董文珠 李棟 趙琦 李珍 于海濤 王群英

解放軍海軍第971醫(yī)院消化科,青島 266071

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成與沉積在重癥急性胰腺炎和慢性胰腺炎中是持續(xù)性的,在輕癥急性胰腺炎中是暫時的[1-2]。急性損傷之后,一旦早期的致病因素去除,胰腺組織即可出現(xiàn)再生和修復,其過程受ECM合成與降解平衡的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是ECM合成和成纖維細胞增生的關鍵調(diào)節(jié)因子,它與降解ECM的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2在炎癥后胰腺組織修復重塑和ECM沉積中起著重要作用。TGF-β1短暫的大量表達可以防止胰腺纖維化,并有利于腺泡細胞的再生,而長時期大量表達將導致ECM過度產(chǎn)生而促進纖維化,且可上調(diào)MMP-2的表達[3-7]。Smads蛋白家族在TGF-β信號通路中起重要作用,其中Smad3是介導TGF-β信號的關鍵分子。本研究旨在觀察TGF-β1、Smad3、MMP-2和Ⅲ型膠原在急性水腫型胰腺炎(acute edematous pancreatitis,AEP)和急性壞死型胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)大鼠模型炎癥后修復階段的表達變化及TGF-β1受體拮抗劑(SB431542)對上述表達的影響,以期為抗胰腺纖維化治療提供新的思路。

材料和方法

一、實驗動物及分組

114只清潔級健康雄性SD大鼠由海軍軍醫(yī)大學動物實驗中心提供,按數(shù)字表法隨機分為正常對照組(對照組,6只)、AEP模型組(AEP組,36只)、ANP模型組(ANP組,36只)、ANP干預組(18只)、ANP對照組(18只)。

采用皮下注射雨蛙素20 μg/kg、共4次、每次間隔1 h的方法構建AEP模型,采用腹腔注射L-精氨酸(美國Sigma公司)2.5 g/kg、共2次、每次間隔1 h的方法構建ANP模型[8];以正常飲食飲水、無任何操作的大鼠作為對照組;ANP干預組于制模前30 min,制模后24、48 h分別腹腔注射TGF-β1抑制劑SB431542(溶于10% DMSO,美國TOCRIS公司)2.53 mg/kg;以ANP大鼠腹腔注射等容積DMSO作為ANP對照組。對照組、AEP組和ANP組分別在制模后1、2、2.5、3、5、7 d處死大鼠[10];ANP對照組、ANP干預組分別在制模后3、5、7 d處死大鼠,取胰腺組織,部分置液氮保存,部分置于10%甲醛溶液固定。

二、胰腺組織羥脯氨酸含量測定

取液氮保存的胰腺組織,解凍后制備成勻漿,運用羥脯胺酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測羥脯氨酸含量,按試劑盒說明書操作。羥脯氨酸量(μg/mg蛋白)=(測定管吸光值-空白管吸光值)/(標準管吸光值-空白管吸光值)×標準管羥脯氨酸量(2 μg/mg蛋白)。羥脯胺酸是膠原蛋白中特有的氨基酸,其含量反映胰腺纖維化的程度。

三、胰腺組織TGF-β1、磷酸化Smad3(p-Smad3)、Ⅲ型膠原、MMP-2檢測

取甲醛固定的胰腺組織,常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片。采用Envision法檢測胰腺組織TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型膠原、MMP-2表達。室溫下用1% H2O220 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶,分別滴加美國Santa Cruz公司的抗MMP-2抗體(1∶100)、抗MMP-9抗體(1∶80)、抗TGF-β1抗體(1∶50)、抗Ⅲ型膠原抗體(1∶40),以及丹麥DAKO公司的抗p-Smad3抗體(1∶60),置37℃孵育2 h,再滴加Envision試劑(丹麥DAKO公司)室溫孵育30 min,用新鮮配制的0.05% DAB和0.01% H2O2顯色8 min。胰腺細胞胞質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性。評分標準:無著色或辨認不清為0分,淡棕黃色為1分,棕黃色為2分,深棕黃色為3分。每張胰腺切片隨機選擇5個高倍視野,取均值。

