梁舒，崔玉榮，吳潔，張超，郭占非，高曉，許振丹，范文強

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院&新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院風(fēng)濕免疫科，河南 新鄉(xiāng) 453000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病[1]。RA的誘導(dǎo)因子有病毒感染、激素失調(diào)以及基因表達失調(diào)[2]。RA 患者會出現(xiàn)增生性的滑膜襯里組織，能夠?qū)е禄颊咧職堃约八劳雎试黾?，滑膜襯里組織包含大量成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)。FLSs 能夠產(chǎn)生炎癥細胞因子和分解代謝酶，主要通過和其他免疫相關(guān)因子作用促進關(guān)節(jié)炎癥[2-3]。當FLSs激活后，其遷移和入侵能力會增加，這種特性有助于RA發(fā)展[4]。因此探究RA 中FLSs 表型的改變有助于發(fā)展RA 治療方案。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類不具有蛋白編碼能力的小RNAs，目前已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究的一個重要領(lǐng)域[5]。此類小RNAs除了能夠和長非編碼RNAs 以及miRNAs 作用，也能夠結(jié)合并破壞mRNAs轉(zhuǎn)錄[6]。研究指出一些miRNAs失調(diào)可能使個體易患RA，這些miRNAs 包括miR-126-3p、miR-339-5p 和let-7i-5p 等[7]，另外有證據(jù)表明血清miRNA 水平可以預(yù)測RA 治療的反應(yīng)[6]，表明miRNAs 具有治療RA 的潛力。有文獻已報道m(xù)iR-132-3p 參與調(diào)控顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病[8]，并且具有預(yù)測甲氨蝶呤治療RA反應(yīng)的能力[9]。Tseng等[10]的預(yù)測也表明miR-132-3p在RA患者滑膜組織中的表達是失調(diào)的，但目前miR-132-3p調(diào)控RA 的機制尚不明確。 因此本研究圍繞miR-132-3p 對RA-FLSs 表型影響以及相關(guān)機制展開研究，報道如下：

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 miRNA 提取試劑盒、無核酸酶超純水、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑、cDNA 第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高特異性染料法qPCR 預(yù)混液、TsingZol 總RNA 提取試劑、高純度低電滲瓊脂糖、聚丙烯酰胺電泳預(yù)制凝膠和蛋白Marker 購自北京擎科生物；蛋白電泳儀購自美國Invitrogen 公司；增強型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、脫脂奶粉、磷酸緩沖液、RIPA 裂解液、Βradford 蛋白定量試劑、pcDNA3.1 (+)載體和FZD4 過表達載體購自南京諾唯贊生物；蛋白成像系統(tǒng)購自美國UVP 公司；MTT 實驗試劑購自廣州賽云生物；酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司；EdU 增值試劑盒、miR-132-3p 模擬物、基因定量分析所用引物、riboFECT?mRNA 轉(zhuǎn)染試劑和miRNA 陰性對照(miR-NC)均由廣州銳博生物提供；結(jié)晶紫、細胞凋亡檢測試劑、FZD4、β-catenin、和c-Myc 抗體、減血清培養(yǎng)基、聚偏氟乙烯膜、二抗抗體和雙熒光素酶檢測試劑購自北京索萊寶生物；基底膜基質(zhì)購自美國Corning公司；CyclinD1抗體購自武漢三鷹生物。

1.2 實驗方法

1.2.1 滑膜組織收集 于2022年3月至2022年6月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院或新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院接受治療的32 例RA患者和27例非RA患者分別提供了32份膜組織和27份正?；そM織(每例患者一份)。每例患者在手術(shù)前簽了知情同意書。收集的滑膜組織儲存在-80℃環(huán)境中，樣品收集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2.2 RA-FLSs 分離與培養(yǎng) 依據(jù)已出版的細胞分離步驟[11]從收集的RA 滑膜組織和非RA 滑膜組織中分離RA-FLSs。首先去除滑膜組織中的脂肪和血管等組織，清洗后，將組織切為1 mm3左右放到裝有適量DMEM完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放到含有5%二氧化碳的溫度為37℃的培養(yǎng)箱，在培養(yǎng)期間細胞需每隔3 d 傳代一次；大概14 d 左右，RA-FLSs會從培養(yǎng)的組織中遷移出來并生長成細胞單層，此后培養(yǎng)單層的RA-FLSs，傳代3～5 次的RA-FLSs 凍存在液氮中已備后續(xù)實驗所用。

