孟勇，蔣維榮，李瑞，徐鎮(zhèn)，陳文浩，李志文

（1. 西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院普外四科，陜西 西安 710018；2. 西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710069）

代謝相關(guān)脂肪性肝?。╩etabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是一種非明確損肝因素所致的，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪過(guò)度沉積為病理學(xué)特征的臨床綜合征，其與2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性、心血管疾病顯著相關(guān)，可直接導(dǎo)致肝硬化和肝癌［1-3］。近年來(lái)，MAFLD的發(fā)病率逐年上升，全球患病率已高達(dá)25.24%，是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的肝病類型，嚴(yán)重威脅著人類的健康，被公認(rèn)為21世紀(jì)主要的健康負(fù)擔(dān)之一［4］。

MAFLD是一組高度異質(zhì)性疾病，其發(fā)生發(fā)展的影響因素眾多，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。隨著腸-肝軸概念的提出，多項(xiàng)研究［5-7］顯示，腸道菌群紊亂與MAFLD的發(fā)生顯著相關(guān)。但因腸道菌群與MAFLD的關(guān)聯(lián)受到多種混雜因素和反向因果關(guān)聯(lián)的影響，使其在傳統(tǒng)的流行病學(xué)研究中的因果推斷受到限制［8］。腸道菌群與MAFLD之間是否存在因果關(guān)系尚不清楚。孟德?tīng)栯S機(jī)化研究方法可以有效地避免觀察性研究中的混雜因素、反向因果關(guān)系，以及RCT研究中的代表性、可行性等問(wèn)題［9］。然而，目前尚未見(jiàn)通過(guò)孟德?tīng)栯S機(jī)化方法來(lái)評(píng)估MAFLD與腸道菌群之間因果關(guān)系的研究報(bào)道。因此，本研究采用孟德?tīng)栯S機(jī)化的方法，利用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）作為工具變量（instrumental variables， IV），探索腸道菌群與MAFLD之間的因果關(guān)系，以期為MAFLD的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

獲取GWAS的匯總數(shù)據(jù)，采用雙樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化分析腸道菌群和MAFLD的因果關(guān)系。腸道菌群的IV來(lái)自MiBioGen聯(lián)盟中Kurilshikov等［10］的研究，數(shù)據(jù)包括美國(guó)、英國(guó)、韓國(guó)等12個(gè)國(guó)家的18 473個(gè)人16S rRNA基因測(cè)序圖譜和全基因組基因分型數(shù)據(jù)，在門、界、目、科、屬5個(gè)水平共獲取122 110變異位點(diǎn)。

MAFLD的GWAS數(shù)據(jù)來(lái)自Ghodsian等［11］的GWAS薈萃分析研究，該研究匯總分析了eMERGE、FinnGen、Estonian Biobank和FinnGen隊(duì)列的GWAS數(shù)據(jù)，納入MAFLD 8 434例，正常人群770 180例。

1.2 IV的選擇

為了確保腸道微生態(tài)與MAFLD間因果關(guān)系結(jié)論的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，研究采用如下的篩選條件選擇最佳的IV，① 為獲得更加全面的數(shù)據(jù)，從腸道菌群的GWAS數(shù)據(jù)中選擇與腸道菌群最具相關(guān)性的SNP，選取P<5×10-5的SNP；② 基于MR的獨(dú)立性假設(shè)，各個(gè)SNP需相互獨(dú)立，為確保各IV間不存在連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），設(shè)定LD系數(shù)R2為0.001，域?qū)挾葹?0 000 kb；③ 為確保同一SNP在腸道菌群組和MAFLD組具有相同的等位基因，去除了回文SNP；④ 當(dāng)MAFLD的GWAS數(shù)據(jù)中不存在與腸道菌群相關(guān)的SNP時(shí)，為確保結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，刪除無(wú)替代位點(diǎn)的IV。流程如圖1示。

圖1 流程圖

1.3 孟德?tīng)栯S機(jī)化（mendelian randomization MR）假設(shè)

根據(jù)孟德?tīng)栯S機(jī)化分析要求，遺傳變異作為IV需滿足以下三個(gè)核心假設(shè)：① 獨(dú)立性假設(shè)：所選IV獨(dú)立于影響腸道菌群和MAFLD的混雜因素；② 關(guān)聯(lián)性假設(shè)：IV與腸道菌群必須有很強(qiáng)的相關(guān)性。通過(guò)計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量用以評(píng)估工具變量與暴露因素之間的相關(guān)性強(qiáng)度，F(xiàn)>10認(rèn)為滿足關(guān)聯(lián)性假設(shè)；③ 排他性假設(shè)：IV只能通過(guò)腸道菌群影響MAFLD，而不能通過(guò)其他途徑，即IV與MAFLD之間不應(yīng)存在水平多效性（圖2）。