四、胰腺組織MMP-2活性測定

取胰腺組織勻漿,采用BCA定量試劑盒(美國Pierce公司)測定勻漿的蛋白濃度。因MMP-9和MMP-2的實際分子量相符,故先采用乙二胺四乙酸抑制試驗抑制MMP-9活性,再應用明膠聚丙酰胺電泳法測定勻漿的MMP-2活性[11]。電泳后的凝膠經(jīng)Flours Mutimager圖像分析儀Quantity One 4.6.2版圖像分析軟件成像,并以反轉(zhuǎn)模式打印。酶活性表現(xiàn)為白色背景上的黑色條帶,經(jīng)圖像分析系統(tǒng)讀取相對定量值,即酶活性。酶活性=條帶面積×(條帶灰度-背景灰度)。圖像掃描條帶3次,取均值。

五、胰腺組織MMP-2和p-Smad3蛋白含量測定

取胰腺組織勻漿,采用BCA定量試劑盒(美國Pierce公司)測定蛋白濃度,常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測胰腺組織MMP-2和p-Smad3蛋白表達量,以β-action作為內(nèi)參。抗MMP-2抗體、抗β-action抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;抗p-Smad3抗體購自美國Abcam公司;HRP標記羊抗小鼠IgG抗體、HRP標記羊抗兔IgG抗體購自美國Pierce公司。最后ECL發(fā)光,X片曝光、顯影、定影,置Fluors Mutilmager圖像分析儀,用Quantity One 4.6.2版圖像分析軟件進行分折,記錄相應蛋白條帶的平均吸光值(mean value intensity,MVI)表示MMP-2和p-Smad3的蛋白表達量。

六、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、各組胰腺組織羥脯氨酸含量比較

對照組胰腺組織羥脯氨酸含量為(61.71±8.56)μg/mg蛋白。AEP組制模后3 d胰腺組織羥脯氨酸含量達到峰值,為(116.72±8.53)μg/mg蛋白,以后逐漸下降;ANP組制模后5 d時達到峰值,為(174.93±11.75)μg/mg蛋白,以后逐漸下降。制模后3、5、7 d ANP組羥脯氨酸含量均顯著高于AEP組(圖1A),AEP組又顯著高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01),提示ANP組ECM沉積明顯。制模后3、5、7 d,ANP干預組羥脯氨酸含量分別為(108.07±10.48)、(137.14±8.66)、(112.35±13.16)μg/mg蛋白,顯著低于ANP對照組3、5、7 d羥脯氨酸含量的(132.35±14.2)、(175.43±13.75)、(137.92±12.65)μg/mg蛋白,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01),提示ANP干預后胰腺組織的ECM沉積明顯下降。

圖1 AEP組和ANP組胰腺組織羥脯氨酸含量(1A)和TGF-β1(1B)、p-Smad3(1C)、Ⅲ型膠原(1D)、MMP-2(1E)的蛋白表達及MMP-2活性(1F)

