陳自喜 李錦澎 鄭 瑾 相芬芬 康向東 吳 蓉

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200062

慢性乙型肝炎是常見(jiàn)的感染性疾病，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在體內(nèi)長(zhǎng)期持續(xù)復(fù)制導(dǎo)致疾病慢性化，從而嚴(yán)重危害患者的健康[1-2]。免疫反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞因子活化、增殖在HBV DNA 長(zhǎng)期復(fù)制中發(fā)揮重要作用[3]。機(jī)體T 淋巴細(xì)胞亞群失衡，免疫功能發(fā)生紊亂，不能及時(shí)有效地識(shí)別、清除入侵的HBV 可導(dǎo)致疾病的長(zhǎng)期化、慢性化[4-6]。目前臨床有效診斷肝細(xì)胞損傷的金標(biāo)準(zhǔn)主要借助肝臟酶等，通過(guò)對(duì)肝臟酶檢測(cè)及時(shí)有效地評(píng)估肝細(xì)胞損傷程度并改善乙型肝炎患者的治療及預(yù)后。本研究通過(guò)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者血清HBV 載量、炎癥因子、外周血T 淋巴細(xì)胞亞群、肝臟酶的表達(dá)，進(jìn)一步探究機(jī)體感染HBV 后患者血清病毒載量與機(jī)體免疫功能變化關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年3 月至2022 年8 月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）收治的經(jīng)臨床確診為慢性乙型肝炎的患者85 例。根據(jù)HBV 載量，將其分為HBVDNA 陰性組（HBVDNA＜103IU/ml）（29例），HBV DNA 低載量組（HBV DNA 103～105IU/ml）（28 例）和HBV DNA 高載量組（HBV DNA＞105IU/ml）（28例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床診斷為慢性乙型肝炎患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有自身免疫系統(tǒng)性疾病、代謝性疾病、急性藥物肝損傷。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（PTEC-A-2021-28-1）。

1.2 儀器與試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司（SLAN-96P）；HBV DNA 檢測(cè)試劑盒（22028-2）購(gòu)自湖南圣湘生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。具體操作流程按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，正常的HBV DNA 病毒載量參考范圍＜1 000 IU/ml。淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)抗體（89173）和BD Trucount 絕對(duì)計(jì)數(shù)管（2236937）購(gòu)自美國(guó)BD 公司上海有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司上海有限公司（BD FACSCanto2）。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6（C22050118）、IL-8（C22010111）、IL-10（C22010118）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）（C22010119）試劑均購(gòu)自熱景（廊坊）生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞因子測(cè)定儀器為熱景C2000。應(yīng)用BECKMAN COULTER 全自動(dòng)生化儀（AU5831）檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）（AUZ 0960）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）（AUZ0157），具體操作流程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 HBV DNA 載量 所有研究對(duì)象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 ml，室溫靜止后，于4℃，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心半徑13.5 cm 的條件下離心15 min。反應(yīng)體系：標(biāo)本+49 μl PCR 擴(kuò)增液+1 μl 反應(yīng)酶；反應(yīng)條件：50℃UNG 酶反應(yīng)2 min,95℃Taq 酶活化2 min，95℃變性15 s，58℃退火延伸30 s，共45 個(gè)循環(huán)。

1.3.2 外周血淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù) 所有研究對(duì)象于清晨空腹抽取5 ml 外周靜脈血，吸取50 μl 全血，加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，并加入20 μl 熒光素標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD45/CD3/CD4/CD8 混勻，室溫避光20 min，加入450 μl 1×BD 溶血素混勻，于1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3 血清中炎癥因子和GPT、GOT 水平 所有研究對(duì)象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 ml，室溫靜止后，于4℃，轉(zhuǎn)速500 r/min，離心半徑13.5 cm 的條件下離心15 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF 表達(dá)，另采用全自動(dòng)生化儀酶學(xué)法檢測(cè)GPT、GOT 水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)數(shù)分析相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較

HBV DNA 陰性組男16 例，女13 例；年齡50～62歲，平均（56.59±2.70）歲；HBV DNA 低載量組男19 例，女9 例；年齡41～74 歲，平均（56.43±10.66）歲；HBV DNA 高載量組男22 例，女6 例；年齡43～74歲，平均（59.62±9.38）歲。三組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 三組炎癥因子水平比較

HBV DNA 低、高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF水平高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低載量組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組炎癥因子水平比較（pg/ml，）

表1 三組炎癥因子水平比較（pg/ml，）

注 與HBV DNA 陰性組比較，aP＜0.05；與HBV DNA 低載量組比較，bP＜0.05。HBV：乙型肝炎病毒；IL：白細(xì)胞介素；TNF：腫瘤壞死因子。

2.3 三組T 淋巴細(xì)胞亞群比較

HBV DNA 低、高載量組CD4+百分率、CD4+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+/CD8+低于HBV DNA 陰性組，CD8+百分率及其絕對(duì)計(jì)數(shù)高于HBV DNA 陰性組（P＜0.05）。HBV DNA 高載量組CD4+百分率、CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD8+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+/CD8+低于HBV DNA 低載量組，CD8+百分率高于HBV DNA 低載量組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組T 淋巴細(xì)胞亞群比較（）

