陳 臣 胡 燕 劉 濤 胡曉靈
1.新疆醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)學院,新疆烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,新疆烏魯木齊 830000
糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常見、最復雜的并發(fā)癥之一,發(fā)病率達50%[1]。臨床上DPN 常累及患者的感覺和運動神經(jīng),產(chǎn)生肢體麻木、疼痛等感覺障礙,甚至導致肌肉無力及萎縮,嚴重影響患者的生存質量[2-3],威脅患者的生命安全[4-5]。在治療方面,由于病因不明,目前西藥僅對癥治療且只有短期效果[6-7],與中醫(yī)藥效果比較仍顯不足[8]。復方芪鷹顆粒是全國名中醫(yī)胡曉靈的經(jīng)驗方,亦為新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內制劑,前期臨床研究發(fā)現(xiàn),該方能有效改善運動正中神經(jīng)、感覺正中神經(jīng)、感覺腓總神經(jīng)傳導速度,還具有升高血管內皮生長因子及胰島素樣生長因子-1 的作用,臨床有效率達87.9%[9-10]。蛋白激酶RNA 樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)介導的C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)途徑是內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)誘導細胞凋亡主要途徑之一,抑制PERK 介導的核轉錄因子紅系2 相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)核轉位/轉錄激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)/CHOP途徑能夠減輕細胞凋亡[11]。目前研究發(fā)現(xiàn),PERK/Nrf2通路在DPN 中發(fā)揮重要作用[12]。因此,本研究擬從PERK/Nrf2 通路為切入點,探討復方芪鷹顆粒治療DPN 的分子機制。
72 只雄性8 周齡SPF 級Wistar 大鼠,體重180~220 g,購于新疆醫(yī)科大學動物中心[動物許可證號:SCXK(新)2018-0002]。復方芪鷹顆粒購于新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(ZJ2012006),7.5 g/袋;三甲胺N-氧化物,購于Sigma,貨號為317594-1G。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批(IACUC20200930-9)。
鏈脲菌素(Streptozotocin,STZ)(美國Sigma,S0130-1G)、蘇木精染液(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司,CTS-1097)、伊紅染液(北京中杉金橋生物技術有限公司,ZLI-9613)、GRP78(美國CST,3183S)、p-PERK(美國CST,3179S)、PERK(CST,3192S)、Nrf2(美國abcam,Ab89443)、ATF4(美國CST,11815S)、胱天蛋白酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3,caspase-3)(美國abcam,Ab184787)、CHOP(美國CST,2895S)、二抗山羊抗兔IgG H&L(美國abcam,Ab205718)、二抗山羊抗小鼠IgG H&L(美國abcam,Ab205719)、流式細胞儀(美國BD,LSRFortessa)、蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad,Mini-PROTEAN Tetra system)、血糖儀(瑞士羅氏Accu-Chek,卓越型)。
造模參照課題組前期研究[13-14],造模大鼠持續(xù)喂45%高脂飼料(江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司,XTHF45-1)8 周后,注射小劑量鏈脲佐菌素30 mg/kg造糖尿病模型。選取空腹血糖>11.1 mol/L 的大鼠作為糖尿病模型大鼠繼續(xù)高脂飲食4 周后,用Meditronic keypoint-4 workstation 肌電圖儀評估DPN 造模情況,以下肢坐骨神經(jīng)感覺或運動傳導速度減慢≥11%為造模成功。