1.2.3 細胞處理與分組 分離的RA-FLSs 匯合度在90%左右時，用磷酸緩沖液清洗兩次，進行傳代培養(yǎng)，根據(jù)每個實驗所需培養(yǎng)孔計算所需細胞量，待細胞匯合度達到30%～50%時進行細胞轉(zhuǎn)染。用減血清培養(yǎng)基稀釋riboFECTTMmRNA 轉(zhuǎn)染試劑，將此混合液分別和miR-132-3p 模擬物、模擬物陰性對照、pcDNA3.1(+)載體以及FZD4 過表達載體在室溫下孵育5 min 后并根據(jù)各個實驗?zāi)康膶⑦@些寡聚核苷酸和載體單獨或者一起加到培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細胞后進行功能實驗。單獨轉(zhuǎn)染miR-132-3p 模擬物以及模擬物陰性對照的培養(yǎng)板記為miR-132-3p組和miR-NC組；聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-132-3p和pcDNA或者FZD4的記為miR-132-3p+pcDNA組以及miR-132-3p+FZD4組。

1.2.4 基因定量分析 RNA 提取操作嚴格按照miRNA提取試劑盒和TsingZol 總RNA 提取試劑說明書步驟。RNA 濃度和質(zhì)量在微量核酸蛋白分析儀上檢測，隨后計算cDNA 反轉(zhuǎn)錄所需RNA 的體積，將相應(yīng)體積的RNA和引物(表1)、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑以及cDNA 合成試劑混合合成cDNA。高特異性染料法qPCR預(yù)混液用于基因定量分析。利用2-ΔΔCt法分析定量數(shù)據(jù)。

表1 定量分析所用引物Table 1 Primer sequences used in qPCR

1.2.5 細胞活力分析 接種在96孔板的RA-FLSs培養(yǎng)在正常條件下，待細胞密度達到30%～50%時按照以上方法進行細胞轉(zhuǎn)染，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔中加入MTT 試劑并孵育4 h，形成的甲攢結(jié)晶用二甲基亞砜溶解，最終用酶標儀分析樣品。

1.2.6 細胞增殖實驗 接種在6孔板的RA-FLSs在正常條件下培養(yǎng)，細胞融合度30%～50%時按照以上方法進行細胞轉(zhuǎn)染，48 h后將細胞傳代至96孔板(已加有標準濃度EdU 試劑)。細胞和EdU 試劑共孵育2 h后，在RA-FLSs 和Triton X-100、多聚甲醛以及DAPI共培養(yǎng)后，根據(jù)熒光顯微鏡下EdU陽性的細胞來確定細胞增殖情況。

1.2.7 細胞侵襲分析 用帶有8 μm 孔室的12 孔板分析細胞侵襲，該12孔板的上室底部涂有基質(zhì)。將RA-FLSs 接種到上室，并培養(yǎng)在無血清的DMEM 中，同時在培養(yǎng)板的下室添加含有15%胎牛血清的DMEM。24 h后用顯微鏡觀察下室細胞數(shù)量。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗 利用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-132-3p 和FZD4 互補序列，F(xiàn)ZD4 野生型質(zhì)粒和突變載體(WT-FZD4 3'UTR和MUT-FZD4 3'UTR)依據(jù)是否將FZD4 3'UTR 和miR-132-3p 互補序列突變而構(gòu)建。點直接突變試劑盒用于FZD4 3'UTR 和miR-132-3p 互補序列的突變。利用PCR 技術(shù)擴增包含所預(yù)測結(jié)合位點的FZD4 3'UTR 序列，將點突變后的FZD4 3'UTR 序列送生物公司合成，最終將PCR 擴增的序列和合成的序列引入pmirGLO 載體構(gòu)建上述報告載體。細胞轉(zhuǎn)染48 h后檢測雙熒光素酶活性。

