權威，喬晨萌，鈕谷雨，吳劍，趙麗萍，申延琴

（江南大學無錫醫(yī)學院神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷實驗室，江蘇 無錫 214122）

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其病理機制尚不清楚［1］。然而，越來越多的證據(jù)表明腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可以通過菌群-腸-腦軸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，將正常小鼠的腸道菌群移植到PD模型小鼠體內(nèi)，可以顯著改善PD模型小鼠的行為障礙和腦病理學表現(xiàn)［3］。萬古霉素可以通過改變腸道菌群、抑制腸道和大腦炎癥對PD小鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護作用［4］。此外，2021年，Hou等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，灌胃丙酸（一種腸道微生物代謝產(chǎn)物）可以逆轉(zhuǎn)6-羥多巴胺誘導的PD小鼠的運動缺陷和多巴胺能神經(jīng)元的丟失。上述研究共同表明腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物在PD病理學變化中起著重要作用。

氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）是腸道菌群的間接代謝產(chǎn)物，研究［6］表明TMAO可穿過血腦屏障。近期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，PD患者血漿TMAO水平顯著高于健康對照人群，同時TMAO水平的升高與PD嚴重程度和病程進展呈正相關［7］。有趣的是，Chung等［8］基于PD患者的研究卻顯示PD患者血漿TMAO水平顯著低于對照組，并且較低水平的TMAO可作為早期診斷PD的生物標志物。此外，與年輕人相比，中年人和老年人血漿中TMAO的水平明顯更高，而較高的TMAO水平與認知能力下降有關［9］。動物研究和細胞實驗［9］均發(fā)現(xiàn)，TMAO可損害幼齡小鼠的認知能力，誘發(fā)神經(jīng)炎癥，并增加大腦中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的釋放。綜上，TMAO與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間存在密切的關系，特別是臨床研究顯示TMAO的異常變化可能與PD的發(fā)生、發(fā)展存在因果關系，但現(xiàn)有研究有限，且研究結(jié)論各異。

基于上述研究背景，研究首先通過在飲用水中添加TMAO的方式提高小鼠外周血TMAO水平，再通過腹腔注射MPTP構建PD模型小鼠，以此來探究TMAO對PD模型小鼠的潛在作用，以期為明確PD與TMAO之間的關系提供新的信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

6周齡SPF級別雄性C57BL∕6J小鼠購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司。MPTP購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；TMAO購于上海邁瑞爾化學試劑公司。高氯酸購于上海國藥化學試劑有限公司；5-羥色胺和5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑均購于碧云天生物技術公司；GAPDH抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司；TH抗體、TLR4抗體和NF-κB抗體購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；HRP標記羊抗兔IgG二抗購于博士德生物工程有限公司；熒光定量PCR引物均購于賽默飛生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；電泳儀購于伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)購于伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司，高效液相色譜儀及色譜柱購于沃特世（美國）公司。

1.2 實驗設計與分組

采用6周齡雄性C57BL∕6J小鼠，隨機分為4組：① 空白對照組（Control組）；② 帕金森病模型組（MPTP組）；③ 飲水補充3%TMAO+腹腔注射生理鹽水對照組（TMAO組）；④ 飲水補充3%TMAO+腹腔注射MPTP誘導模型組（TMAO+MPTP組）。具體實驗流程為：所有小鼠在屏障環(huán)境中適應7 d后，隨機分為四組，進行為期28 d的實驗。整個實驗期間對Control組和MPTP組進行常規(guī)飼養(yǎng)，對TMAO組和TMAO+MPTP組除進行常規(guī)飼養(yǎng)外同時飲水中添加3%（w∕v）TMAO。第21天對MPTP組及TMAO+MPTP組進行腹腔注射MPTP（20 mg∕kg，每隔2 h注射1次，一日內(nèi)給藥4次）構建PD急性模型，Control組及TMAO組則注射等體積生理鹽水，第28天進行組織取材。所有實驗均得到江南大學實驗動物倫理委員會的批準。

