羅睿杰,曹素英

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

干細(xì)胞廣泛存在于動物生長發(fā)育的各個階段,按其分化潛能分為五類,全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞、寡能干細(xì)胞、專能干細(xì)胞,這五類干細(xì)胞起源于動物生長發(fā)育的不同時期,其分化潛力依次下降[1]。全能干細(xì)胞一般可以分化成完整個體和胎盤等胚外組織;多能干細(xì)胞具有發(fā)育成胚胎全部三胚層各種細(xì)胞的能力,但一般不能形成胚外組織;多潛能干細(xì)胞能分化成單一胚層的多種細(xì)胞;寡能或?qū)Ｄ芨杉?xì)胞只能分化為生理功能相近的幾種(寡能)或一種(專能)細(xì)胞[1-2]。其中,多能干細(xì)胞由于具有在無限增殖中保持穩(wěn)定及在一定誘導(dǎo)條件下分化為各種細(xì)胞的能力即具有較強(qiáng)的分化潛能,在生物醫(yī)藥、動物育種等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景,成為干細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

1 依據(jù)小鼠多能干細(xì)胞建立干細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)

1.1 由小鼠胚胎干細(xì)胞建立多能性鑒定標(biāo)準(zhǔn)

各種哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中,關(guān)鍵事件和細(xì)胞多能性變化規(guī)律大致相同。對于大部分哺乳動物,受精卵及其最初兩次卵裂形成的卵裂球一般被認(rèn)為是全能干細(xì)胞;在八細(xì)胞期之后,發(fā)生致密化和極化,產(chǎn)生內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass, ICM)和滋養(yǎng)層(trophectoderm, TE),此過程為哺乳動物早期胚胎的第一次譜系分化[3];隨后,第二次譜系分化開始,ICM中進(jìn)一步產(chǎn)生上胚層(epiblast, EPI)和下胚層(hypoblast, HYPO),胚胎細(xì)胞的全能性在兩次譜系分化過程中逐漸喪失,到胚胎附植前后,其中各種細(xì)胞均已不具備同時產(chǎn)生完整胚胎和胚外組織的能力[4]。

小鼠是經(jīng)典的生物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼游?在早期胚胎及多能干細(xì)胞領(lǐng)域,小鼠的研究進(jìn)展明顯快于其他物種,很多干細(xì)胞的狀態(tài)和相關(guān)概念最初也是根據(jù)小鼠的干細(xì)胞特征被定義。最早的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)于1981年從小鼠ICM中分離得到[5],隨后幾十年內(nèi),大量研究著眼于獲得更接近體內(nèi)早期胚胎狀態(tài),且能在體外穩(wěn)定維持這種狀態(tài)的多能干細(xì)胞[6-8]。對小鼠早期胚胎及小鼠ESCs的研究發(fā)現(xiàn),隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行,來自不同時期ICM的ESCs多能性狀態(tài)有所不同,由此定義了小鼠多能干細(xì)胞的初始(naive)和始發(fā)(primed)狀態(tài),以及后來定義的介于二者之間的形成(formative)狀態(tài)[9]。其中,naive狀態(tài)的ESCs來自小鼠妊娠第4天(簡記為E4,下同)前早期胚胎,這類細(xì)胞與體內(nèi)胚胎附植前EPI高度類似,能形成隆起、邊緣清晰的克隆,能進(jìn)行單細(xì)胞傳代,能產(chǎn)生嵌合體后代,能得到四倍體補(bǔ)償個體,被認(rèn)為是最理想的多能干細(xì)胞[8,10]。primed狀態(tài)定義為小鼠胚胎附植后到原節(jié)前期胚胎的EPI(約E7后逐漸產(chǎn)生)所處的狀態(tài),通常稱為上胚層干細(xì)胞(epiblast stem cells, EpiSCs);在formative狀態(tài)被定義后,primed干細(xì)胞的定義變?yōu)樵c早期至原節(jié)前期胚胎(約E6-8)中分離出的EpiSCs[11]。小鼠的primed狀態(tài)干細(xì)胞一般克隆形態(tài)扁平,不能進(jìn)行單細(xì)胞傳代,不能產(chǎn)生生殖系嵌合和四倍體補(bǔ)償個體[12]。formative狀態(tài)于2021年被正式定義,是介于naive和primed之間的一種過渡狀態(tài),存在于小鼠約E5.5～E6.5體內(nèi)胚胎中,其分化潛力、基因甲基化程度、嵌合體形成能力也介于naive和primed之間[13-15]。研究表明,不同狀態(tài)的多能干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)[16]、基因表達(dá)[17]、表觀遺傳特征[18]、發(fā)育潛力[2]等方面存在區(qū)別。

