屈雅娟，張敬芳，孫旗，王雄，易文媛，陳賁，彭攀，郭承熙

（長沙醫(yī)學院第一臨床學院，湖南 長沙 410219）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病發(fā)展形成的最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為24 h 尿微量白蛋白升高，也是導致終末期腎病最重要的病因［1］。糖尿病腎病發(fā)病機制復雜，氧化應激和糖代謝紊亂是導致DN病情發(fā)展的關鍵因素［2］。

中藥具有多靶點、作用協(xié)同等優(yōu)勢，對DN治療效果顯著。燈盞細辛為菊科短葶飛蓬（Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz）的干燥全草，具有益氣化陰、活血化瘀的作用，可改善DN糖代謝紊亂、氧化應激以及尿蛋白排泄率等［3-5］。依帕司他主要通過降低醛糖還原酶活性降低血糖水平，進而延緩DN病情進展以及改腎臟損傷，但其治療糖尿病腎病尚具有爭議，對腎臟具體的保護機制也尚不明確［4］。目前臨床上藥物治療DN時易受多種因素影響，且單一的用藥方案臨床治療效果尚有待提高，而中西醫(yī)結合治療方案治療糖尿病及其并發(fā)癥，可發(fā)揮其各自的優(yōu)勢，降低西藥毒副作用，延緩DN病情的發(fā)展［6］。本實驗觀察燈盞細辛聯(lián)合依帕司他對糖尿病腎病大鼠腎皮質中過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）表達的影響，深入探討燈盞細辛聯(lián)合依帕司他對氧化應激的調控作用。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，50 只，體質量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)室環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度40%～70%，明暗交替各12 h，實驗大鼠自由飲水、攝食。

1.2 試劑及藥物

高脂高糖飼料（南京盛民科研動物養(yǎng)殖場）；鏈脲佐菌素（STZ）（北京白鯊易科技有限公司，批號：BS185）；燈盞細辛提取物（燈盞花素）（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號：20210601）；依帕司他（南京海陵藥業(yè)有限公司，批號：21080045）；大鼠尿微量白蛋白（24 h UmAlb）試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司批號：20211127）；過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）（南京建成生物工程研究所，批號：20211127、20210909、20210916）。

1.3 方法

SD 雄性大鼠40 只，適應性喂養(yǎng)高脂高糖飲食1 周后，隨機分為模型組、依帕司他組、燈盞細辛組和聯(lián)合組，于左下腹單次注射1% STZ 55 mg/kg，注射后3 d于尾靜脈用血糖儀測空腹血糖值，若血糖值≥ 16.7 mmol/L，表示糖尿病模型建立完成。之后再給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)2 周，同時收集24 h 尿液，24 h UmAlb 為30～300 mg/24 h之間表示DN大鼠模型建立。依帕司他組在造模成功后灌胃依帕司他（100 mg/kg），給藥體積為10 mL/kg，給藥濃度為10 g/L，1次/d。燈盞細辛組在造模成功后灌胃燈盞細辛（200 mg/kg），給藥體積為10 mL/kg，給藥濃度為20 g/L，1次/d。聯(lián)合組在造模成功后灌胃同等劑量的依帕司他和燈盞細辛，1次/d。另選10只大鼠作為正常對照組，模型組和正常對照組給予5% CMCNa混懸液10 mL/kg灌胃，1次/d，連續(xù)6周。

1.4 觀察指標以及評價標準

①記錄造模前，造模后2、4、6 周末大鼠的體質量和空腹血糖。禁食不禁水12 h后，測定大鼠體質量，于大鼠尾靜脈用采血針扎取血液，測空腹血糖水平。②在造模前、造模后2 周、治療后4、6 周末收集大鼠24 h尿液，尿液樣本離心后移取其上清液后，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書方法測量每組大鼠的24 h UmAlb。③在治療后6 周末，將大鼠處死，取腎組織進行稱重，冷生理鹽水按1∶9 的質量體積比進行量取，再用勻漿機對組織勻漿繼續(xù)充分研碎，制成10%的腎組織勻漿，將獲得的組織勻漿離心后移取上清液，采用鉬酸銨法檢測腎皮質中過氧化氫酶（CAT）活性，WST1法檢測大鼠腎皮質中超氧化物歧化酶（SOD）活性，TBA法檢測腎皮質中丙二醛（MDA）含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學方法

計量資料采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件分析，并用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間平均值的差異采用單因素方差法分析，組間的兩兩比較采用LSD 和SNK法分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間點體質量的變化情況比較

造模后，模型組大鼠體質量有明顯的下降趨勢，治療后2、4、6 周末模型組大鼠體質量顯著低于造模前（P＜0.01）；在治療后4 周末，各給藥組體質量均顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），而聯(lián)合組大鼠體質量均高于依帕司他組和燈盞細辛組（P＜0.05，P＜0.01）；治療后6 周末，各給藥組體質量均顯著高于模型組（P＜0.01），聯(lián)合組大鼠體質量均高于依帕司他組和燈盞細辛組（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點體質量的變化情況比較（±s，g）