圖2 核心假設(shè)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.3.0中TwoSample MR 和MR-PRESSO等R包進(jìn)行MR分析和敏感性分析。

1.4.1 MR分析 本研究采用反向方差加權(quán)，MR-Egger回歸和加權(quán)中位數(shù)3種方式進(jìn)行MR分析，推斷腸道菌群和MAFLD是否存在因果關(guān)系。當(dāng)不存在水平多效性時(shí)，以IVW分析結(jié)果為主，其特點(diǎn)是回歸分析時(shí)不考慮截距項(xiàng)并且用結(jié)局方差的倒數(shù)作為權(quán)重來(lái)進(jìn)行擬合。根據(jù)是否存在異質(zhì)性，在IVW檢驗(yàn)選擇固定或隨機(jī)效應(yīng)模型。MR-Egger回歸即使在所有的IV都具有基因多效性的情況下也可以得到一致性的估計(jì)，加權(quán)中位數(shù)法的優(yōu)勢(shì)主要是：即使有超過(guò) 50% 的無(wú)效工具變量，仍可以一致性地估計(jì)因果關(guān)系。因此，研究將MR-Egger回歸和加權(quán)中位數(shù)則作為補(bǔ)充的方法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4.2 敏感性分析 通過(guò)Cochran′s Q統(tǒng)計(jì)量來(lái)檢驗(yàn)異質(zhì)性。采用MR-PRESSO方法對(duì)離群值進(jìn)行檢測(cè)，若存在離群值，則將其剔除，并重新進(jìn)行分析。通過(guò)MR-Egger進(jìn)行水平多效性檢驗(yàn)，若MR-Egger分析中的截距項(xiàng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性意義，則表明該研究具有明顯的水平多效性。通過(guò)“留一法”評(píng)估MR結(jié)果的穩(wěn)定性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 工具變量選擇結(jié)果

通過(guò)對(duì)腸道菌群GWAS數(shù)據(jù)的篩選，共選擇14 551個(gè)SNP作為IV，來(lái)代替211種腸道菌群，包括五個(gè)生物學(xué)分類，其中9個(gè)門、16個(gè)綱、20個(gè)目、35個(gè)科和131個(gè)屬，每個(gè)工具變量均滿足F>10。

2.2 MR分析

IVW結(jié)果顯示：乳酸桿菌科（OR=0.830，95%CI0.708~0.973，P<0.05），克里斯滕森菌屬R7群（OR=0.737，95%CI0.589~0.920，P<0.01），羅氏菌屬（OR=0.501，95%CI0.732~0.989，P<0.05）可能是MAFLD發(fā)生的保護(hù)因素，而放線菌科（OR=1.250，95%CI1.020~1.532，P<0.05），草酸桿菌科（OR=1.101，95%CI1.007~1.205，P<0.05），放線菌目（OR=1.250，95%CI1.020~1.533，P<0.05），NB1n目（OR=1.110，95%CI1.006~1.226，P<0.05），瘤胃球菌科UCG-005群（OR=1.181，95%CI1.013~1.377，P<0.05）可能是MAFLD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。同時(shí)放線菌科，放線菌目，克里斯滕森氏菌屬R-7群和MAFLD的關(guān)系還得到了Weighted median的結(jié)果支持。此外，Weighted median結(jié)果提示副薩特氏菌屬可能也MAFLD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但在IVW和MR Egger中未得到顯著性結(jié)果（表1）。

表1 MR分析結(jié)果

2.3 敏感性分析

通過(guò)Cochran′s Q統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)提示P<0.05，各合并的工具變量間無(wú)顯著異質(zhì)性，IVW均采用固定效應(yīng)模型。通過(guò)MR-PRESSO方法對(duì)離群值進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示P>0.05，未檢測(cè)到離群值。通過(guò)MR-Egger進(jìn)行水平多效性檢驗(yàn)，結(jié)果未顯示出現(xiàn)水平多效性，P>0.05（表2），并且通過(guò)留一法評(píng)估MR結(jié)果的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示不存在單個(gè)SNP對(duì)研究結(jié)果的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響效應(yīng)，因此認(rèn)為腸道菌群和MAFLD的MR分析結(jié)果具有穩(wěn)定性。