干細(xì)胞多能性的鑒定標(biāo)準(zhǔn)也在早期研究的基礎(chǔ)上建立,包括六個層面[18]:1)體外分化,在體外誘導(dǎo)條件下分化為三胚層細(xì)胞,通過檢測三胚層特異性蛋白進(jìn)行鑒定;2)畸胎瘤實(shí)驗(yàn),將多能干細(xì)胞注入免疫缺陷鼠皮下,使其在體內(nèi)條件下自發(fā)分化,在所得畸胎瘤中檢測三胚層特異性蛋白;3)嵌合體實(shí)驗(yàn),將供體干細(xì)胞注入桑椹胚或早期囊胚階段的胚胎中,待嵌合胚胎形成后,檢測供體細(xì)胞對胚胎和胎兒發(fā)育的貢獻(xiàn);4)生殖系嵌合,在形成嵌合胚胎的基礎(chǔ)上,在生殖器官中檢出供體細(xì)胞的貢獻(xiàn),并產(chǎn)生功能性配子;5)四倍體補(bǔ)償,將供體干細(xì)胞注入四倍體囊胚,產(chǎn)生完全由供體發(fā)育成的胚胎;6)單細(xì)胞嵌合,多能性是每一個多能干細(xì)胞都應(yīng)該具有的性質(zhì),將單個多能干細(xì)胞注入四倍體囊胚,令單個供體干細(xì)胞發(fā)育成完整胚胎,是目前干細(xì)胞多能性最嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。這六個層面嚴(yán)格程度依次遞進(jìn),一般認(rèn)為至少通過生殖系嵌合實(shí)驗(yàn)的干細(xì)胞可以被稱為naive干細(xì)胞,其中一些naive干細(xì)胞已經(jīng)可以通過四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn);primed干細(xì)胞一般需要通過畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn),少數(shù)primed干細(xì)胞注入囊胚后,嵌合體中可以檢出極微量的供體干細(xì)胞貢獻(xiàn)[19]。

1.2 由小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞建立重編程鑒定標(biāo)準(zhǔn)

直接研究和使用早期胚胎中的干細(xì)胞面臨兩項(xiàng)最重要的問題:第一,難以從早期胚胎中獲取狀態(tài)良好的干細(xì)胞,這是因?yàn)榕咛グl(fā)育是一個連續(xù)的過程,細(xì)胞的多能性在整個過程中逐漸衰退,這一過程非常迅速,理想的多能干細(xì)胞僅存在于一個極小的時間窗口中[13-14,20];第二,獲取和研究人ESCs涉及對人類胚胎的采集和破壞,存在醫(yī)學(xué)倫理問題,因此在動物上得出的試驗(yàn)結(jié)果難以遷移到人上進(jìn)行測試[21-22]。

哺乳動物體細(xì)胞克隆最早于1996年成功,這一技術(shù)的誕生證明了高度分化的細(xì)胞可以通過重編程重獲多能性[23]。受到哺乳動物克隆的啟發(fā),研究人員開始關(guān)注如何利用體細(xì)胞重編程等技術(shù),將體細(xì)胞去分化以產(chǎn)生多能性細(xì)胞。2006年,Takahashi和Yamanaka[24]將OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC(OSKM) 4種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,從中分離得到了最早的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。該細(xì)胞系具有和ESCs相似的增殖能力、分化潛力等特性。隨后,人[25]、大鼠[26]、猴[27]、豬[28-30]、牛[31]、羊[32-33]、馬[34]等的iPSCs先后建立。誘導(dǎo)體系也由最初的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逐漸改進(jìn),產(chǎn)生了非整合型載體誘導(dǎo)[35]和化學(xué)重編程[36]等非轉(zhuǎn)基因重編程體系,為iPSCs的獲取和應(yīng)用提供了更加安全、高效的途徑。采用類似的思路,針對其它干細(xì)胞特點(diǎn)設(shè)計(jì)因子組合,也可以獲得誘導(dǎo)滋養(yǎng)層干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚外內(nèi)胚層干細(xì)胞等不同類型的干細(xì)胞[37]。

