油和有機酸等,添加在飼料中無毒、無公害、無殘留,大多還能促進動物免疫功能提高,表現(xiàn)良好的防病促生長性能,可成為抗生素或激素的替代品[7]。中藥提取物有著嚴格的質(zhì)量標準,又因其抗菌抗病毒作用強大、易控制、無毒副作用,日益被畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域高度重視。

本研究采用中藥提取物組配制成的復(fù)方中藥液對畜禽常見致病菌∶金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌進行抑菌研究,對比其抑菌敏感性,為下一步開發(fā)畜禽專用無抗生物飼料提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1中藥提取物

黃連提取物、薄荷提取物、桔梗提取物、黃芩提取物、蒲公英提取物、金銀花提取物、黃柏提取物、梔子提取物、連翹提取物、荊芥提取物、半夏提取物、甘草提取物、當歸提取物、杜仲提取物、茯苓提取物、懷牛膝提取物、白頭翁提取物、秦皮提取物、野菊花提取物、黃芪提取物、黨參提取物(10∶1)、魚腥草提取物、板藍根提取物、大蒜提取物、五倍子提取物、大青葉提取物、杏仁提取物,均為10∶1比例提取物,由西安天葉植物原料技術(shù)有限公司提供。

1.1.2畜禽4種致病菌

金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003、銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)CMCC(B) 10104、沙門氏菌CMCC(B) 50094、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124,由廣州市微生物研究所有限公司保藏提供。

1.1.3培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、強化梭菌瓊脂培養(yǎng)基,購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1復(fù)方中藥液的制備

按藥方比例分別稱取8種復(fù)方的中藥提取物,充分混合后,按1∶2(W/W)加入純凈水浸泡混勻,超聲震蕩20～30 min后,4℃靜置過夜。次日取出超聲震蕩10 min后放入45℃保溫1 h,7 000 r/min離心8 min,取上清液備用。

1.2.2菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌4種致病菌培養(yǎng)物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成濃度為1×108～9×108CFU/mL的試驗菌懸液。隨后將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)18～24 h后做活菌計數(shù);將產(chǎn)氣莢膜梭菌的新鮮培養(yǎng)物接種至強化梭菌瓊脂培養(yǎng)基上,37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h后做活菌計數(shù)。

1.2.3中藥液抑菌效果測定

采用牛津杯瓊脂擴散法測定中藥液的抑菌效果。取20 mL溫度不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基,注入直徑90 mm的無菌培養(yǎng)皿中,凝固,制成平板,作為底層。分別接種0.1 mL菌懸液至100 mL溫度不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基中,搖勻,制成接種菌培養(yǎng)基。在每一底層培養(yǎng)基中加入5 mL接種菌培養(yǎng)基,使在底層上均勻攤布,作為菌層。放置在水平臺上冷卻后,制成接種菌培養(yǎng)基平板。用鑷子將無菌牛津杯均勻地放入接種菌培養(yǎng)基平板上,每塊平板等距離放入4只牛津杯。往其中3只牛津杯中分別注入0.25 mL液體樣品,同時往第4只牛津杯中注入0.25 mL液體培養(yǎng)基作為空白對照。操作完畢后,將接種金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌的平板平放于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h,將接種產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板平放于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)18～24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,測量各個抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種復(fù)方中藥液對畜禽常見致病菌的抑菌結(jié)果對比

實驗中藥復(fù)方依據(jù)中獸藥古方、化裁已有成方,由若干種中藥提取物組配而成,HLJDS、YQH、BTWS、WWXDY、YJL、QWT、SBZ、PHBQC主要成分詳見表1。

表1 8種中藥復(fù)方的提取物成分

按照1.2.1節(jié)的方法制備得到生藥濃度為0.5 g/mL的8種復(fù)方中藥液,對比藥液在同一濃度下對畜禽常見致病菌∶金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌結(jié)果,詳見表2。抑菌結(jié)果判定方法按《中藥藥理學》中的標準判定,抑菌直徑達到20 mm及以上的為極敏記為“++++”;15～19 mm為高敏,記為“+++”;10～14 mm為中敏,記為“++”;10 mm及以下為低敏,記為“+”;“-”表示無抑菌作用。

表2 不同復(fù)方中藥液對畜禽四種致病菌的抑菌結(jié)果

由表2可知,8種復(fù)方中藥液對4種致病菌試驗株呈現(xiàn)出不同的抑菌效果。中藥液對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用要明顯優(yōu)于綠膿桿菌和沙門氏菌?？梢钥闯?HLJDS、YQH、BTWS、WWXDY、QWT、SBZ、PHBQC藥液對產(chǎn)氣莢膜梭菌試驗菌株表現(xiàn)出極敏的抑菌活性,YJL藥液對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑菌活性為高敏;HLJDS藥液對金黃色葡萄球菌抑菌活性為極敏,YJL藥液對金黃色葡萄球菌試驗菌株無抑菌活性,其余6種均對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出中敏抑菌活性;HLJDS對綠膿桿菌試驗菌株有一定的抑菌作用,其余7種藥液均無抑制作用;除了HLJDS、QWT對沙門氏菌試驗菌株有中敏的抑菌活性之外,其余6種均無抑制作用。

從結(jié)果上來看,對試驗菌株有廣泛抑菌作用的是HLJDS,其對4種致病菌均有較好的抑菌效果,其次是QWT,對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌有一定的抑菌作用。HLJDS、QWT平板抑菌圈具體如圖1和圖2所示。

