孫盼盼,曹志剛,凌小雅,孫 娜,孫耀貴,李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太谷 030801)

細(xì)菌與病毒的混合感染在豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)中普遍存在,與單一病原體感染相比,這可能對(duì)豬群的健康構(gòu)成更大的威脅,也給疾病的治療帶來挑戰(zhàn)[1-2]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種重要的呼吸道疾病病原體,豬感染PRRSV后以出現(xiàn)免疫抑制為特點(diǎn),常與其他豬病混合感染或者繼發(fā)感染。已有的研究報(bào)道,PRRSV和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共感染仔豬能夠誘導(dǎo)仔豬肺部強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)IL-1和TNF-α等炎癥因子的高表達(dá)[3]。PRRSV與LPS協(xié)同作用顯著增加豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophage,PAMs)中IL-1β和TNF-α的分泌[4]。副豬嗜血桿菌感染可增強(qiáng)高致病性PRRSV感染介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的分泌顯著升高[5]。中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期在PAMs上通過轉(zhuǎn)染PRRSV 5′UTR RNA或單獨(dú)使用LPS刺激,發(fā)現(xiàn)PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激能夠誘導(dǎo)PAMs產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)顯著升高;以PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激PAMs為炎癥模型,證明苦參堿可通過抑制MyD88/NF-κB信號(hào)通路以及NLRP3炎癥小體的激活來抑制IL-1β的產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎作用[6]。

抗生素具有抗菌、保健和促生長(zhǎng)等作用[7-9],但是隨著獸藥殘留、細(xì)菌耐藥性和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量不合格等問題的出現(xiàn),減抗、替抗迫在眉睫。目前,國(guó)內(nèi)外替代飼用化學(xué)品的相關(guān)研究主要集中在中獸藥、植物源性提取物、微生態(tài)制劑和酶制劑等[10-11]。本試驗(yàn)選擇5種臨床上常用的獸用抗生素:阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星[12],以PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激的PAMs為炎癥模型,IL-1β為檢測(cè)指標(biāo),從中篩選出與苦參堿具有相似抗炎作用的抗生素,然后通過與苦參堿的聯(lián)合使用,確定與苦參堿具有交互作用的抗生素,以期為苦參堿作為抗生素替代物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

本試驗(yàn)所用藥物相關(guān)信息見表1。

表1 本試驗(yàn)涉及藥物相關(guān)信息

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

主要試劑:RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco,胎牛血清(FBS)購(gòu)自以色列BI(Biological Industries),轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)QIAGEN,TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)TaKaRa,2×SYBR Green Low ROX qPCR Master Mix、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購(gòu)自中國(guó)Bimake,RIPA裂解液(強(qiáng))和增強(qiáng)型蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天,DH-5α感受態(tài)細(xì)胞和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自中國(guó)TIAIVGEN,線性化純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega,MEGAclearTMKit Purification for Large Scale Transcription Reactions購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific,RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega。

主要儀器設(shè)備:倒置顯微鏡(Olympus,日本)、CO2培養(yǎng)箱(Heal force,中國(guó))、核酸蛋白濃度測(cè)定儀(NanoDrop,美國(guó))、ABI 7500定量PCR儀(ABI,美國(guó))、離心機(jī)(Sigma,德國(guó))、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(Bio rad,美國(guó))、恒溫振蕩培養(yǎng)器(上海智城,中國(guó))。

1.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.3.1 不同抗生素在PAMs上的細(xì)胞毒性 原代PAMs由中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取凍存[6]。復(fù)蘇原代PAMs接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后,分別用DMSO溶解阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星,用細(xì)胞維持液(2% FBS)連續(xù)2倍倍比稀釋成10個(gè)濃度梯度,加入接種PAMs的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,100 μL·孔-1,每個(gè)濃度梯度重復(fù)4孔,同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照(只加100 μL細(xì)胞維持液),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待培養(yǎng)72 h后,棄上清,每孔加入20 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄MTT,每孔加入150 μL DMSO,37 ℃孵育30 min,待結(jié)晶完全溶解后,490 nm處檢測(cè)OD值。以細(xì)胞病變程度和所測(cè)得OD490 nm值為依據(jù),用下列公式計(jì)算細(xì)胞的存活率,確定不同抗生素在PAMs上的最大安全濃度(maximum no-cytotoxic concentration,MNTC)。