表2 MR敏感性分析

3 討論

20世紀(jì)80年代，Drenick教授在接受腸旁路手術(shù)的患者中觀察到肝脂肪變性與腸道菌群的異常顯著相關(guān)，這意味著腸道菌群的改變可能影響MAFLD的發(fā)生和發(fā)展［12］。近年來(lái)，有學(xué)者提出腸-肝軸學(xué)說(shuō)以解釋這種關(guān)聯(lián)，腸-肝軸是腸道生態(tài)通過(guò)門靜脈血流和肝臟形成聯(lián)系、相互影響的學(xué)說(shuō)，腸道菌群可以通過(guò)多種機(jī)制影響MAFLD的發(fā)生和發(fā)展，如改變腸道的通透性、改變能量的攝取、調(diào)節(jié)膽堿代謝和膽汁酸的生成。此外，部分腸道菌群可以發(fā)酵碳水化合物形成內(nèi)源性乙醇，刺激炎癥信號(hào)加重肝臟損傷，加速M(fèi)AFLD的發(fā)展［6，13-14］。

隨著腸-肝軸學(xué)說(shuō)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道菌群在MAFLD的發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色［15］，但是MAFLD的發(fā)生與肥胖、糖尿病、高脂血癥、胰島素抵抗及遺傳易感等諸多因素相關(guān)。目前的多數(shù)腸道菌群和MAFLD相關(guān)性的研究不僅受到上述混雜因素的影響，而且多為病例對(duì)照研究［16-18］，并不能有效闡明兩者的因果關(guān)系。因此，采用雙樣本MR方法，從門、綱、目、科、屬全5個(gè)生物學(xué)層面評(píng)估腸道菌群與代謝性脂肪肝的因果關(guān)系。結(jié)果顯示乳酸桿菌科、克里斯滕森菌屬R7群、羅氏菌屬可能是MAFLD發(fā)生的保護(hù)因素，而放線菌科、草酸桿菌科、放線菌目、NB1n目、瘤胃球菌科UCG-005群可能MAFLD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，這與Yang等［19］的研究結(jié)果一致。

不同的腸道菌群可能通過(guò)不同的通路和機(jī)制影響MAFLD。乳酸桿菌科主要依賴于Toll樣受體2和蛋白激酶C，對(duì)腸上皮屏障功能具有保護(hù)作用，改變腸道的通透性減少來(lái)自腸道的有害物質(zhì)對(duì)肝臟的影響。此外，乳酸桿菌可以抑制HMG-CoA還原酶，減少腸道對(duì)膽固醇的吸收，降低血清膽固醇和三酰甘油［20］，從而降低MAFLD的發(fā)生率?？死锼闺鷮儆诤癖诰T，2012年首次被發(fā)現(xiàn)并命名，其作用機(jī)制尚不清楚［21］，但多項(xiàng)研究［22-24］顯示，克里斯滕森菌與體內(nèi)三酰甘油水平降低及高密度脂蛋白水平升高呈顯著正相關(guān)，而與總膽固醇、低密度脂蛋白和載脂蛋白B升高呈負(fù)相關(guān)。因此，克里斯滕森菌被認(rèn)為是新一代的益生菌。目前，針對(duì)單一菌群和MAFLD相關(guān)性的研究較少，暫未見(jiàn)NB1n目、克里斯滕森氏菌屬R-7群、副薩特氏菌屬和瘤胃球菌科UCG-005群與MAFLD的研究報(bào)道，其影響機(jī)制尚不完全清楚，值得進(jìn)行研究。

本研究分析了來(lái)自大樣本量的GWAS匯總數(shù)據(jù)，MR具有較強(qiáng)遺傳因果推理能力，因此本研究結(jié)果應(yīng)該是可靠的，但仍具有一定的局限性。第一，本研究中的GWAS匯總數(shù)據(jù)多來(lái)自歐洲，其結(jié)論推廣到其他種族和地區(qū)的個(gè)體時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎。第二，由于數(shù)據(jù)來(lái)自不同人群，結(jié)果可能會(huì)受到一些混雜因素的影響，未來(lái)可能需要對(duì)同一人群的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。第三，由于缺少符合MR研究假設(shè)的腸道菌群相關(guān)的數(shù)據(jù)，因此未進(jìn)行反向MR分析。

綜上所述，本研究揭示了腸道菌群與MAFLD的因果關(guān)系，篩選出與MAFLD相關(guān)的腸道菌群，這些菌群可能成為新的生物標(biāo)志物，為MAFLD的預(yù)防和治療提供新的思路，并且有助于加深對(duì)腸-肝軸的認(rèn)識(shí)和理解。