表1 各組大鼠不同時間點體質量的變化情況比較（±s，g）

注：與本組造模前比較，△△P＜0.01；與模型組同時間點比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與依帕司他組同時間點比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；與燈盞細辛組同時間點比較，□□P＜0.01。

治療后6周末493.3±28.2 308.9±20.6△△389.0±23.3☆☆348.5±19.6☆☆412.1±10.2☆☆◇□□組別正常對照組模型組依帕司他組燈盞細辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10造模前357.2±23.1 367.1±17.4 358.0±26.3 361.8±30.1 383.2±25.0治療后2周末403.9±18.8 340.5±13.7△△363.8±23.8 360.5±27.6 392.1±11.8治療后4周末435.7±19.4 324.2±8.2△△373.9±20.7☆344.9±20.5☆401.4±14.5☆◇◇□□

2.2 各組大鼠不同時間點血糖的變化情況比較

單次注射STZ 后，模型組和各給藥組的血糖值均＞16.7 mmol/L 且均顯著高于空白組（P＜0.01），提示糖尿病模型造模成功。治療后4、6 周末檢測發(fā)現(xiàn)各給藥組大鼠血糖呈現(xiàn)下降的趨勢。治療后4 周末，各給藥組血糖水平顯著低于模型組（P＜0.01），聯(lián)合組血糖水平顯著低于依帕司他帕司組和燈盞細辛組（P＜0.05）。治療后6 周末，各給藥組血糖水平顯著低于模型組（P＜0.01），聯(lián)合組大鼠血糖水平顯著低于依帕司他組和燈盞細辛組（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點血糖的變化情況比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠不同時間點血糖的變化情況比較（±s，mmol/L）

注：與正常對照組同時間點比較，△△P＜0.01；與模型組同時間點比較，☆☆P＜0.01；與依帕司他組同時間點比較，◇P＜0.05；與燈盞細辛組同時間點比較，□P＜0.05，□□P＜0.01。

治療后6周末5.8±0.5 29.1±2.9 13.5±3.1☆☆19.0±3.0☆☆11.3±3.3☆☆◇□□組別正常對照組模型組依帕司他組燈盞細辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10造模后3 d 5.2±0.2 28.8±1.6△△29.2±3.2△△31.6±1.3△△27.6±3.1△△治療后2周末5.2±1.1 27.3±3.3 17.9±4.1 21.4±2.5 17.0±1.1治療后4周末5.6±1.3 29.2±3.4 14.5±3.1☆☆20.5±3.2☆☆13.6±3.4☆☆◇□

2.3 各組大鼠不同時間點24h UmAlb的變化情況比較

在糖尿病模型造模后2周，模型組和各給藥組大鼠24 h UmAlb均顯著高于空白組（P＜0.01），再結合模型組和各給藥組大鼠血糖均＞16.7 mmol/L，提示糖尿病腎病模型造模成功。治療后4周、6周末檢測發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的24 h UmAlb有上升的趨勢，各給藥組有下降的趨勢。治療后6周末，聯(lián)合組大鼠24 h UmAlb顯著低于模型組、依帕司他組和燈盞細辛組（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同時間點24 h UmAlb的變化情況比較（±s，mg）

表3 各組大鼠不同時間點24 h UmAlb的變化情況比較（±s，mg）

注：與正常對照組同時間點比較，△△P＜0.01；與模型組同時間點比較，☆☆P＜0.01；與依帕司他組同時間點比較，◇P＜0.05；與燈盞細辛組同時間點比較，□P＜0.05。

治療后6周末6.8±1.0 56.9±6.0 21.3±4.8 30.2±5.2 17.3±3.6☆☆◇□組別正常對照組模型組依帕司他組燈盞細辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10造模前5.8±0.9 5.7±0.9 5.6±1.0 5.7±0.9 5.4±0.8造模后2周末5.5±0.6 36.1±5.7△△35.4±4.2△△36.1±3.0△△25.5±2.5△△治療后4周末5.4±1.1 51.3±6.2 27.1±3.3 33.4±2.7 17.9±3.1

2.4 各組大鼠CAT水平比較

CAT 是機體氧化應激的重要指標，其水平可反映機體對氧自由基清除的能力［7］。與正常對照組比較，模型組大鼠和各給藥組腎組織CAT 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，依帕司他組和聯(lián)合組大鼠腎組織CAT 水平顯著上升（P＜0.05，P＜0.01），燈盞細辛組雖然差異無統(tǒng)計學意義，但呈上升趨勢。聯(lián)合組大鼠腎組織CAT 水平比依帕司他組、燈盞細辛組顯著上升（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠CAT水平比較（±s，U/mg）

表4 各組大鼠CAT水平比較（±s，U/mg）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與依帕司他組比較，◇◇P＜0.01；與燈盞細辛組比較，□□P＜0.01。