二、各組胰腺組織TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型膠原、MMP-2表達水平比較

AEP組、ANP組胰腺組織TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型膠原、MMP-2均主要分布于損傷的腺泡細胞和間質(zhì)的纖維組織(圖2)。AEP組TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型膠原、MMP-2表達在制模后1 d開始明顯升高,于2.5 d達到高峰,后逐漸降低。ANP組TGF-β1、p-Smad3表達在制模后2 d開始明顯升高,3 d達到高峰,后逐漸降低;Ⅲ型膠原表達于制模后3 d明顯增強,5 d達到高峰,7 d明顯下降;MMP-2表達于制模后3 d明顯增強,7 d達到高峰(圖1B～1E)。對照組、AEP組、ANP組TGF-β1免疫組織化學峰值評分分別為(0.12±0.03)、(1.96±0.21)、(3.00±0.28)分,p-Smad3分別為(0.15±0.05)、(2.05±0.20)、(3.05±0.24)分,Ⅲ型膠原分別為(0.11±0.04)、(1.56±0.15)、(3.10±0.17)分,MMP-2分別為(0.05±0.03)、(1.45±0.20)、(2.45±0.15)分,ANP組顯著高于AEP組,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。ANP干預組和ANP對照組胰腺組織TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型膠原、MMP-2免疫組織化學峰值評分分別為(2.36±0.21)、(2.25±0.22)、(2.47±0.19)、(2.00±0.10)分和(3.02±0.21)、(3.01±0.19)、(3.05±0.24)、(2.43±0.11)分,ANP干預組顯著低于ANP對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。

圖2 ANP組胰腺組織TGF-β1(2A) 、p-Smad3(2B)、Ⅲ型膠原(2C)、MMP-2(2D)蛋白的表達(免疫組織化學染色 2A、2B×400;2C、2D ×200)

三、各組胰腺組織MMP-2 活性比較

對照組胰腺組織MMP-2活性低;AEP組造模后1 d MMP-2活性增強,2.5 d達到高峰,7 d逐漸恢復正常;ANP組造模后2 d MMP-2活性開始增強,7 d達到高峰(圖1F)。對照組、AEP組、ANP組、ANP干預組、ANP對照組胰腺組織MMP-2活性峰值分別為10.85±1.73、90.01±8.92、117.82±9.52、85.78±7.16、115.43±8.7,ANP組顯著高于AEP組,AEP組又顯著高于對照組,ANP干預組顯著低于ANP對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。

四、各組胰腺組織MMP-2、p-Smad3蛋白表達比較

ANP干預組制模后3、5 d胰腺組織MMP-2蛋白表達量分別為0.20±0.01、1.19±0.02,ANP對照組分別為0.52±0.01、1.54±0.05;ANP干預組制模后3、5 d胰腺組織p-Smad3蛋白表達量分別為0.30±0.04、0.66±0.11,ANP對照組分別為1.95±0.05、1.30±0.01。ANP干預組MMP-2及p-Smad3表達水平均顯著低于ANP對照組;制模后5 d ANP干預組MMP-2、p-Smad3水平顯著高于3 d,差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05,圖3)。

圖3 ANP 干預組3 d(1)、ANP對照組3 d(2)、ANP干預組5 d(3)、ANP對照組5 d(4)胰腺組織MMP-2(3A)、p-Smad3(3B)蛋白表達(免疫印跡法)

討 論

1992年Kloppel與Maillet[1]提出慢性胰腺炎的壞死-纖維化序列理論,急性胰腺炎炎癥發(fā)生后啟動器官的修復、再生機制。輕癥急性胰腺炎在結(jié)構和功能方面可以完全恢復;重癥急性胰腺常表現(xiàn)為實質(zhì)細胞再生少而間質(zhì)細胞過度增生,ECM大量沉積,最后可能演化為腺泡萎縮和間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果證實了這一改變。