將實驗動物采用計算機隨機數(shù)字法分為正常對照組、模型組、陽性藥組及復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組,每組12 只。模型組、陽性藥組及復方芪鷹顆粒低、中、高組構建DPN 大鼠模型,造模成功后復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組分別予以復方芪鷹顆粒1.17、2.34、4.68 g/kg[14],陽性藥組予以氧化三甲胺110 mg/kg,2 ml/次,灌胃1 次/d,模型組及正常對照組給予等量的雙蒸水。干預時間為4 周,期間各組自由進食和水。
在DPN 造模成功后及藥物干預4 周后,取大鼠尾部血,用Accu-Chek 血糖儀測血糖。在末次給藥后,所有大鼠禁食12 h,用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)充分麻醉,俯臥位固定于手術臺上,手術留取坐骨神經(jīng)標本[15],并將組織一部分置于10%福爾馬林溶液,一部分置于凍存管內,液氮速凍后于-80℃凍存?zhèn)溆?。?0%福爾馬林溶液中坐骨神經(jīng)標本固定1 周后,進行石蠟包埋,最后切制成約5 μm 切片。按照蘇木精-伊紅染色試劑盒上說明進行操作,分別在40、100、200及400 倍顯微鏡下觀察大鼠坐骨神經(jīng)病理學改變。
根據(jù)課題組前期實驗方法[15]對各組坐骨神經(jīng)組織進行蛋白質印跡法檢測。一抗孵育:GRP78(1∶1 000稀釋)、PERK(1∶800 稀釋)、p-PERK(1∶600 稀釋)、ATF4(1∶800 稀釋)、Nrf2(1∶800 稀釋)、CHOP(1∶800稀釋)、caspase-3(1∶1 000 稀釋)、β-actin(1∶1 000稀釋)。二抗兔抗(R)1∶5 000 稀釋,鼠抗(M)1∶15 000稀釋。采用ChemiScope mini 化學發(fā)光儀檢測、拍照,用Image Lab 圖像分析。
采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差()表示,兩組比較采用t 檢驗。多組計量資料比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
整個實驗過程中,最終完成實驗動物為46 只,其中正常對照組12 只、模型組6 只、復方芪鷹顆粒低劑量組6 只、復方芪鷹顆粒中劑量組6 只、復方芪鷹顆粒高劑量組8 只、陽性對照組8 只。
鏡下觀察可見,正常對照組有髓神經(jīng)纖維結構完整、分布均勻、排列規(guī)則,軸索、髓鞘及神經(jīng)膜形態(tài)結構良好、完整,神經(jīng)內膜形態(tài)結構正常;模型組有髓神經(jīng)纖維脫失、減少,部分排列紊亂,部分軸索變性,節(jié)段性脫髓鞘,神經(jīng)膜增厚,神經(jīng)內膜膠原纖維增生;與模型組比較,復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組髓神經(jīng)纖維軸索變性、脫髓鞘、神經(jīng)膜增厚及神經(jīng)內膜增生程度均減輕。見圖1。
圖1 六組坐骨神經(jīng)蘇木精-伊紅染色
DPN 造模成功后,模型組血糖高于正常對照組(P<0.05),復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組血糖與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。藥物干預4周后,模型組血糖高于正常對照組,復方芪鷹顆粒低、中、高劑量組血糖低于模型組,復方芪鷹顆粒中、高劑量組血糖低于復方芪鷹顆粒低劑量組(P<0.05)。見表1。
表1 六組DPN 造模成功后及藥物干預4 周后血糖水平比較(mmol/L,)
表1 六組DPN 造模成功后及藥物干預4 周后血糖水平比較(mmol/L,)
注 與正常對照組同期比較,aP<0.05;與模型組同期比較,bP<0.05;與復方芪鷹顆粒低劑量組同期比較,cP<0.05。DPN:糖尿病周圍神經(jīng)病變。