圖1 HLJDS中藥液的平板抑菌圈

圖2 QWT中藥液的平板抑菌圈

2.2 8種復(fù)方中藥液對單一致病菌的抑菌作用分析

金黃色葡萄球菌作為革蘭陽性菌的代表,它可引起動物的皮膚軟組織感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、腸炎等疾病,且易傳染,治愈率低,給畜禽養(yǎng)殖造成極大的經(jīng)濟損失[8]。綠膿桿菌,也稱銅綠假單胞桿菌,是一種條件性致病菌,常分布于潮濕環(huán)境中,也可存在于人和動物的皮膚、呼吸道和腸道等部位,是引起創(chuàng)傷感染最常見的病原,現(xiàn)已有能引起羊化膿性肺炎、雞急性敗血死亡等的報道,嚴重危害養(yǎng)殖場經(jīng)濟效益[9]。沙門氏菌是人獸共患病原菌,是一種常寄居于人類和動物腸道中的革蘭氏陰性胞內(nèi)兼性厭氧菌,它不僅能夠引起畜禽的各種疾病,還能夠通過污染的畜禽產(chǎn)品,威脅人類健康[10]。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種廣泛存在于動物腸道中的革蘭氏陽性菌,易引起畜禽壞死性腸炎。當畜禽受到外源性產(chǎn)氣莢膜梭菌感染后,產(chǎn)氣莢膜梭菌能在腸道快速繁殖,導(dǎo)致組織腫脹壞死,并產(chǎn)生大量可致畜禽死亡的外毒素[11]。8種復(fù)方中藥液對4種致病菌的抑菌效果詳見圖3。

圖3 不同復(fù)方中藥液對畜禽主要致病菌的抑菌作用

實驗所選致病菌:金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌是畜禽養(yǎng)殖上危害較大的致病菌。

由圖3可以看出,8種中藥液對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用大小依次為:HLJDS>BTWS>WWXDY=SBZ=PHBQC>YQH=QWT>YJL,抑菌直徑范圍為17～32 mm,均達到高敏以上,其中HLJDS抑菌效果最好,YJL抑菌作用略弱;對金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果為:YQH和YJL沒有呈現(xiàn)出抑菌效果,其余6種中藥液的抑菌作用大小順序依次為:HLJDS>WWXDY>BTWS=SBZ>QWT>PHBQC,HLJDS抑菌直徑為極敏22.3 mm,抑菌略弱的PHBQC直徑為中敏11.0 mm。除此之外,對綠膿桿菌有一定抑菌效果僅有HLJDS,抑菌直徑為12.0 mm,對沙門氏菌有一定抑菌效果的是QWT和HLJDS,抑菌直徑分別為12.6 mm和12.0 mm。

分析HLJDS的廣譜抗菌性跟其主要成分黃芩、黃連、黃柏有關(guān)。黃芩、黃連、黃柏是中醫(yī)臨床常用的清熱解毒燥濕藥,具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。三者常相互配合,以提高清熱解毒的力度,因此被稱為三黃。而QWT中的魚腥草、黃芩、金銀花、連翹、板藍根、甘草具有清熱解毒、疏散風熱作用,常用作抗病毒、抗炎藥物。組方抑菌效果跟提取物的質(zhì)量、復(fù)合比例以及制劑形態(tài)也有一定的關(guān)系,下一步還將開展中藥復(fù)方對畜禽常見病毒(雞新城疫、禽流感、豬腹瀉病毒)的抗病毒研究。

3 結(jié)論

中草藥是一個健康綠色食品、安全可靠、無環(huán)境污染的飼料生產(chǎn)營養(yǎng)添加劑,已被人們廣泛地關(guān)注與研究,在獸醫(yī)學中具有極高的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景[12]。

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌為畜禽養(yǎng)殖常見致病菌,研究中藥提取物構(gòu)成的中藥復(fù)方對致病菌的體外抑菌活性具有重要意義。結(jié)果顯示,8種復(fù)方藥液對產(chǎn)氣莢膜梭菌均表現(xiàn)極敏或高敏的抑菌活性,抑菌直徑范圍為17～32 mm;HLJDS、WWXDY、BTWS、SBZ、QWT、PHBQS對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出中敏以上的抑菌活性,抑菌直徑范圍為11～22.3 mm;HLJDS對綠膿桿菌試驗菌株有一定的抑菌作用,抑菌直徑為12.0 mm;HLJDS、QWT對沙門氏菌試驗菌株有中敏的抑菌活性,抑菌直徑分別為12.6 mm和12.0 mm。

從抑菌廣譜性來說,HLJDS的抑菌效果最好,其對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均有抑菌活性;其次QWT對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌也有抑菌活性。

中國國家飼料研究所在《21世紀中國飼料工業(yè)可持續(xù)發(fā)展與飼料工業(yè)科技》及中國飼料工業(yè)協(xié)會在《加入WTO對我國飼料工業(yè)的影響及對策》中均指出,中國應(yīng)該大力發(fā)展以中藥提取物為原料的飼料添加劑、預(yù)混料、保健品等。在下一步飼用抗生素替代品的研發(fā)中,可根據(jù)畜禽具體致病菌來選擇需要的中藥或者中藥提取物復(fù)方與益生菌、酶制劑共同研發(fā)畜禽無抗飼料添加劑產(chǎn)品。