雖然iPSCs不是直接取自早期胚胎,但由于其具有和ESCs相似的特征,可以按其與各狀態(tài)ESCs的相似性定義iPSCs的多能性狀態(tài)。鑒定iPSCs是否完全重新編程的幾個標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)確立,包括4個方面[38]:1)與ESCs高度相似的形態(tài)特征和自我更新能力;2)遺傳和表觀遺傳學(xué)特征與ESCs高度相似,可通過免疫熒光染色等方法從iPSCs中檢出ESCs特異性關(guān)鍵多能性因子和表面抗原;3)外源基因沉默,多能性的維持不依賴于轉(zhuǎn)基因表達(dá);4)分化潛力,包括“1.1”中所述多能性鑒定的六個層面。不同于多能性鑒定,完全重編程的四種判斷標(biāo)準(zhǔn)是平行的,即只有同時符合這4點(diǎn)要求的干細(xì)胞才是“真正的iPSCs”。小鼠iPSCs已經(jīng)通過上述驗(yàn)證,而多數(shù)大家畜iPSCs存在誘導(dǎo)效率低[13]、致瘤性[39]、多能性維持依賴于外源因子[40]等問題,與體內(nèi)胚胎中的多能干細(xì)胞還存在較大的差距。

2 大家畜多能干細(xì)胞研究進(jìn)展

大家畜既可以為人類提供食物、毛皮,也可供役使、休閑旅游、體育競賽等活動,一些家畜還可以用于人類醫(yī)學(xué)研究。大家畜干細(xì)胞在動物育種、人造肉生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)研究模型建立等方面有廣闊的應(yīng)用前景。目前,大家畜干細(xì)胞的研究進(jìn)展落后于小鼠,大部分家畜干細(xì)胞仍存在一些顯著缺陷,大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)家畜多能干細(xì)胞的有效方法尚未建立。

2.1 種間差異限制家畜干細(xì)胞研究與應(yīng)用

所有哺乳動物胚胎發(fā)育過程大致相似,但大量研究已經(jīng)證明,大家畜在生殖周期[41]、早期胚胎發(fā)育[42-43]、胚胎著床時間[44]、多能性調(diào)控機(jī)制[45]、表觀遺傳[42]等方面與小鼠有顯著不同,這些不同是將產(chǎn)生小鼠多能干細(xì)胞的方法直接遷移到大家畜上難以得到優(yōu)質(zhì)干細(xì)胞的主要原因[17,46]。

與小鼠等經(jīng)典實(shí)驗(yàn)動物相比,大家畜的生殖周期長,繁殖率低[41],因此,很難根據(jù)在小鼠實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果準(zhǔn)確推導(dǎo)出豬、牛、羊等動物體內(nèi)胚胎的生長發(fā)育規(guī)律。與小鼠相比,家畜早期胚胎中多能干細(xì)胞的多能性維持機(jī)制更復(fù)雜,需要更多因子的支持[47]。此外,家畜外胚層發(fā)育方面與小鼠也存在明顯不同[42],在這些方面,家畜與人類更加接近[43,48],因此在近幾年的涉及干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)研究中,豬等家畜作為模式動物的比例明顯增加。然而大家畜與人也存在很多種間差異,例如豬和人的胎盤結(jié)構(gòu)、早期胚胎代謝調(diào)控、細(xì)胞膜蛋白等方面存在明顯不同[17]。

以上種間差異使得直接借鑒小鼠的研究成果進(jìn)行家畜多能干細(xì)胞的分離是不可行的,因此,獲得高質(zhì)量家畜干細(xì)胞以期用于家畜育種研究的進(jìn)展緩慢。同時,種間差異也導(dǎo)致很多在大家畜上得到的結(jié)論在推廣到人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域時面臨許多障礙,限制了家畜干細(xì)胞在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.2 家畜干細(xì)胞多能性調(diào)控

研究干細(xì)胞多能性調(diào)控機(jī)理是建立多能干細(xì)胞系的基礎(chǔ),干細(xì)胞建系的嘗試也可以進(jìn)一步推動對多能性調(diào)控的研究。大家畜干細(xì)胞多能性維持機(jī)制較為復(fù)雜,有關(guān)的信號通路包括JAK/STAT、Activin/Nodal、FGF/ERK、Wnt/β-catenin等。通過阻斷或抑制相關(guān)信號通路,可以使早期胚胎發(fā)育停滯在特定時期[49-51],這是從動物胚胎中獲取多能干細(xì)胞的主要方法;強(qiáng)制表達(dá)某些關(guān)鍵因子,可以改變細(xì)胞的多能性,實(shí)現(xiàn)不同類型、不同狀態(tài)干細(xì)胞之間的相互轉(zhuǎn)換[52-53],還可以將已分化的體細(xì)胞去分化制備不同類型的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[24]。對體細(xì)胞與干細(xì)胞之間、不同類型干細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)化的研究,可以幫助人們更好地理解細(xì)胞命運(yùn)決定以及多能性轉(zhuǎn)變的機(jī)理。