TGF-β是一類多功能的細胞因子,其釋放和活化可調(diào)節(jié)多種ECM降解酶及其抑制因子的產(chǎn)生,有助于組織修復,但在慢性胰腺炎時,高表達的TGF-β可使組織纖維化,致使器官功能降低或喪失。Smads家族蛋白是TGF-β信號通路的關鍵傳導分子,它們可以將TGF-β信號直接由細胞膜受體轉(zhuǎn)導入細胞核內(nèi),為細胞信號跨膜后與核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄之間開通了一條簡便途徑。國外相關研究表明[12-19],在雨蛙素誘導的胰腺炎修復階段,TGF-β1在大鼠胰腺腺泡細胞和星狀細胞表達增強,24～48 h后TGF-β1蛋白2倍增高,7 d后逐漸恢復正常,TGF-β1mRNA表達量在制模后2 d達到高峰(3倍于正常值);在L-精氨酸誘導的ANP修復階段,TGF-β1mRNA和前膠原Ⅲ型及Ⅳ型mRNA在制模后2.5 d表達達到高峰,前膠原Ⅰ型mRNA在3 d達到高峰,7 d全部恢復正常。本研究結(jié)果顯示,AEP組大鼠胰腺組織TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型膠原在炎癥誘導后1 d開始升高,2.5～3 d達到高峰,以后逐漸恢復正常;ANP組大鼠胰腺組織TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型膠原在炎癥誘導后2～3 d開始升高,3～5 d達到高峰。誘發(fā)AEP后,TGF-β1呈一過性高表達,可促進胰腺組織炎癥后的組織修復再生;而誘發(fā)ANP后,TGF-β1呈持續(xù)高表達,則造成ECM大量沉積、實質(zhì)細胞再生減少,導致組織修復遲緩和障礙。這些結(jié)果提示TGF-β1可能是ECM合成和成纖維細胞增生的關鍵調(diào)節(jié)因子,在胰腺炎壞死后再生過程中起重要作用。本研究結(jié)果還顯示,p-Smad3的變化與TGF-β1的變化幾乎同步,證實了Smads家族蛋白是TGF-β信號通路的關鍵傳導分子[15-16]。

MMP是降解ECM的主要因子,被認為是組織損傷后重建的主要酶系,在再生過程中被表達和激活[20]。在雨蛙素誘導的胰腺炎大鼠模型[21]中,MMP-2 mRNA表達水平隨著ECM和TGF-β1mRNA表達水平的增加而增加,并具有關聯(lián)性;在L-精氨酸誘導的胰腺炎模型中,MMP-2 mRNA表達水平遲于雨蛙素誘導的胰腺炎模型。也有研究表明[22-23],TGF-β1下調(diào)MMP-2 mRNA表達,并降低MMP-2活性,使膠原的合成大于降解,導致膠原纖維的過度沉積,促進細胞的轉(zhuǎn)化;TGF-β1 mRNA表達高峰早于ECM mRNA表達,而且增加的MMP-2 mRNA表達伴隨于纖維連接蛋白消失。本研究結(jié)果顯示,AEP組MMP-2在制模后1 d明顯升高,2.5 d達到高峰,7 d接近對照組表達水平;ANP組MMP-2在2 d開始升高,7 d達到高峰;給予TGF-β1抑制劑干預后,MMP-2和p-Smad3的表達均下降。在精氨酸誘導的胰腺炎中,TGF-β1短暫的大量表達可能防止纖維化,并有利于腺泡細胞的再生,而長時期大量表達將導致ECM過度產(chǎn)生而促進纖維化。TGF-β1參與愈合過程,引導單核細胞和成纖維細胞的遷移,增加ECM的合成和分泌,抑制ECM的降解,它對損害組織的修復是通過對ECM的作用介導的,而ECM的適度合成有利于胰腺再生。MMP-2參與隨后的愈合過程,可能在胰腺組織再生和防止大量ECM沉積中扮演重要角色。至于TGF-β1-Smad信號轉(zhuǎn)導通路在胰腺急性炎癥后組織修復重建中的作用及具體機制,還需進一步深入研究。

綜上所述,TGF-β1可能是胰腺ECM重塑和胰腺纖維化的重要調(diào)節(jié)因子之一,如何對TGF-β1及MMP的表達進行干預調(diào)節(jié),減少ECM過度持續(xù)沉積,改善胰腺組織的修復重建,隨著TGF-β1及其抑制劑的深入研究,將可能成為阻止急性胰腺炎慢性纖維化的新途徑

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明董文珠:研究操作、論文撰寫;李棟、趙琦:數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學分析;李珍、于海濤、王群英、趙琦:研究醞釀、研究指導、工作支持;董文珠、李棟:研究設計、研究指導、論文修改、經(jīng)費支持