1.3 行為學測試

通過爬桿實驗、懸掛實驗評估各組小鼠的運動功能。具體為：第25、26和27天進行連續(xù)3 d的行為學訓練，訓練時間均為早上同一時間段。第28天進行行為學雙盲檢測。爬桿實驗：將小鼠放在一根直立桿頂端（直徑約2 cm，長約50 cm），從放下鼠尾時開始計時，測量小鼠從桿頂部到底部所需時間。懸掛實驗：將小鼠的兩前爪放在一根水平拉緊的直徑約為1 mm的金屬線上，觀察小鼠的四肢抓握金屬線的情況，四肢均可抓握，記為4分，兩前肢及一側(cè)后肢抓握記3分，兩前肢抓握記2分，僅一側(cè)前肢抓握記1分，無法抓握并掉落則記0分。兩種行為學實驗均分別檢測3次，每次間隔15 min，結(jié)果取3次平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.4 免疫印跡（Western blotting， WB）檢測紋狀體TH、TLR4和NF-κB的蛋白含量

向紋狀體組織中按比例加入組織細胞裂解液、苯甲基磺酰氟和磷酸酶抑制劑的混合溶液（RIPA∶PMSF∶PICA=100∶2∶1（V∶V∶V））以提取總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離已知蛋白濃度的蛋白溶液，上樣量為30 μg總蛋白∕每個電泳通道，然后將目標蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜上。封閉、稀釋比為1∶500特異性TH、TLR4和NF-κB一抗在4 ℃下孵育12 h。用稀釋比為1∶5 000特異性二抗（生物素標記山羊抗兔IgG（H+L）溶液孵育2 h。最后用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。檢測結(jié)果采用Image J軟件進行定量處理。

1.5 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的濃度

HPLC檢測前樣品前處理：按照比例（10 μL∕mg組織）向紋狀體組織中加入0.1 M高氯酸并隨即進行徹底研磨，4 ℃條件下以13 000 rpm離心10 min，收集離心后的上清液，并用0.22 μm過濾器將上清液濾入2 mL進樣瓶中，等待檢測。用配有紫外線檢測器的高效液相色譜儀測定紋狀體中的神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）及其代謝物的水平。使用的色譜柱是：Atlantis t3色譜柱（150 mm × 4.6 mm， 5 μm）。流動相為超純水、乙腈和0.01 M磷酸鹽緩沖液（pH = 4）。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測

利用TRIzolTM試劑提取小鼠海馬總RNA并評估總RNA的純度和完整性。使用PrimeScript?RT試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR?Pre-mix Ex TaqTMⅡ在PCR儀（Light-Cycler 480Ⅱ）上檢測目標靶基因的mRNA相對表達水平。用2-ΔΔCt法計算靶基因的相對表達量，并歸一化為GAPDH。所有的實驗步驟都按照制造商的說明進行。本研究中用到的靶基因引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法

所有的實驗數(shù)據(jù)均以（）的形式表示，利用SPSS26.0軟件中的單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD（LSD′s post hoc test）事后檢驗對4組間的差異進行分析。將統(tǒng)計學的顯著性閾值分別設定在：*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001。所有定量統(tǒng)計圖均利用GraphPad Prism 8.0軟件進行繪制。

2 結(jié)果

2.1 TMAO對PD小鼠紋狀體TH蛋白含量及運動功能的影響

酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）作為多巴胺合成的關鍵限速酶，其表達水平的降低是PD的主要病理學特征之一。為了驗證本實驗中MPTP誘導的PD小鼠模型的構建成功以及評估TMAO對PD小鼠TH表達的影響，首先采用Western blotting法檢測紋狀體TH蛋白表達水平（圖1A）。結(jié)果顯示，MPTP組和TMAO+MPTP組均導致紋狀體TH蛋白表達水平顯著降低（圖1B）。而在TMAO+MPTP組和MPTP組之間紋狀體TH表達差異并沒有統(tǒng)計學意義（圖1B）。Western blotting結(jié)果表明，飲水補充3%的TMAO對PD小鼠紋狀體TH蛋白表達水平無顯著影響。進一步通過行為學實驗評估TMAO對于PD小鼠行為功能的影響。爬桿實驗中，TMAO+MPTP組小鼠的下降時間顯著長于MPTP組（圖1C），說明TMAO加劇了PD小鼠的運動遲緩。懸掛實驗中，4組間的懸掛評分差異無統(tǒng)計學意義，說明TMAO并未顯著性影響PD小鼠的肌肉力量和平衡（圖1D）。以上結(jié)果表明，雖然TMAO并未影響PD小鼠TH蛋白的含量但是部分加劇了PD小鼠運動功能障礙。