JAK/STAT信號通路中的核心因子是STAT3,該通路的激活使得STAT3形成同質(zhì)或異質(zhì)二聚體,二聚體入核后可激活TFCP2L1、KLF4、ESRRB、GBX2等對naive ESCs維持有重要作用的基因;白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)是JAK/STAT信號通路的重要激活因子,LIF可以與細(xì)胞表面LIFR-GP130受體結(jié)合,激活JAK,進(jìn)一步使STAT3磷酸化,促使STAT3二聚體形成[54]。通過在培養(yǎng)體系中添加LIF,充分激活JAK/STAT信號通路是小鼠ESCs維持多能性的重要條件[6];在一些大家畜干細(xì)胞建系的研究中,撤去LIF不利于豬和羊干細(xì)胞維持多能性狀態(tài)[55-56],另一些研究表明,LIF對豬干細(xì)胞多能性的獲得有重要作用,但不是多能性維持的必要條件[57];Kim等[58]通過微陣列測序分析發(fā)現(xiàn)STAT3的活化是建立牛ESCs的關(guān)鍵因素。

Activin/Nodal信號通路作用廣泛,調(diào)控包括早期胚胎細(xì)胞命運(yùn)決定、器官發(fā)生、成體組織穩(wěn)態(tài)等在內(nèi)的很多過程[59]。Activin和Nodal與跨膜受體結(jié)合,激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SMAD蛋白,SMAD入核后誘導(dǎo)染色體特定位點(diǎn)的表觀遺傳修飾發(fā)生改變,從而激活或抑制相應(yīng)基因的表達(dá)[60]。小鼠EpiSCs和人ESCs依賴Activin A維持多能性[61-62];在家畜中,抑制Activin/Nodal信號通路會導(dǎo)致豬多能干細(xì)胞克隆形態(tài)無法維持[57]。

FGF/ERK信號通路受成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)調(diào)控,FGF與細(xì)胞膜上受體結(jié)合,引發(fā)MEK和ERK級聯(lián)磷酸化,ERK入核激活下游靶基因[63]。FGF/ERK信號通路對不同物種干細(xì)胞的作用不同。對于小鼠,激活FGF/ERK信號通路誘導(dǎo)ESCs分化[64],FGF受體抑制劑PD0325901有助于維持小鼠ESCs的多能性[65-66];對于人ESCs和人EpiSCs,在培養(yǎng)體系中添加FGF以激活FGF/ERK通路,可以促進(jìn)干細(xì)胞自我更新[12,62];對于牛,PD0325901對ESCs維持沒有顯著作用[67];對于豬,外源FGF可以促進(jìn)ESCs原代克隆產(chǎn)生[68],從EpiSCs培養(yǎng)體系中撤去FGF會導(dǎo)致其無法正常增殖和傳代[57];對于羊ESCs和iPSCs,撤去FGF都會導(dǎo)致多能性無法維持[69-70]。

Wnt/β-catenin信號通路受干細(xì)胞自分泌或旁分泌的Wnt控制,當(dāng)Wnt存在時,具有分解β-catenin功能的“降解復(fù)合物”招募至細(xì)胞膜,其中GSK3活性受到抑制,無法促進(jìn)β-catenin降解,細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)移入核,從而調(diào)控細(xì)胞分化;當(dāng)缺少Wnt配體時,細(xì)胞內(nèi)“降解復(fù)合物”中的GSK3和CK1促進(jìn)β-catenin磷酸化,使其在細(xì)胞質(zhì)中降解[51]。Wnt信號在多能性調(diào)控中具有雙重作用[71],通過添加Wnt3a或GSK3α/β抑制劑CHIR99021激活信號通路,并添加LIF激活JAK/STAT,可以促進(jìn)小鼠ESCs維持和自我更新[8,72],對Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)可使小鼠ESCs向EPI樣干細(xì)胞轉(zhuǎn)化[20];在人ESCs和EpiSCs中,激活Wnt/β-catenin信號通路會導(dǎo)致干細(xì)胞分化[73],缺乏Wnt通路活性可以使人ESCs向滋養(yǎng)層干細(xì)胞轉(zhuǎn)化[74];在家畜中,抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是多能干細(xì)胞維持的一個必要因素,豬、牛、羊ESCs的維持均依賴于Wnt/β-catenin通路抑制劑IWP2、IWR1或XAV939[75-77]。

2.3 家畜多能干細(xì)胞系的建立

2.3.1 家畜ESCs建系的嘗試 早期的家畜ESCs大部分參考小鼠或人ESCs建系的方法,從家畜早期胚胎中分離建系。1990年前后,研究人員進(jìn)行了豬[78]、牛[79]、羊[80]ESCs體外培養(yǎng)的最早嘗試。由于對干細(xì)胞維持機(jī)理的研究不夠深入,當(dāng)時的家畜ESCs多數(shù)不能長期維持,分化潛力也存在明顯的缺陷,只能稱為“類ESCs”。

