鈕谷雨，喬晨萌，權(quán)威，張梅宣，趙麗萍，申延琴*

（1.無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214122； 2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷實驗室，江蘇 無錫 214122）

神經(jīng)炎癥在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，而星形膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS中重要的免疫細(xì)胞之一，它的激活也是誘發(fā)神經(jīng)炎癥的因素之一。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有重要的穩(wěn)態(tài)功能，包括促進(jìn)神經(jīng)突生長和吞噬細(xì)胞碎片［1］。在許多神經(jīng)退行性疾病中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及增殖與神經(jīng)炎癥相關(guān)，包括在帕金森?。?-3］、阿爾茨海默?。?］、亨廷頓?。?］、肌萎縮側(cè)索硬化［6-7］等疾病中。之前有文獻(xiàn)將星形膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)按不同的轉(zhuǎn)錄特征和功能特征進(jìn)行區(qū)分，具有促炎和神經(jīng)毒性的“A1”型星形膠質(zhì)細(xì)胞以及具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用的“A2”型星形膠質(zhì)細(xì)胞［8］。

受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）是死亡受體家族和模式識別受體激活的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子［9］，通過調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞死亡信號，在細(xì)胞和組織水平上調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)。在CNS中，RIPK1在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)，如在一些神經(jīng)退行性疾病包括肌萎縮性側(cè)索硬化癥［10］、多發(fā)性硬化癥［11］和阿爾茨海默?。?2］中的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。

RIPK1已被認(rèn)為與CNS疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。RIPK1的活性可以調(diào)節(jié)促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生［13-14］。在神經(jīng)退行性疾病中，RIPK1可能是一個細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子，可能導(dǎo)致有害的神經(jīng)炎癥環(huán)境［15］；RIPK1在阿爾茨海默病中介導(dǎo)疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)［12］；RIPK1在多發(fā)性硬化癥中介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的炎癥信號［11］；RIPK1在腦缺血性疾病中介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的神經(jīng)炎癥［16］。

基于上述研究背景，為了驗證星形膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與RIPK1相關(guān)，該研究使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞［mice astrocytes （MA）細(xì)胞］作為神經(jīng)炎癥模型，用Nec-1抑制RIPK1的表達(dá)，以期為明確RIPK1與星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥之間的關(guān)系提供新的思路。

通過免疫印跡（western blotting， WB）法檢測LPS對MA細(xì)胞RIPK1蛋白水平的影響，實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR， RT-qPCR）檢測MA細(xì)胞的A1∕A2型標(biāo)志物、炎癥因子和趨化因子的mRNA水平的表達(dá)，以探究抑制RIPK1的表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞極化和炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系MA細(xì)胞購于廣州吉妮歐生物科技有限公司；LPS購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Nec-1購于美國MedChemexpress生物科技公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購于碧云天生物技術(shù)公司；GAPDH抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；RIPK1抗體購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購于博士德生物工程有限公司；MTT購于北京百靈威科技公司；電泳儀購于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；RT-qPCR引物購于上海Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；電泳儀購于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)購于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；熒光定量PCR儀購于羅氏（中國）有限公司。

1.2 實驗設(shè)計與分組

采用小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系MA細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：① Control組：加入DMEM高糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)體系30 min后，再加入DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)處理24 h；② LPS組：加入DMEM高糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)體系30 min后，向培養(yǎng)體系中加入LPS繼續(xù)處理24 h；③ Nec-1組：加入Nec-1預(yù)處理MA細(xì)胞30 min后，向培養(yǎng)體系中加入DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；④ Nec-1+LPS組：Nec-1預(yù)處理MA細(xì)胞30 min后，向培養(yǎng)體系中加入LPS繼續(xù)處理24 h。其中，所采用的LPS濃度為0.1 μg∕mL，Nec-1濃度為50 mM。

1.3 LPS刺激MA細(xì)胞工作濃度及作用時間的設(shè)定

在96孔板中每孔接種1×104個MA細(xì)胞；培養(yǎng)24 h后，依次將每個孔中原培養(yǎng)基更換含濃度為0、0.1、1和10 μg∕mL LPS的新鮮培養(yǎng)基（100 μL∕孔）。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，通過細(xì)胞活力檢測以確定LPS的安全工作濃度。

在12孔板中每孔接種5×105個MA細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后將原培養(yǎng)基更換為工作濃度的LPS繼續(xù)刺激MA細(xì)胞24 h，提取細(xì)胞總蛋白用于WB實驗檢測RIPK1蛋白的表達(dá)，提取細(xì)胞總RNA用于RT-qPCR實驗檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.4 MTT比色法檢測細(xì)胞活力