表2 三組T 淋巴細(xì)胞亞群比較（）

注 與HBV DNA 陰性組比較，aP＜0.05；與HBV DNA 低載量組比較，bP＜0.05。HBV：乙型肝炎病毒。

2.4 三組血清肝臟酶水平比較

HBV DNA 低、高載量組的GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低載量組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組血清肝臟酶水平比較（U/L，）

表3 三組血清肝臟酶水平比較（U/L，）

注 與HBV DNA 陰性組比較，aP＜0.05；與HBV DNA 低載量組比較，bP＜0.05。HBV：乙型肝炎病毒；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；GOT：谷草轉(zhuǎn)氨酶。

2.5 慢性乙型肝炎患者血清炎癥因子和肝臟酶指標(biāo)的相關(guān)性分析

慢性乙型肝炎患者血清IL-6、IL-10、TNF 水平與GPT 水平呈正相關(guān)（r=0.63、0.45、0.61，P＜0.001），IL-8與GPT 無(wú)相關(guān)性（r=0.17，P=0.120）。IL-6、IL-10、TNF水平與GOT 水平呈正相關(guān)（r=0.48、0.40、0.49，P＜0.001），IL-8 與GOT 無(wú)相關(guān)性（r=0.08，P=0.440）。

3 討論

慢性乙型肝炎機(jī)制是指機(jī)體受到HBV 侵襲、感染不能及時(shí)有效清除HBV，使機(jī)體長(zhǎng)期陷入免疫耐受狀態(tài)，造成患者肝細(xì)胞、肝組織等的慢性破壞、損傷。研究證實(shí)，是由于機(jī)體免疫損傷造成[7-9]。慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制與患者遺傳、年齡、肝組織及細(xì)胞內(nèi)炎癥因子活化有關(guān)，而機(jī)體炎癥因子在免疫系統(tǒng)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10-12]。肝臟含豐富的肝巨噬細(xì)胞，病原體攻擊肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，促使機(jī)體釋放大量炎癥因子如IL-6、TNF 等[13-16]，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一連串的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，TNF 加劇肝星狀細(xì)胞增殖，使肝巨噬細(xì)胞釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板生長(zhǎng)因子等，同時(shí)TNF 刺激產(chǎn)生大量IL-6 促使中性粒細(xì)胞聚集、活化，誘發(fā)肝纖維化和腎小管壞死等[17-19]，釋放的IL-8 等趨化中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織，產(chǎn)生超氧陰離子，激活炎癥細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)發(fā)生，促進(jìn)肝纖維細(xì)胞增殖分化，進(jìn)一步導(dǎo)致慢性乙型肝炎發(fā)生[20-22]。

本研究結(jié)果顯示，HBV DNA 低、高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低載量組，提示機(jī)體受到HBV DNA 病毒復(fù)制增多，機(jī)體免疫炎癥因子的活化增強(qiáng)，進(jìn)一步提示肝臟器官已經(jīng)損傷。目前臨床評(píng)估肝細(xì)胞受損程度的金標(biāo)準(zhǔn)是肝臟酶GPT、GOT 等的水平，本研究結(jié)果顯示，HBV DNA 低、高載量組GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 陰性組，HBV DNA 高載量組GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低載量組。相關(guān)性結(jié)果顯示，炎癥因子IL-6、IL-10、TNF 與肝臟酶GPT、GOT 呈正相關(guān)，可能是隨著HBV DNA 不斷復(fù)制，病毒載量升高，肝細(xì)胞受損，細(xì)胞通透性增加，轉(zhuǎn)氨酶和釋放的炎癥細(xì)胞因子相互反應(yīng)促使機(jī)體出現(xiàn)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，慢性HBV 病情評(píng)估應(yīng)結(jié)合肝功能酶、炎癥因子綜合分析，獲得更為準(zhǔn)確且客觀的參考依據(jù)。

外周血T 淋巴亞群在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是慢性乙型肝炎患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。T 淋巴亞群中CD4+T 細(xì)胞促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞和體液免疫[23-25]。CD8+T 具有很強(qiáng)的殺傷能力，是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)病毒的重要免疫細(xì)胞[26]。本研究結(jié)果顯示，與HBV DNA 陰性組比較，HBV DNA 低、高載量組CD4+T 細(xì)胞百分率和絕對(duì)計(jì)數(shù)減少，CD8+T 細(xì)胞百分率和絕對(duì)計(jì)數(shù)增加，CD4+/CD8+降低，提示機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體不足，不能及時(shí)有效地清除HBV，造成HBV DNA 在機(jī)體內(nèi)不斷復(fù)制。CD4+/CD8+是監(jiān)測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能、反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，隨著復(fù)制的HBV DNA 載量升高，CD4+/CD8+失衡，提示HBV DNA 不斷復(fù)制導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重紊亂。

綜上，診治慢性乙型肝炎應(yīng)結(jié)合肝臟酶、炎癥因子和外周血T 淋巴細(xì)胞亞群等指標(biāo)分析，獲得更為準(zhǔn)確且客觀的參考依據(jù)，為患者制訂更為有效的治療方案改善預(yù)后。