隨著對多能性調(diào)控通路的研究開展,一些具有調(diào)節(jié)信號通路活性功能的因子被用于家畜干細(xì)胞建系,家畜干細(xì)胞系的質(zhì)量也得到了明顯提升。2009年,Cao等[67]在牛ESCs建系的過程中使用了FGF,結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加FGF有助于牛ESCs的維持。次年,Vassiliev等[19]嘗試用LIF、Activin A、FGF2穩(wěn)定豬ESCs,得到了1株ESCs,并得到了嵌合體,但該細(xì)胞系仍不能在體外長期穩(wěn)定維持。2011年,Zhao等[70]從綿羊E6-E8胚胎ICM中分離ESCs,在添加CHIR99021和FGF的培養(yǎng)體系中獲得了能傳30代的綿羊ESCs,該綿羊ESCs表達(dá)多種多能干細(xì)胞標(biāo)志物,注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)觀察到畸胎瘤產(chǎn)生,但僅能從畸胎瘤中找到外胚層和中胚層組織。2012年,在含有GSK3β抑制劑CHIR99021和MEK抑制劑PD184352的培養(yǎng)體系下,1株可傳100代的豬ESCs成功建系[81]。2013年,兩項(xiàng)關(guān)于牛ESCs的研究表明,CHIR99021和PD0325901能有效促進(jìn)牛ESCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物[82-83]。2018年,Bogliotti等[84]在牛ESCs建系上取得了重大進(jìn)展,該研究參考了人ESCs的培養(yǎng)方法,使用添加FGF2和IWR-1的“CTFR”培養(yǎng)體系,從體外胚胎中獲取了具有primed狀態(tài)多能性特征的牛ESCs。該細(xì)胞系能進(jìn)行中長期傳代,70代后仍具有多能干細(xì)胞的正常形態(tài)、核型、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳學(xué)特征,并能產(chǎn)生畸胎瘤,沒有產(chǎn)生嵌合體。隨后,Vilarino等[77]基于該培養(yǎng)體系獲得了綿羊ESCs,該細(xì)胞系能穩(wěn)定傳代40代以上,形態(tài)、核型、多能性標(biāo)志物表達(dá)穩(wěn)定,能形成包含三胚層組織的畸胎瘤,未能形成嵌合體。這些研究同時也表明牛和羊ESCs的產(chǎn)生與維持依賴于培養(yǎng)基中IWR1和FGF的添加。2021年,Yu等[14]在含有FGF、Activin A、CHIR99021和PD0325901的培養(yǎng)體系中獲得了馬ESCs和非轉(zhuǎn)基因馬iPSCs。

這些早期研究表明,對于各種大家畜,干細(xì)胞多能性維持所依賴的信號通路相對保守,對JAK/STAT、Activin/Nodal、FGF/ERK、Wnt/β-catenin等通路的調(diào)節(jié)是大家畜ESCs成功建系的關(guān)鍵。

2.3.2 家畜iPSCs建系的嘗試 在家畜iPSCs的早期研究中,除傳統(tǒng)的OSKM四因子外,NANOG、LIN28、TERT等因子也常被補(bǔ)充到誘導(dǎo)體系中。綜合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,在OSKM的基礎(chǔ)上增補(bǔ)因子對牛[31,85]、羊[33]iPSCs誘導(dǎo)效率有明顯影響,但對iPSCs多能性的影響有限;外源因子的物種來源對iPSCs的誘導(dǎo)效率和質(zhì)量有一定影響,使用同種因子誘導(dǎo)iPSCs通常具有較高的效率和比較理想的多能性狀態(tài)[86]。

后期關(guān)于iPSCs的研究多圍繞誘導(dǎo)體系的開發(fā)與優(yōu)化[87]、改進(jìn)培養(yǎng)條件以提高iPSCs產(chǎn)生效率[88]和減少iPSCs凋亡[89]等問題開展研究。2021年,Yoshimatsu等[76]通過化學(xué)小分子誘導(dǎo)法,在大家畜中實(shí)現(xiàn)了非轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)、內(nèi)源基因維持的重編程,誘導(dǎo)豬等多種哺乳動物成纖維細(xì)胞重編程,獲得了iPSCs,并成功誘導(dǎo)其分化為三胚層組織。非轉(zhuǎn)基因iPSCs具有與ESCs相似的特征,來源比ESCs更廣泛,且被認(rèn)為比轉(zhuǎn)基因iPSCs更安全,有望成為干細(xì)胞研究、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域新的有力工具。