向步驟1.3中的96孔板中加入20 μL∕孔的5 mg∕mL MTT溶液，將其置于避光條件下、37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 h。取出后棄掉上清液，向孔板中加入150 μL∕孔的DMSO溶液，避光。輕輕晃動使結(jié)晶體溶解后，可通過在490 nm波長處檢測OD值，然后運(yùn)用下述公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=［（實驗孔OD值-空白孔OD值）∕（對照孔OD值-空白孔OD值）］×100%。根據(jù)此公式計算出細(xì)胞的存活率。

1.5 WB檢測MA細(xì)胞內(nèi)RIPK1的表達(dá)

在12孔板中每孔接種5×105個MA細(xì)胞，細(xì)胞給藥處理詳細(xì)步驟同1.5，培養(yǎng)結(jié)束后提取細(xì)胞總蛋白，向孔板中加入含混合磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑PMSF（濃度為1 mM）的150 μL RIPA裂解液，反復(fù)吹打混勻后，在冰板上放置20 min。然后將混合物轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，在4 ℃條件下，以13 000 rpm離心5 min，收集離心后含有組織蛋白的上清液。加入4×上樣緩沖液將蛋白濃度配平，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離已配平蛋白濃度的蛋白溶液，上樣量為15 μL蛋白樣品∕每個電泳通道，然后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜上。封閉，然后用稀釋比為1∶500特異性RIPK1一抗在4 ℃下孵育12 h。用稀釋比為1∶8 000特異性二抗（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）溶液孵育2 h。最后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。檢測結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行定量處理。

1.6 RT-qPCR檢測MA細(xì)胞內(nèi)A1∕A2型標(biāo)志物基因和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)

MA細(xì)胞總RNA的提?。簩A細(xì)胞接種于6孔板（5×105個∕孔），細(xì)胞給藥處理詳細(xì)步驟同1.2，培養(yǎng)結(jié)束后使用Trizol法提取其總RNA并檢測RNA濃度，然后用DEPC水稀釋至200 ng∕μL的最終濃度。依據(jù)PrimeScript? RT reagent試劑盒使用說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)（表1）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LPS對MA細(xì)胞活力和RIPK1表達(dá)的影響

使用LPS刺激MA細(xì)胞建立神經(jīng)炎癥模型，根據(jù)MTT細(xì)胞活力實驗結(jié)果，使用濃度為0.1 μg∕mL、1 μg∕mL和10 μg∕mL的LPS刺激MA細(xì)胞24 h后，與未受LPS刺激的MA細(xì)胞相比，細(xì)胞活力保持正常水平。因此，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。（圖1A）。WB結(jié)果顯示，所用不同濃度LPS均能上調(diào)RIPK1的表達(dá)，并且LPS濃度為0.1 μg∕mL時，RIPK1的表達(dá)升高最顯著（圖1B、1C）。因此，綜合上述兩個實驗結(jié)果，選用LPS的工作濃度為0.1 μg∕mL開展后續(xù)細(xì)胞實驗。

圖1 不同濃度LPS對MA細(xì)胞活力和RIPK1表達(dá)的影響

2.2 Nec-1抑制LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞RIPK1的過表達(dá)

用Nec-1（50 μM）預(yù)處理MA細(xì)胞30 min后［17-18］，再用LPS（0.1 μg∕mL）處理24 h。結(jié)果顯示，Nec-1預(yù)處理可以顯著抑制LPS刺激引起的MA細(xì)胞中RIPK1蛋白的高表達(dá)（圖2A、2B）。這些結(jié)果表明，LPS刺激可使星形膠質(zhì)細(xì)胞RIPK1蛋白水平高表達(dá)，使用Nec-1治療可減輕炎癥狀態(tài)下RIPK1的升高。

圖2 Nec-1抑制LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞RIPK1的過表達(dá)

2.3 Nec-1抑制LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞A1型標(biāo)記物C3的過表達(dá)

為了分析RIPK1對LPS處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的活化作用，通過RT-qPCR檢測A1（神經(jīng)毒性）和A2（神經(jīng)營養(yǎng)）星形膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)水平。在Nec-1預(yù)處理MA細(xì)胞30 min后，用0.1 μg∕mL LPS處理MA細(xì)胞24 h。接下來，通過RT-qPCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞A1∕A2型標(biāo)志物，評估RIPK1激活是否影響MA細(xì)胞向A1∕A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。實驗表明，A1型基因C3在LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞中保持高表達(dá)，與LPS組相比，Nec-1+LPS組中C3基因mRNA水平明顯降低（圖3A），而A1型基因H2-D1、H2-T23和A2型基因S100A10、EMP1、PTX3的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，這表明LPS只能上調(diào)MA細(xì)胞中A1型標(biāo)志物C3基因的表達(dá)，而不改變其他基因的表達(dá)（圖3B-3F），而阻斷RIPK1可以顯著減少LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞A1型極化相關(guān)基因的上調(diào)。