1.3.2 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素在PAMs上的細(xì)胞毒性 以苦參堿、阿莫西林和金霉素在PAMs上最大安全濃度為起始濃度,分別連續(xù)2倍倍比稀釋3個(gè)濃度梯度,按表2進(jìn)行苦參堿與阿莫西林/金霉素的聯(lián)合使用,加入至已接種PAMs的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,100 μL·孔-1,每組4個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組,72 h后,MTT法檢測(cè)聯(lián)合用藥后藥物對(duì)PAMs的細(xì)胞毒性。

表2 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素在PAMs上細(xì)胞毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 PRRSV 5′UTR RNA的制備

PRRSV 5′UTR RNA由中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存[6]。制備過程如下:PRRSV感染Marc-145細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞樣品,提取細(xì)胞總RNA,以合成的cDNA為模板,普通PCR擴(kuò)增PRRSV 5′UTR(引物序列見表3)。PCR反應(yīng)結(jié)束后,3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因條帶并進(jìn)行膠回收,送北京華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證,比對(duì)正確后,將膠回收產(chǎn)物、載體pcDNA3.1(+) DNA分別進(jìn)行雙酶切,然后連接、轉(zhuǎn)化,導(dǎo)入DH-5α感受態(tài)細(xì)胞。提取菌液質(zhì)粒DNA并進(jìn)行單酶切,酶切產(chǎn)物線性化純化,參照RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 and T7(Promega)試劑盒進(jìn)行體外RNA轉(zhuǎn)錄,參照MEGAclearTMKit Purification for Large Scale Transcription Reactions(ThermoFisher)說明書將RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后純化。核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定純化后RNA的濃度,分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 引物信息

1.5 不同抗生素對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達(dá)的影響

PAMs以1×106個(gè)·mL-1接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)2 h后棄掉未貼壁的細(xì)胞,加入新的10%培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染4 μg PRRSV 5′UTR RNA的同時(shí)加入1 μg·mL-1LPS,共同刺激細(xì)胞6 h后,分別加入2 mL最大安全濃度的阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考或替米考星,繼續(xù)作用6 h,收集細(xì)胞,參照TaKaRa TRIzol總RNA提取試劑說明書提取細(xì)胞總RNA,qPCR檢測(cè)IL-1βmRNA的表達(dá)。引物序列見表3。

1.6 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β表達(dá)的影響

試驗(yàn)分組見表4,PAMs以1×106個(gè)·mL-1接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)2 h后棄掉未貼壁的細(xì)胞,加入新的10%培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。4 μg 5′UTR RNA和1 μg·mL-1LPS共同刺激細(xì)胞6 h后,分別加入2 mL不同濃度聯(lián)合的苦參堿和阿莫西林/金霉素,繼續(xù)作用6 h,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA和蛋白,qPCR檢測(cè)IL-1βmRNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)IL-1β蛋白的表達(dá)。

表4 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素試驗(yàn)表

1.7 Western blot檢測(cè)IL-1β蛋白的表達(dá)

參照碧云天Western blot及IP細(xì)胞裂解液說明書進(jìn)行裂解液的配制,提取細(xì)胞總蛋白。按照碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書檢測(cè)各樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別加入用TBST稀釋后的IL-1β(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)抗體,室溫孵育2 h,TBST洗膜3次后,用1∶20 000比例稀釋特異性二抗,37 ℃孵育1 h,洗膜3次,滴加適量ECL化學(xué)發(fā)光液,用X-ray膠片在暗室曝光,膠片晾干后掃描保存,掃描的圖像用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

藥物交互作用采用Excel進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析,其他數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5(GraphPad Software, Inc. California, USA)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)(Bonferroni: Compare all pairs of columns或Dunnett: Compare all columns vs. control columns),所有數(shù)據(jù)均以“Mean ± SEM”表示。

2 結(jié) 果

2.1 不同抗生素在PAMs上的細(xì)胞毒性

將不同濃度梯度的阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星接種到PAMs上培養(yǎng)72 h,通過觀察細(xì)胞病變和MTT法測(cè)定藥物在所設(shè)濃度梯度內(nèi)的最大安全濃度(MNTC)。結(jié)果見表5,阿莫西林的MNTC為1 mg·mL-1,金霉素的MNTC為0.05 mg·mL-1、鹽酸多西環(huán)素的MNTC為0.004 375 mg·mL-1、氟苯尼考的MNTC為0.425 mg·mL-1、替米考星的MNTC為0.106 25 mg·mL-1。