2.3.3 建立穩(wěn)定的豬多能干細(xì)胞系 雖然關(guān)于建立豬ESCs和豬iPSCs的報(bào)道很多,但前者不能長期穩(wěn)定傳代,后者缺乏naive干細(xì)胞的一些特性,如TBX3和KLF4的表達(dá)等,很多iPSCs外源因子無法沉默[90-91],二者都未達(dá)到體內(nèi)多能干細(xì)胞的多能性狀態(tài),大部分只能稱作“類ESCs”、“類iPSCs”。為了在大家畜中產(chǎn)生“真正的多能干細(xì)胞”,需要對胚胎發(fā)育早期的多能性變化規(guī)律進(jìn)行深入研究。近年來,一些研究揭示了豬早期胚胎轉(zhuǎn)錄組的譜系特異性、干細(xì)胞多能性變化和X染色體失活的特征[2,43,92],報(bào)道了豬與人或猴早期胚胎的種間差異[17]。2021年,Yoshimatsu等[76]報(bào)道了一種不含轉(zhuǎn)基因的豬多能干細(xì)胞,該細(xì)胞能在含有Wnt信號通路抑制劑IWP2的培養(yǎng)基中長期保持多能性,表明抑制Wnt信號通路可能是豬多能干細(xì)胞維持的關(guān)鍵。

在這些研究的基礎(chǔ)上,穩(wěn)定的豬原腸化前上胚層干細(xì)胞(pre-gastrulation epiblast stem cells, pgEpiSCs)成功建系[57]。該研究使用Wnt抑制劑IWR-1-endo和GSK3β抑制劑CHIR99021對Wnt信號通路進(jìn)行綜合調(diào)節(jié),抑制早期胚胎向原腸胚發(fā)育,并促進(jìn)干細(xì)胞穩(wěn)定增殖,用SRC抑制劑WH-4-023阻斷上皮-間充質(zhì)自發(fā)轉(zhuǎn)化,使用人源LIF(L)、Activin A(A)、FGF(F)穩(wěn)定并增強(qiáng)干細(xì)胞的多能性,開發(fā)了包含三種抑制劑和三種細(xì)胞因子的新型“3i/LAF”培養(yǎng)體系。基于該培養(yǎng)體系,從豬E10外胚層細(xì)胞中建立了可穩(wěn)定傳代240代以上,核型和分化潛能仍保持穩(wěn)定的多能干細(xì)胞系,并對其進(jìn)行了3次連續(xù)基因編輯,產(chǎn)生了多基因編輯仔豬。隨后,不依賴外源基因的豬iPSCs也在該體系中成功產(chǎn)生,該細(xì)胞系與pgEpiSCs具有相似性,能夠在體外長期穩(wěn)定維持多能性[93]。

穩(wěn)定豬多能干細(xì)胞的成功建系是大家畜干細(xì)胞研究的重要突破,多基因編輯的成功可以降低復(fù)雜動物模型制作的成本和難度。此外,牛和羊ESCs的多能性相關(guān)通路與豬具有相似性,穩(wěn)定豬多能干細(xì)胞系首先成功建立,對其它大家畜穩(wěn)定多能干細(xì)胞的建系有指導(dǎo)和啟發(fā)的作用。

3 大家畜多能干細(xì)胞的應(yīng)用前景與展望

多能干細(xì)胞因具有多向分化潛力,且易于進(jìn)行基因編輯,在生物學(xué)基礎(chǔ)研究、動物育種、醫(yī)學(xué)、食品生產(chǎn)等方面有廣闊的應(yīng)用前景(圖1)。目前,多能干細(xì)胞的應(yīng)用還處在研究和探索階段,尚未大規(guī)模應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

圖1 家畜多能干細(xì)胞的應(yīng)用前景Fig.1 Application prospects of livestock pluripotent stem cells

3.1 在家畜育種與繁殖中的應(yīng)用前景

傳統(tǒng)家畜育種方法要求將每一代家畜飼養(yǎng)到能穩(wěn)定產(chǎn)生配子,這通常需要一年以上的時間。為了繞過這一耗時很長的過程,有科學(xué)家提出了干細(xì)胞育種概念。干細(xì)胞育種的核心技術(shù)是在體外獲得家畜多能干細(xì)胞,將所獲得的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞,再結(jié)合體外受精、單精子顯微注射等技術(shù)產(chǎn)生受精卵。通過這種方式,可以有效縮短世代間隔、提高育種效率,加速家畜育種進(jìn)程,還能增加每個個體產(chǎn)生的配子數(shù)目,快速獲得大量遺傳物質(zhì)相同的個體,有利于良種擴(kuò)繁[94]。