模型組坐骨神經(jīng)組織GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、caspase-3 高于正常對照組,Nrf2 低于正常對照組(P<0.05)。復方芪鷹顆粒中、高劑量組GRP78、ATF4、CHOP 低于模型組,Nrf2 高于模型組;復方芪鷹顆粒高劑量組p-PERK、caspase-3 低于模型組(P<0.05)。復方芪鷹顆粒高劑量組ATF4、CHOP 低于復方芪鷹顆粒低劑量組,復方芪鷹顆粒中劑量組CHOP 低于復方芪鷹顆粒低劑量組(P<0.05)。見圖2、表2。
圖2 六組坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表達條帶圖
表2 六組坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表達比較(mmol/L,)
表2 六組坐骨神經(jīng)GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表達比較(mmol/L,)
注 與正常對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與復方芪鷹顆粒低劑量組比較,cP<0.05。GRP78:葡萄糖調節(jié)蛋白78;PERK:蛋白激酶RNA 樣內質網(wǎng)激酶;p:磷酸化;ATF4:轉錄激活因子4;Nrf2:核轉錄因子紅系2 相關因子2;CHOP:C/EBP 同源蛋白;caspase-3:胱天蛋白酶-3。
中醫(yī)藥在改善DPN 患者的血糖、臨床癥狀及生活質量方面有著重要的作用[16-23],復方芪鷹顆粒是胡曉靈主任醫(yī)師經(jīng)驗方,應用于糖尿病周圍神經(jīng)病變治療效果顯著[14,24]。DPN 既有消渴,又有痿痹,以氣陰虧虛為主證,兼以痰瘀阻滯、風伏絡瘀。本方取黃芪為君藥,而臣以黃精、鷹嘴豆,佐以丹參、蟬蛻,共成益氣養(yǎng)陰、祛瘀化痰、疏風通絡之制,實為治療消渴痿痹之良劑。同時,消渴痿痹病機特點為氣陰兩虛,痰濁瘀血阻滯,風伏絡脈,本方氣、血、風藥俱備,尤側重于治氣,獨無祛痰藥,但補氣即可以祛痰,而祛瘀、活血、疏風,又使痰濁失卻合邪之停留,自能令痰濁消除,這正是本方配伍精當簡約之處。
目前研究發(fā)現(xiàn),ERS 是DPN 發(fā)病的重要病理機制,亦是治療該病的全新藥物靶點[25-27]。以此為線索,前期本課題組進行了初步動物實驗探索發(fā)現(xiàn),復方芪鷹顆粒能夠提高外周神經(jīng)中內質網(wǎng)分子伴侶免疫球蛋白重鏈結合蛋白質同源的Hsp70 表達水平,減少神經(jīng)受損程度[14]。該藥可能提高了分子伴侶蛋白的表達,減少未折疊蛋白數(shù)量,參與了內質網(wǎng)應激過程。據(jù)此,本研究以ERS 相關的PERK/Nrf2 通路為切入點,探討復方芪鷹顆粒治療DPN 的分子機制。在PERK/CHOP 通路介導的DPN 凋亡研究中,ERS 參與DPN過程并誘導了外周神經(jīng)的凋亡[28]。在DPN 的體內外ERS 實驗研究中,促凋亡蛋白CHOP 和抑制凋亡蛋白ORP150 存在密切聯(lián)系,且CHOP/ORP150 比值在DNP 病情的不同階段起著不同的作用[27]。在基于ERS 的中藥復方治療DPN 的研究中,糖絡寧湯劑治療效果明顯優(yōu)于對照組,其作用機制是該方介導了ERS 中PERK/Nrf2 及PERK/CHOP/caspase-12 通路發(fā)揮抗凋亡的作用[12,29]。PERK/Nrf2 通路是ERS 的主要通路,且在防止施萬細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[30]。本研究結果顯示,復方芪鷹顆粒干預后大鼠坐骨神經(jīng)觀察到髓神經(jīng)纖維軸索變性、脫髓鞘、神經(jīng)膜增厚及神經(jīng)內膜增生程度均減輕,血糖降低,坐骨神經(jīng)中GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、caspase-3 表達水平有顯著下調,Nrf2 表達水平上調。
綜上所述,復方芪鷹顆粒對DPN 大鼠的神經(jīng)保護及降糖作用機制可能是該藥抑制了PERK/Nrf2 通路,減輕了ERS,防止了大鼠坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維軸索變性、脫髓鞘、神經(jīng)膜增厚及神經(jīng)內膜增生程度。該研究豐富了復方芪鷹顆粒藥效學內容,為今后研究DNP 的防治奠定一定的理論基礎,也為DPN 治療提供一種可選藥物。