圖1 TMAO對PD小鼠紋狀體TH蛋白含量及運動功能的影響

2.2 TMAO對紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的影響

進一步利用HPLC檢測紋狀體中5-HT及其代謝產(chǎn)物水平以探究TMAO對紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的影響。5-HT是大腦中調(diào)控情緒、認知重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。結(jié)果顯示，TMAO+MPTP組相較于MPTP組顯著降低了5-HT的水平（圖2A、2B）。同時，TMAO+MPTP組相比于MPTP組5-HIAA∕5-HT（反映5-HT代謝率的指標）有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（圖2C）。以上結(jié)果表明，TMAO顯著降低了PD小鼠神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的水平。

圖2 TMAO對紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的影響

2.3 TMAO上調(diào)了PD小鼠紋狀體TLR4∕NFκB的蛋白表達

既往的研究［10］表明紋狀體神經(jīng)炎癥是PD的重要發(fā)病機制之一。Li等［11］的研究表明，TMAO可以穿過血腦屏障并誘導產(chǎn)生神經(jīng)炎癥。因此，本研究通過WB檢測PD小鼠紋狀體中炎癥相關分子TLR4及NFκB的蛋白水平，以進一步揭示TMAO對PD小鼠神經(jīng)炎癥的影響，結(jié)果表明，與MPTP組相比，TMAO+MPTP組紋狀體中TLR4和NFκB蛋白含量均顯著升高（圖3A-C），提示TMAO加劇MPTP誘導的PD模型小鼠紋狀體神經(jīng)炎癥可能是通過TRL4-NFκB這一經(jīng)典的促炎通路。

圖3 TMAO上調(diào)了PD小鼠紋狀體TLR4∕NF-κB的蛋白表達

2.4 TMAO對PD小鼠海馬神經(jīng)炎癥的作用

海馬是調(diào)節(jié)認知、情緒和學習的重要區(qū)域之一。為了探究TMAO對于PD小鼠海馬神經(jīng)炎癥的作用，通過RT-qPCR法檢測了海馬中神經(jīng)炎癥相關分子（CD68、TLR4和NFκB）的mRNA表達水平。結(jié)果表明，與MPTP組相比，TMAO+MPTP組顯著上調(diào)了M1促炎型小膠質(zhì)細胞標志物CD68的mRNA表達水平（圖4A）。同時，與Control組相比，TMAO單獨治療也可以顯著上調(diào)TLR4及NFκB的mRNA表達水平（圖4B-C），而與MPTP組相比，TMAO+MPTP組這兩種炎癥相關分子的mRNA水平有上升的趨勢，但差異并無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果共同提示TMAO加劇了PD小鼠海馬的神經(jīng)炎癥。

圖4 TMAO對PD小鼠海馬神經(jīng)炎癥的作用

圖5 TMAO對PD小鼠海馬突觸可塑性及血腦屏障相關分子的影響

2.5 TMAO對PD小鼠海馬突觸可塑性及血腦屏障相關分子的影響

進一步通過RT-qPCR檢測了海馬突觸可塑性相關分子（NMDAR1、PSD95和Syn）和血腦屏障相關分子（ZO-1、Claudin-5和Occludin）的mRNA表達水平，以此評估TMAO對PD模型小鼠海馬突觸功能和血腦屏障完整性的影響。結(jié)果顯示，突觸可塑性相關分子的mRNA水平在4組間的差異均無統(tǒng)計學意義（圖5A-C），提示TMAO對于突觸可塑性相關分子表達并未產(chǎn)生影響。同時，血腦屏障相關分子的mRNA水平在4組間差異也均無統(tǒng)計學意義（圖5DF），提示TMAO并無影響血腦屏障的完整性。

3 討論

近年來，越來越多的證據(jù)表明，TMAO與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病密切相關，其有助于神經(jīng)炎癥等相關危險因素的產(chǎn)生［12］。臨床研究發(fā)現(xiàn)在PD患者外周血中存在TMAO水平的異常改變。Sankowski等［13］報道PD患者血漿TMAO高于正常人群。然而，同年Chung等［8］發(fā)現(xiàn)PD患者血漿TMAO水平明顯低于正常對照人群。值得注意的是，Chen等［7］發(fā)現(xiàn)外周血中高水平的TMAO可能與PD的病程進展和嚴重程度呈正相關。上述臨床研究提示TMAO與PD之間存在顯著的相關性，但研究結(jié)論是不一致的。同時進一步研究TMAO對PD影響的實驗性研究尚未見報道。在本研究中，首次探討了外周血高水平的TMAO對MPTP誘導的PD模型小鼠腦病理及行為障礙的影響。