哺乳動物的精子由精原細(xì)胞經(jīng)多級分裂和分化產(chǎn)生[95]。目前,小鼠多能干細(xì)胞向精原干細(xì)胞的體外分化誘導(dǎo)研究最成熟,已經(jīng)可以在體外獲得功能性生殖細(xì)胞,并由此產(chǎn)生生殖功能正常的后代[96]。在大家畜中,已有多項(xiàng)關(guān)于精原細(xì)胞增殖、精子發(fā)生和活性維持等的研究[97-98],但從干細(xì)胞建立的生殖細(xì)胞仍存在一些不足,培養(yǎng)體系有待改進(jìn)和完善[94]。

哺乳動物的卵子來源于卵巢中的卵原細(xì)胞。卵子的發(fā)生依靠卵巢和卵泡組織的調(diào)控,這種復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)難以在體外模擬[15,22]。由人和小鼠多能干細(xì)胞產(chǎn)生卵巢組織或卵原細(xì)胞的研究已經(jīng)成功[22,99],為大家畜卵子的體外建立提供了思路。

3.2 在人類醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景

基因編輯是制作疾病模型的一種方法,多能干細(xì)胞易于進(jìn)行基因編輯,且具有強(qiáng)大的增殖和分化能力,因此長期以來一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。多能干細(xì)胞與基因編輯、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)結(jié)合,在病理學(xué)研究、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景[45]。多年來,小鼠、人和非人靈長類動物多能干細(xì)胞在心臟疾病[100]、血液系統(tǒng)疾病[101]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[102]等領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展,在藥物試驗(yàn)方面也有應(yīng)用。但由于體外試驗(yàn)難以建立完全符合真實(shí)動物機(jī)體環(huán)境的條件,很多干細(xì)胞治療方法在臨床上遭遇失敗[45]。

與小鼠、犬等實(shí)驗(yàn)動物相比,豬在進(jìn)化上距離人類更近[103],并且在解剖結(jié)構(gòu)[104-105]、生理機(jī)能[105-106]、早期胚胎發(fā)育[48]等方面與人類更接近;與猴等非人靈長類動物相比,豬的繁殖率更高,性成熟更早[103],適合作為醫(yī)學(xué)研究中的模式動物。目前,豬已開始成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的實(shí)驗(yàn)動物,豬多能干細(xì)胞現(xiàn)已被應(yīng)用于心血管疾病、結(jié)腸癌、骨肉瘤、糖尿病、囊性纖維化、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、阿爾茨海默病、亨廷頓病、免疫系統(tǒng)疾病等人類疾病研究中的動物模型建立[42,106-108]。牛、羊和馬也開始成為研究人類疾病的模式動物。奶牛與人具有相似的生殖周期,具備成為研究人類卵巢和子宮疾病模型的可能[42]。綿羊體型較大,天性溫馴,便于手術(shù)操作,可用于手術(shù)技術(shù)優(yōu)化;呼吸系統(tǒng)與人類相似,可作為哮喘等呼吸道疾病的模型,也被用于鼻噴疫苗研發(fā)[109]。馬與人在運(yùn)動機(jī)能、肌腱組成及結(jié)構(gòu)、肌腱損傷方式上具有相似性,將馬多能干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為肌腱組織,可以作為研究人類骨骼與肌肉損傷的模型[110]。除制作疾病模型外,多能干細(xì)胞已經(jīng)可以被誘導(dǎo)分化為肝[111]、胰腺[112]、神經(jīng)組織[113-114]、肌肉組織[110]、內(nèi)耳組織[115]、腸道[116]等器官(類器官)和組織,與動物體內(nèi)試驗(yàn)相比,這些由干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成的組織便于觀察、檢測和操作;與細(xì)胞試驗(yàn)相比,這些組織可以更有效地模擬體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境,為病理研究、藥物開發(fā)領(lǐng)域提供一種新的體外模型。若能進(jìn)一步將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有正常結(jié)構(gòu)和功能,并且體積與真實(shí)人體器官相近的體外器官,可以填補(bǔ)移植用器官的需求缺口;另一種思路是對動物多能干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯,產(chǎn)生基因編輯動物,從動物體內(nèi)獲取不會引起人免疫排斥的異種器官。后者的相關(guān)研究已取得初步成果[117-118]。