圖3 Nec-1抑制LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞A1型標(biāo)記物C3的過表達(dá)

2.4 Nec-1改善LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)

表達(dá)炎癥因子是星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的主要表現(xiàn)之一，通過RT-qPCR檢測促炎類和抗炎類細(xì)胞因子，以評估抑制RIPK1表達(dá)是否影響在LPS刺激下MA細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞炎癥趨化因子CCL2的表達(dá)增加，并且通過Nec-1抑制RIPK1的表達(dá)可以減輕這一趨化因子的表達(dá)（圖4A）。其他趨化因子和炎癥因子，如IL-6和IL-10，沒有表現(xiàn)出顯著的表達(dá)改變。這可能是由于在MA細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)過程中，LPS并不會影響這些炎癥因子的表達(dá)（圖4B、4C）。

圖4 Nec-1改善LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活往往伴隨著神經(jīng)炎癥的疾病進(jìn)程［19］。有研究［20］表明，神經(jīng)炎癥與大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活有關(guān)，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞分為具有神經(jīng)毒性作用的A1型和具有神經(jīng)保護(hù)作用的A2型，小膠質(zhì)細(xì)胞分為具有神經(jīng)毒性作用的M1型和具有神經(jīng)保護(hù)作用的M2型，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激后可釋放促炎細(xì)胞因子，如TNF-α，IL-1β和IL-6，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙參與神經(jīng)炎癥的發(fā)病過程［21-22］。以往的研究［11，16］表明，RIPK1除了作為壞死調(diào)節(jié)蛋白的重要調(diào)節(jié)因子外，它作為促進(jìn)神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵驅(qū)動因子也越來越受到關(guān)注，RIPK1與多種神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)炎癥相關(guān)，且被證明在星形膠質(zhì)細(xì)胞［23］和小膠質(zhì)細(xì)胞［24］中均有表達(dá)。

有研究［24］發(fā)現(xiàn)RIPK1調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，但他們的研究沒有涉及到星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中的作用。在本研究中，首次探討了抑制RIPK1對LPS誘導(dǎo)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥的影響。

首先，為了明確在炎癥環(huán)境下RIPK1在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況，探索了適宜濃度的LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞體外炎癥模型。實驗結(jié)果表明，使用0.1 μg∕mL LPS刺激MA細(xì)胞24 h后，MA細(xì)胞的活力未出現(xiàn)下降；WB實驗發(fā)現(xiàn)0.1 μg∕mL的LPS刺激MA細(xì)胞24 h后顯著增加RIPK1蛋白的表達(dá)，遂以此為依據(jù)設(shè)定了LPS的刺激濃度。選用Nec-1抑制RIPK1表達(dá)，以探究RIPK1在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。通過WB實驗發(fā)現(xiàn)，Nec-1作為一種RIPK1抑制劑，在濃度為50 μM時與LPS共處理24 h后，可以有效地緩解LPS誘導(dǎo)炎癥引起的RIPK1表達(dá)升高。為了進(jìn)一步探究RIPK1的表達(dá)對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制，對RIPK1抑制劑作用下的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了更全面的分析。通過RT-qPCR評估RIPK1激活是否影響MA細(xì)胞向A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。實驗表明，A1型基因C3在LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞中保持高表達(dá)。抑制RIPK1的表達(dá)顯著阻斷了LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)基因的上調(diào)?；罨纳窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通常通過釋放促炎細(xì)胞因子引起組織損傷［25］，因此進(jìn)一步檢測了星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的水平。通過RT-qPCR檢測炎癥相關(guān)趨化因子和炎癥因子發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的MA細(xì)胞增加了炎癥趨化因子CCL2的表達(dá)，并且通過Nec-1抑制RIPK1的表達(dá)可以減輕這一炎癥表達(dá)。研究結(jié)果表明抑制RIPK1的表達(dá)可以改變LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的表型，減少炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥。

綜上，研究證明Nec-1抑制RIPK1在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型中具有治療作用。因此，針對星形膠質(zhì)細(xì)胞中抑制RIPK1的手段可能在多種以A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征且涉及神經(jīng)炎癥性疾病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，本文尚且存在一些不足之處，對于RIPK1影響星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的精確分子機(jī)制還需繼續(xù)探索，可以嘗試在體內(nèi)實驗中通過對神經(jīng)炎癥模型小鼠進(jìn)行RIPK1基因敲除，進(jìn)一步探索其關(guān)鍵途徑。