首先通過飲水補充TMAO的方式以提高小鼠外周血的TMAO水平。在此基礎上，通過WB檢測紋狀體中TH蛋白的水平，WB的結(jié)果一方面表明PD模型的成功構建，另一方面發(fā)現(xiàn)TMAO對PD小鼠紋狀體TH蛋白的含量沒有顯著性影響。同時，行為學結(jié)果表明，TMAO部分加劇了PD小鼠的運動障礙，具體表現(xiàn)為爬桿實驗中TMAO+MPTP組小鼠的爬桿耗時更長。

此外，已有的研究［9，14］表明，在行為認知實驗中，TMAO可損害小鼠的空間記憶及工作記憶能力，同時另一項研究發(fā)現(xiàn)TMAO加重老年大鼠術后認知能力的下降，并伴有海馬神經(jīng)炎癥和突觸結(jié)構損傷。與此相似，PD患者常伴有認知能力下降、癡呆、焦慮、抑郁等非運動癥狀，這些癥狀可能與海馬損傷有關［15］。本研究發(fā)現(xiàn)TMAO+MPTP組相比于MPTP組紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量的顯著降低的，而5-HT是與情緒、認知調(diào)控密切相關的神經(jīng)遞質(zhì)［16］。同時，該研究還評估了TMAO對于小鼠血腦屏障的完整性的潛在作用，結(jié)果表明TMAO并未顯著性影響血腦屏障相關分子的表達水平。已有關于TMAO對血腦屏障作用的研究結(jié)論是不一致的，一項研究發(fā)現(xiàn)TMAO可以穿過血腦屏障并破壞其完整性，具體表現(xiàn)為下調(diào)緊密連接蛋白ZO-1的表達水平［6］，但是Hoyles等［17］的研究卻發(fā)現(xiàn)特定濃度的TMAO可以增強血腦屏障的完整性。

此外，研究還報道了TMAO的促炎作用。例如，在急性腦出血損傷后，高膽堿飲食引起的循環(huán)血TMAO升高加劇了小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活和神經(jīng)炎癥［11］。TMAO是大腦炎癥的誘發(fā)劑。大腦炎癥，尤其是紋狀體的神經(jīng)炎癥，一直被認為是PD的重要原因之一。因此，通過WB檢測了紋狀體中TLR4及NFκB的蛋白水平，同時也通過RT-qPCR檢測了海馬中炎癥相關分子CD68、TLR4、NFκB的mRNA表達水平，WB和RT-qPCR的結(jié)果共同表明TMAO在一定程度上上調(diào)了這些炎癥分子的表達水平，但是可能由于本實驗中TMAO+MPTP組樣本數(shù)量的限制性（n=3），大部分指標僅觀察到了上升的趨勢，而MPTP與TMAO+MPTP組間的差異并無統(tǒng)計學意義。作為大腦中主要調(diào)節(jié)認知和記憶的區(qū)域，研究［14］表明，海馬神經(jīng)炎癥會損害認知功能。但是，需要設計進一步的實驗來研究高水平的TMAO是否會影響PD小鼠的認知和記憶。

綜上所述，本研究探討了TMAO對MPTP誘導的PD模型小鼠行為學障礙、TH蛋白表達、神經(jīng)遞質(zhì)的水平以及神經(jīng)炎癥方面的潛在影響。該研究首次觀察到經(jīng)口誘導外周血高水平的TMAO可加劇PD模型小鼠的行為學障礙、降低神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的水平。同時，TMAO部分上調(diào)PD模型小鼠紋狀體和海馬中炎癥相關分子的表達，提示TMAO可加劇PD小鼠的神經(jīng)炎癥?？傊?，本研究結(jié)果表明TMAO可加劇PD小鼠行為障礙、紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的丟失以及紋狀體和海馬的神經(jīng)炎癥。因此，外周血高水平的TMAO可能是PD的危險因素之一。