李雨繁，李 雙，趙文吉，黎 劍，楊興無，賈國夫，陳宇航△

1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院（成都 610500）；2.四川省草原科學(xué)研究院青藏高原高寒草地生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心（成都 611731）；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（成都 610066）；4.四川師范大學(xué) 校醫(yī)院（成都 610066）

甘松為敗醬科植物甘松Nardostachys jatamansiDC.的干燥根或根莖，具有健脾開胃、散寒止痛功效，外用祛濕消腫，臨床常用于治療脘腹脹滿、食欲不振、嘔吐、牙痛、腳氣腫毒等[1-3]。甘松主要含揮發(fā)油、黃酮類、倍半萜類成分。前期研究[4-7]表明，甘松揮發(fā)油具有抑菌、抗炎、抗心律失常和降低血壓等藥理活性；黃酮類成分具有抗病毒、抗腫瘤等藥理作用；倍半萜類成分在促進(jìn)神經(jīng)生長、抗抑郁等方面療效明顯?！吨袊幍洹罚?020 版）[1]規(guī)定，揮發(fā)油、甘松新酮為甘松藥材質(zhì)量指標(biāo)。甘松在醫(yī)藥、食品及日用品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，市場需求量大，供需矛盾突出。目前，甘松藥材主要依靠野生資源，人為無序采挖導(dǎo)致野生資源量極度枯竭。因此，加強(qiáng)甘松野生資源保護(hù)和可持續(xù)利用研究尤顯重要[4]。本研究以四川省甘孜州和阿壩州甘松野生藥材為實驗對象，分析揮發(fā)油、總黃酮及甘松新酮含量，并評價其體外抗氧化活性，以期為甘松藥材質(zhì)量控制與資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗樣品于2020 年8—9 月采自四川省甘孜州和阿壩州，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院陳宇航副教授鑒定為甘松Nardostachys jatamansiDC.的干燥根或根莖，所有樣品經(jīng)除去雜質(zhì)后，置于通風(fēng)陰涼干燥處陰干備用，采集信息（表1）。

表1 甘松野生樣品采集信息

1.2 儀器與試劑

1）主要儀器：KH2200DB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、A590 型紫外分光光度計（上海翱藝儀器有限公司）、揮發(fā)油測定管（四川成都科隆化學(xué)品有限公司）、Agilent 1260 四元泵液相色譜儀（美國加利福尼亞州圣克拉拉市安捷倫科技有限公司）。2）主要試劑：甘松新酮（純度99.26%，批號：G-045-180427，四川成都瑞芬思生物科技有限公司）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥ 98%，上海麥克林生化科技有限公司）、ABTS標(biāo)準(zhǔn)品（上海麥克林生化科技有限公司）、抗壞血酸（天津福晨化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)油含量測定 選取甘松干燥根及根莖，粉碎后過40 目篩，精密稱取5 g粉末樣品置于500 mL容量瓶，加入40 mL超純水，加熱至沸騰，微沸狀態(tài)下回流4 h，停止加熱后，冷卻0.5 h， 讀取甘松揮發(fā)油體積，揮發(fā)油提取率計算公式如下：

提取率（%）=揮發(fā)油體積/樣品質(zhì)量×100%

1.3.2 總黃酮含量測定 參照桂利利等[8]方法測定樣品總黃酮含量。

1.3.3 甘松新酮含量測定 按照《中國藥典》（2020版）[1]高效液相色譜法測定樣品甘松新酮含量。

1.3.4 體外抗氧化活性測定 1）對自由基的清除作用。按照“1.3.1”項提取揮發(fā)油，參考景臨林等[9]和萬敏等[10]測定甘松揮發(fā)油對DPPH●清除能力；參照尹芃程等[11]測定甘松揮發(fā)油對ABTS●＋清除能力。2）還原能力測定。按照“1.3.1”項提取揮發(fā)油，參照桂利利等[8]測定甘松揮發(fā)油鐵還原能力；參照萬敏等[10]測定甘松揮發(fā)油總還原能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

利用GraphPad Prism 8 軟件作圖，IBM SPSS Statistics 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用（）描述，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD法，指標(biāo)測定結(jié)果與質(zhì)量濃度的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 甘松藥材活性成分含量測定

不同來源甘松藥材揮發(fā)油含量為1.00%～8.13%，其中，以G15揮發(fā)油含量最高，達(dá)8.13%?？傸S酮含量為8.37～20.66 mg/g，其中，G15與G16總黃酮含量明顯高于其他樣品（P<0.05）；甘松新酮含量0.17%～2.17%，其中，G15、G16和G36-1甘松新酮含量明顯高于其他樣品（P<0.05）（表2）。