3.3 作為細(xì)胞培養(yǎng)肉種子細(xì)胞

進(jìn)入21世紀(jì)以來,隨著世界各國經(jīng)濟(jì)和人口規(guī)模迅速增長,對肉類食品的需求也在持續(xù)上升。在市場需求的拉動下,畜牧業(yè)快速發(fā)展,不僅帶來了大量的碳排放和其他污染,還增大了人畜共患病傳播等公共衛(wèi)生的潛在風(fēng)險(xiǎn);過快的發(fā)展導(dǎo)致很多養(yǎng)殖場飼養(yǎng)密度大、飼養(yǎng)環(huán)境差,也伴隨著動物福利方面的問題。為減少畜牧業(yè)對地球環(huán)境的污染,同時更好地提升動物福利、減少人畜共患病的傳播,迫切需要開發(fā)一種綠色、低碳、安全的肉類替代品。

細(xì)胞培養(yǎng)肉是一項(xiàng)新興生物技術(shù),主要原理是通過從家畜體內(nèi)直接提取或其他方法獲得具有產(chǎn)生肌肉能力的干細(xì)胞,通過細(xì)胞工程手段,在發(fā)酵罐等工業(yè)設(shè)備中使其生長,從培養(yǎng)基上而不是畜禽體內(nèi)獲得肉類。與傳統(tǒng)畜牧業(yè)相比,細(xì)胞培養(yǎng)肉預(yù)計(jì)可以節(jié)約7%～45%的能源、82%～96%的用水、近99%的用地,污染物排放預(yù)計(jì)減少78%～96%,且由于培養(yǎng)過程在潔凈工廠、密閉設(shè)備中進(jìn)行,基本可以杜絕人畜共患病傳播的風(fēng)險(xiǎn)[119]。

作為一項(xiàng)新興技術(shù),細(xì)胞培養(yǎng)肉仍面臨很多重大技術(shù)瓶頸,如用于培養(yǎng)的干細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)、培養(yǎng)基成分設(shè)計(jì)、工業(yè)生產(chǎn)用大型生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)、3 D組織支架生產(chǎn)、肌肉與脂肪等不同組織之間組裝等[119-120],這些技術(shù)難題都是細(xì)胞培養(yǎng)肉發(fā)展需要攻克的重要障礙。

目前,能穩(wěn)定傳代的豬和牛多能干細(xì)胞系已經(jīng)建立,為細(xì)胞培養(yǎng)肉提供了可能的細(xì)胞來源[57,90]。由豬iPSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生骨骼肌的研究已經(jīng)成功[121],包含肌肉纖維、脂肪組織和毛細(xì)血管的細(xì)胞培養(yǎng)牛肉也已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室成功獲得[122]。雖然細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)距離向市場大規(guī)模推廣還有很長的距離,但已經(jīng)可以預(yù)見,細(xì)胞培養(yǎng)肉具有在未來成為低碳、節(jié)能、安全、營養(yǎng)的新型食品的潛力。

4 總 結(jié)

目前,豬的穩(wěn)定ESCs已經(jīng)成功建系,牛、羊、馬等常見家畜ESCs的建系也取得了一定進(jìn)展,但后者在穩(wěn)定性方面仍存在不足,無法產(chǎn)生嵌合體或ESCs對嵌合體貢獻(xiàn)極低,未見產(chǎn)生四倍體補(bǔ)償胚胎的報(bào)道。不同物種的多能性調(diào)控機(jī)制存在差異,想要更好地建立各種家畜的穩(wěn)定ESCs系,需要對這些家畜早期胚胎中多能性調(diào)節(jié)過程進(jìn)行深入研究。此前的一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)豬、牛、羊等家畜在多能性調(diào)節(jié)通路方面存在相似性,參考穩(wěn)定豬ESCs的建系方法,并結(jié)合其它大家畜的早期胚胎發(fā)育特點(diǎn),可能有助于其它家畜ESCs的建立。

在iPSCs方面,各種大家畜的iPSCs均已建立,并具備比較穩(wěn)定的多能性,但很多家畜iPSCs的維持依賴外源基因表達(dá),外源基因不能沉默是家畜iPSCs研究中亟待解決的問題。在家畜iPSCs產(chǎn)生嵌合體的嘗試中,iPSCs對嵌合后代的貢獻(xiàn)較低,反映這些iPSCs的多能性仍有不足。此外,對于iPSCs的應(yīng)用,安全性問題仍是主要疑慮之一?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)基因iPSCs已經(jīng)在小鼠上取得成功,有望成為一種更安全的多能干細(xì)胞來源,而大家畜仍需要繼續(xù)探索不依賴轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)方法。

家畜多能干細(xì)胞在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、動物育種、再生醫(yī)學(xué)、食品生產(chǎn)等多領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力,但很多領(lǐng)域還無法將研究結(jié)果應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn),對家畜多能干細(xì)胞開展深入的研究有重要意義。隨著對于家畜干細(xì)胞多能性調(diào)控機(jī)理的深入解析,相信在不久的將來,多能干細(xì)胞可以在各領(lǐng)域大放異彩。