CAT 54.3±3.6 18.6±2.6△△25.7±7.2△△☆25.6±5.0△△40.2±9.3△△☆☆◇◇□□組別正常對照組模型組依帕司他組燈盞細辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10

2.5 各組大鼠SOD水平比較

SOD 是機體氧化應激的重要指標，其水平可反映機體對氧自由基清除的能力［8］。與正常對照組比較，模型組大鼠和各給藥組腎組織SOD 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，依帕司他組、燈盞細辛組和聯(lián)合組大鼠腎組織SOD 水平顯著上升（P＜0.01）；聯(lián)合組大鼠腎組織SOD 水平比依帕司他組、燈盞細辛組顯著上升（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠SOD水平比較（±s，U/mg）

表5 各組大鼠SOD水平比較（±s，U/mg）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，☆☆P＜0.01；與依帕司他組比較，◇P＜0.05；與燈盞細辛組比較，□P＜0.05。

SOD 128.1±4.3 50.9±3.7△△87.7±5.7△△☆☆73.3±7.4△△☆☆109.1±7.5△△☆☆◇□組別正常對照組模型組依帕司他組燈盞細辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10

2.6 各組大鼠MDA水平比較

MDA 含量與腎組織損傷程度呈正相關，是典型的過氧化代謝產(chǎn)物［9］。與正常對照組比較，模型組大鼠和各給藥組腎組織MDA 水平上升（P＜0.01）；與模型組比較，依帕司他組、燈盞細辛組和聯(lián)合組大鼠腎組織MDA 水平顯著下降（P＜0.01）；聯(lián)合組大鼠腎組織MDA 水平比依帕司他組、燈盞細辛組顯著下降（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠MDA水平比較（±s，nmol/mg）

表6 各組大鼠MDA水平比較（±s，nmol/mg）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，☆☆P＜0.01；與依帕司他組比較，◇P＜0.05；與燈盞細辛組比較，□P＜0.05。

MDA 1.4±0.3 4.0±0.5△△3.0±0.3△△☆☆3.2±0.3△△☆☆2.0±0.7△△☆☆◇□組別正常對照組模型組依帕司他組燈盞細辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10

3 討論

氧化應激是導致糖尿病腎病發(fā)病的主要作用機制，體內蓄積大量的氧化應激產(chǎn)物損傷了臟器［10-11］。氧化應激損傷指標包括CAT、SOD 和MDA，其中SOD可調節(jié)機體氧化與抗氧化的平衡，避免細胞發(fā)生損傷，其活性的下降是機體氧化應激的主要生物指標［8］；CAT 是機體防御系統(tǒng)的主要自由基清除劑，其主要能夠清除過氧化氫，達到保護細胞的作用［7］；MDA是臨床上常用來反映機體氧化應激程度的標志物，其含量的升高會導細胞損傷加重［9］。本研究結果表明，模型組大鼠腎組織CAT和SOD活性顯著下降，MDA 含量顯著上升，提示模型組大鼠腎功能出現(xiàn)了明顯損傷。給予燈盞細辛聯(lián)合依帕司他治療后，腎組織SOD、CAT活性升高，MDA 含量下降，且作用效果顯著優(yōu)于單一給藥治療，表明燈盞細辛聯(lián)合依帕司他可上調CAT、SOD水平，降低MDA 含量，提示其可減輕糖尿病腎病大鼠機體的氧化應激，發(fā)揮抗氧化應激作用。

氧化應激與高血糖、腎功能均緊密相連［12］，有研究表明CAT 活性表達與血糖水平密切相關［13-14］，且高血糖是糖尿病腎病早期常見的并發(fā)癥，尿液出現(xiàn)微量白蛋白是糖尿病早期可能出現(xiàn)的特征性癥狀，及時控制糖尿病腎病高血糖和微量白蛋白含量是延緩糖尿病腎病病情發(fā)展的最重要環(huán)節(jié)［12，15-16］。本研究表明，糖尿病模型造模成功后2 周，模型組和各給藥組大鼠的血糖值均＞16.7 mmol/L 且24 h UmAlb 均大于30 mg，提示發(fā)生了糖尿病腎病。治療過程中，聯(lián)合組大鼠空腹血糖和24 h UmAlb 水平呈現(xiàn)顯著下降趨勢，體質量呈現(xiàn)顯著上升趨勢，且與正常大鼠的水平最接近。聯(lián)合給藥的降糖、減少尿蛋白的效果顯著強于單一給藥組。提示燈盞細辛聯(lián)合依帕司他可發(fā)揮協(xié)同作用，降低大鼠的空腹血糖和提高腎功能，對糖尿病腎病有一定的干預作用。

4 結論

綜上所述，燈盞細辛聯(lián)合依帕司他能明顯改善糖尿病腎病大鼠CAT、SOD、MDA 水平，提示其可能通過上調CAT、SOD 表達，降低MDA 表達進而調控糖尿病腎病氧化應激，改善機體血糖水平和腎臟功能，延緩病情發(fā)展，保護腎臟。