表5 不同抗生素的最大溶解度和在PAMs上的最大安全濃度

2.2 不同抗生素對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達(dá)的影響

根據(jù)5種抗生素在PAMs上的細(xì)胞毒性結(jié)果,在最大安全濃度下檢測(cè)不同抗生素對(duì)PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激誘導(dǎo)的IL-1βmRNA表達(dá)的影響。結(jié)果如圖1A所示,與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考均能顯著抑制IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05),替米考星對(duì)IL-1βmRNA的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05)。與苦參堿用藥組相比,阿莫西林和金霉素與苦參堿具有相似的抑制效果(P>0.05),因此,選擇阿莫西林和金霉素進(jìn)行后續(xù)聯(lián)合用藥試驗(yàn)。

不同濃度的阿莫西林或金霉素作用于PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激的PAMs 6 h后,qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,1 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的阿莫西林顯著降低IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05),0.25 mg·mL-1的阿莫西林對(duì)IL-1βmRNA的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05,圖1B);0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1的金霉素顯著降低IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05),0.012 5 mg·mL-1的金霉素對(duì)IL-1βmRNA的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05,圖1C)。

2.3 苦參堿聯(lián)合阿莫西林/金霉素在PAMs上的細(xì)胞毒性結(jié)果

選擇最大濃度苦參堿與不同濃度的阿莫西林/金霉素聯(lián)合以及最大濃度的阿莫西林/金霉素與不同濃度的苦參堿聯(lián)合,PAMs用藥72 h后,不同濃度的苦參堿和阿莫西林聯(lián)合后,細(xì)胞存活率均大于80%(圖2A);不同濃度的苦參堿和金霉素聯(lián)合使用72 h后,僅0.4 mg·mL-1苦參堿+0.012 5 mg·mL-1金霉素組的細(xì)胞存活率大于80%,其余各組的細(xì)胞存活率均低于80%(圖2B)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示,苦參堿和金霉素聯(lián)合使用6和12 h時(shí),PAMs未出現(xiàn)細(xì)胞病變情況,細(xì)胞呈圓形,折光性好,聯(lián)合使用24 h后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變,細(xì)胞皺縮、裂解等。

《西行漫記》正是在這一時(shí)代背景下完成的，它是一部文筆優(yōu)美的紀(jì)實(shí)性很強(qiáng)的報(bào)道性作品。1936年6月至10月期間，作者埃德加·斯諾在以延安為中心的陜甘寧邊區(qū)進(jìn)行實(shí)地采訪，真實(shí)記錄了我國(guó)西北革命根據(jù)地的所見所聞。

A. 苦參堿與阿莫西林聯(lián)合在PAMs上的細(xì)胞毒性;B. 苦參堿與金霉素聯(lián)合在PAMs上的細(xì)胞毒性A. Cytotoxicity of Matrine and Amoxicillin combined on PAMs. B. Cytotoxicity of Matrine and Aureomycin combined on PAMs圖2 苦參堿與阿莫西林/金霉素聯(lián)合在PAMs上的細(xì)胞毒性結(jié)果Fig.2 Cytotoxicity of Matrine combined Amoxicillin/Aureomycin on PAMs

2.4 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達(dá)的影響

與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,0.1 mg·mL-1苦參堿+0.25 mg·mL-1阿莫西林聯(lián)合處理對(duì)IL-1βmRNA的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05),其余各加藥組均能顯著降低IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05)。與1 mg·mL-1單獨(dú)的阿莫西林加藥組相比,苦參堿和阿莫西林聯(lián)合用藥組中0.4 mg·mL-1+1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1聯(lián)合顯著降低IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05),0.4 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+1 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1聯(lián)合對(duì)IL-1βmRNA的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05),但是0.1 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1聯(lián)合顯著升高IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05,圖3)。

圖3 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Matrine and Amoxicillin combined on the mRNA expression of IL-1β in PAMs inflammatory model

2.5 苦參堿聯(lián)合金霉素對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達(dá)的影響

與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,苦參堿聯(lián)合金霉素組0.4 mg·mL-1+0.025 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1+0.012 5 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+0.025 mg·mL-1,0.1 mg·mL-1+0.012 5 mg·mL-1對(duì)PAMs炎癥模型IL-1βmRNA的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05),其余各聯(lián)合用藥組均能顯著降低IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05)。與0.05 mg·mL-1單獨(dú)的金霉素加藥組相比,苦參堿和金霉素聯(lián)合用藥組0.2 mg·mL-1+0.012 5 mg·mL-1顯著升高IL-1βmRNA的表達(dá)(P<0.05),其余各聯(lián)合用藥組均無顯著差異(P>0.05,圖4)。

圖4 苦參堿聯(lián)合金霉素對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Matrine and Aureomycin combined on the mRNA expression of IL-1β in PAMs inflammatory model