表2 野生甘松揮發(fā)油、總黃酮、甘松新酮的測定結(jié)果（，n=3）

表2 野生甘松揮發(fā)油、總黃酮、甘松新酮的測定結(jié)果（，n=3）

注：表中“—”部分因樣品量較少未能提取揮發(fā)油；根據(jù)組內(nèi)均值，從大到小排列a～f，同列比較時，若無相同字母則代表該兩組或多組間的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

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2.2 甘松揮發(fā)油抗氧化活性測定結(jié)果

2.2.1 自由基清除能力測定結(jié)果 甘松揮發(fā)油具有較好的DPPH●和ABTS●＋清除能力，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（rs=1.000）。當(dāng)揮發(fā)油質(zhì)量濃度為0.160 g/L，DPPH●清除率達(dá)到48.15%，抗壞血酸清除率達(dá)到96.77%；ABTS●＋清除率達(dá)到31.66%，抗壞血酸清除率達(dá)到99.30%。進(jìn)一步分析表明，甘松揮發(fā)油對DPPH●的IC50為0.162 g/L，對ABTS●＋的IC50為0.260 g/L，而抗壞血酸對兩種自由基的IC50分別為0.006 g/L和0.021 g/L（圖1）。

圖1 甘松揮發(fā)油及抗壞血酸自由基清除能力測定結(jié)果

2.2.2 還原能力測定結(jié)果 甘松揮發(fā)油鐵還原能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（rs=1.000），揮發(fā)油質(zhì)量濃度在0.020～0.160 g/L范圍內(nèi)，吸光度值逐漸增大，為0.119～0.355 L·g－1·cm－1；抗壞血酸在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)測定吸光度值為0.267～0.855 L·g－1·cm－1。甘松揮發(fā)油總還原能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（rs=1.000），在0.020～0.160 g/L范圍內(nèi)，吸光度值為0.469～0.602 L·g－1·cm－1；抗壞血酸吸光度值為0.555～1.042 L·g－1·cm－1。甘松揮發(fā)油兩種還原能力均低于抗壞血酸（圖2）。

圖2 甘松揮發(fā)油及抗壞血酸還原能力測定結(jié)果

3 討論

3.1 甘松藥材質(zhì)量分析

本研究證實不同采集地?fù)]發(fā)油含量差異較大，其中G15 揮發(fā)油含量最高，且所有樣品均符合《中國藥典》（2020 版）標(biāo)準(zhǔn)（G37-5 除外）。同時，甘松總黃酮含量（G15、G16）明顯高于其他樣品（P<0.05），而G37-5 樣品含量最低。鑒于甘松野外生境多為海拔2 300～5 000 m高山草甸地區(qū)，其在生長過程中極易遭受強(qiáng)紫外線輻射，甘松通過積累黃酮類成分（紫外線吸收物）以抵御光氧化損傷。因此，甘松總黃酮含量差異可能與不同來源生境紫外線輻射強(qiáng)弱有關(guān)[12-13]。此外，本研究不同來源樣品的甘松新酮含量均符合《中國藥典》（2020 版）標(biāo)準(zhǔn)，且不同樣品間含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同來源野生品的揮發(fā)油、總黃酮及甘松新酮含量差異較大，可能與生長年限、具體生境及海拔高度等因素不同有關(guān)[13-14]。

3.2 甘松揮發(fā)油體外抗氧化活性分析

本研究結(jié)果表明，甘松揮發(fā)油對DPPH●和ABTS●＋均有清除作用，并具有較好的鐵離子還原能力與總還原能力，且伴隨揮發(fā)油質(zhì)量濃度升高，抗氧化活性隨之增強(qiáng)，這與盧靖等[15]研究結(jié)果相似；因此，甘松揮發(fā)油具有較好的抗氧化活性。同時，本研究發(fā)現(xiàn)甘松揮發(fā)油抗氧化能力弱于抗壞血酸，推測甘松揮發(fā)油易受外界環(huán)境（氧氣、強(qiáng)光、高溫）影響，揮發(fā)油中萜醇、萜烯及酚類等抗氧化成分容易發(fā)生雙鍵斷裂、環(huán)氧化、脫氫等反應(yīng)，導(dǎo)致活性成分含量降低[16-17]，故甘松揮發(fā)油抗氧化活性弱于抗壞血酸。

3.3 甘松資源保護(hù)與開發(fā)利用

近年來，隨著市場需求量逐年攀升，導(dǎo)致甘松被人為大肆采挖，野生種群面臨枯竭[18]。因此，應(yīng)考慮在野生甘松適應(yīng)生長區(qū)內(nèi)，積極開展仿野生生態(tài)種植，減少對野生資源依賴[19]。同時，甘松全株已廣泛用于藏醫(yī)和宗教領(lǐng)域，如甘松根治療手腳疼痛或補(bǔ)腎；其花、花莖和葉用于皮膚美容、治痘等[18]。因此，有必要開展甘松不同部位質(zhì)量評價，為其資源綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。