2.6 苦參堿與阿莫西林/金霉素聯(lián)合交互作用分析

分別將苦參堿與阿莫西林或金霉素聯(lián)合使用后對(duì)PAMs炎癥模型中IL-1βmRNA表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析,結(jié)果顯示苦參堿與阿莫西林之間存在交互作用(P=2.89×10-8,表6),苦參堿與金霉素之間不存在交互作用(P=0.121 013,表7)。

表6 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對(duì)IL-1β mRNA表達(dá)影響的方差分析結(jié)果

表7 苦參堿聯(lián)合金霉素對(duì)IL-1β mRNA表達(dá)影響的方差分析結(jié)果

2.7 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5),與PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激組相比,0.1 mg·mL-1苦參堿+0.25 mg·mL-1阿莫西林聯(lián)合處理對(duì)IL-1β蛋白的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05),其余加藥處理組均能顯著降低IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.05)。與1 mg·mL-1單獨(dú)的阿莫西林加藥組相比,苦參堿和阿莫西林聯(lián)合用藥組中0.4 mg·mL-1+1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1+1 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1聯(lián)合顯著降低IL-1β蛋白的表達(dá)(P< 0.05),0.1 mg·mL-1+1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1+0.5 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1+0.25 mg·mL-1聯(lián)合對(duì)IL-1β蛋白的表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05),表明在降低阿莫西林用量的時(shí)候加入苦參堿,能夠達(dá)到相同或更顯著的抗炎效果,苦參堿能夠替代部分阿莫西林的藥效,降低阿莫西林的使用量。

圖5 苦參堿聯(lián)合阿莫西林對(duì)PAMs炎癥模型IL-1β蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Matrine and Amoxicillin combined on the protein expression of IL-1β in PAMs inflammatory model

3 討 論

面對(duì)飼用化學(xué)品添加對(duì)動(dòng)物源性食品質(zhì)量和公共衛(wèi)生安全造成的嚴(yán)重威脅,許多國(guó)家在養(yǎng)殖生產(chǎn)中禁止或限制添加抗生素等化學(xué)品。2019年以來,我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相繼發(fā)布多個(gè)公告限制或禁止抗生素的使用,2020年7月1日起,飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料,2021年10月,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《全國(guó)獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)方案(2021—2025年)》。2021年11月,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于推介發(fā)布2021年農(nóng)業(yè)主推技術(shù)的通知中,遴選了114項(xiàng)農(nóng)業(yè)主推技術(shù),畜禽抗生素減量替代技術(shù)位列其中。近幾年,中獸藥及其提取物在防治動(dòng)物疾病、提高機(jī)體免疫功能、緩解炎癥反應(yīng)等的臨床應(yīng)用中顯示了良好的效果。本課題組長(zhǎng)期從事中藥提取物抗病毒、抗炎作用及機(jī)制的研究,證明苦參堿具有抗PRRSV和豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)作用[13],對(duì)PRRSV/PCV2共感染昆明小鼠誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺炎有顯著的治療作用[14],還可以抑制PRRSV和LPS共刺激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]。

氟苯尼考、強(qiáng)力霉素(鹽酸多西環(huán)素)和替米考星在臨床上常用于防治家禽呼吸道疾病,強(qiáng)力霉素能夠抑制PRRSV的復(fù)制,2015年的統(tǒng)計(jì)報(bào)道顯示阿莫西林和氟苯尼考作為廣譜抗菌藥,使用量居全國(guó)前兩位[12]。本試驗(yàn)通過選擇臨床上常用的五種抗生素阿莫西林、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和替米考星,以IL-1βmRNA為檢測(cè)指標(biāo),篩選與苦參堿具有相似抑制效果的抗生素,結(jié)果顯示阿莫西林和金霉素對(duì)IL-1βmRNA抑制效果與苦參堿相似。通過與苦參堿的聯(lián)合使用,qPCR結(jié)果顯示苦參堿與金霉素聯(lián)合使用后沒有交互作用,苦參堿和阿莫西林之間存在交互作用?？鄥A與阿莫西林聯(lián)合使用后苦參堿能夠替代部分阿莫西林的用量達(dá)到相同或更顯著的效果,一定程度上降低了阿莫西林的用量。本研究為苦參堿的臨床試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支撐,為苦參堿作為抗生素的替代物,降低抗生素使用提供依據(jù),為合理解決抗生素耐藥性等問題提供有效策略。

4 結(jié) 論

在抗PRRSV 5′UTR RNA和LPS共刺激誘導(dǎo)的IL-1β表達(dá)中,苦參堿能替代部分阿莫西林的藥效,減少阿莫西林的使用量,為苦參堿作為阿莫西林的替代物以及臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。