1.2.9 蛋白表達分析 RIPA 裂解液制備蛋白樣品，蛋白的濃度利用Βradford 蛋白定量試劑分析。將20 μg蛋白和蛋白Marker加入到聚丙烯酰胺電泳預(yù)制凝膠中，用蛋白電泳儀將不同分子量的蛋白分離開，隨后蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上，用脫脂奶粉封閉后，將膜和FZD4、β-catenin、c-Myc 和CyclinD1抗體孵育，隨后與二抗抗體孵育。最終用增強型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和蛋白成像系統(tǒng)顯現(xiàn)蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-132-3p 在RA 患者和RA-FLSs 中的表達 如圖1A 所示，與對照組滑膜組織比較，miR-132-3p 在RA 患者滑膜組織中低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而且結(jié)果展示miR-132-3p 在RA-FLSs 中的表達低于正常纖維樣滑膜細胞中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1Β。

圖1 miR-132-3p在滑膜組織和成纖維樣滑膜細胞中的表達Figure 1 Expression analysis of miR-132-3p in synovial tissue and fibroblasts synovial cells

2.2 MiR-132-3p 抑制RA-FLSs 增殖和侵襲 本研究數(shù)據(jù)顯示miR-132-3p在miR-132-3p模擬物轉(zhuǎn)染的RA-FLSs中的表達比在miR-NC轉(zhuǎn)染的RA-FLSs中高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2A，說明miR-132-3p模擬物能促進miR-132-3p的表達。隨后發(fā)現(xiàn)miR-132-3p 模擬物轉(zhuǎn)染后RA-FLSs 活力、EdU陽性細胞數(shù)以及侵襲細胞數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2Β～2D。

圖2 MiR-132-3p抑制RA-FLSs增殖和侵襲Figure 2 MiR-132-3p inhibits the proliferation and invasion of RA-FLSs

2.3 MiR-132-3p 靶向結(jié)合FZD4 如圖3A 所示，F(xiàn)ZD4 3’UTR 含有miR-132-3p 結(jié)合位點(5'-ACUGUUU-3’)。根據(jù)此結(jié)合序列，本研究構(gòu)建了FZD4 3’UTR 野生型和突變型報告質(zhì)粒以鑒定miR-132-3p 和FZD4 的關(guān)系。 如圖3Β 所示，WT-FZD4 3’UTR 組的熒光素酶活性在miR-132-3p轉(zhuǎn)染后降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但是WT-FZD4 3’UTR 組的熒光素酶活性在miR-132-3p過表達后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。隨后的結(jié)果揭示FZD4 在RA 患者滑膜組織中的mRNA 表達量要高于正常纖維樣滑膜細胞中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3C，并且FZD4 在RA 患者滑膜組織的表達和miR-132-3p 的表達是負相關(guān)的，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3D。FZD4 在RA患者滑膜組織和RA-FLSs中的蛋白表達也高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3E和圖3F。

圖3 MiR-132-3p 靶向結(jié)合FZD4Figure 3 Combination of miR-132-3p and FZD4

2.4 FZD4 挽救miR-132-3p 在RA-FLSs 中介導(dǎo)的影響 本研究發(fā)現(xiàn)FZD4的蛋白表達在miR-132-3p轉(zhuǎn)染組低于miR-NC 轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但是它在miR-132-3p和FZD4 共轉(zhuǎn)染組的表達又高于miR-132-3p 和pcDNA 共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4A。此外，數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染miR-132-3p的RA-FLSs活力、EdU陽性細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)低于miR-NC轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但是這些指標在miR-132-3p和FZD4共轉(zhuǎn)染組又高于miR-132-3p 和pcDNA 共轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4Β～4D。

圖4 FZD4挽救miR-132-3p在RA-FLSs中介導(dǎo)的影響Figure 4 FZD4 rescue the effect miR-132-3p in RA-FLSs

2.5 MiR-132-3p 通過調(diào)控FZD4 表達抑制Wnt/β-catenin通路激活 轉(zhuǎn)染miR-132-3p組的β-catenin、c-Myc 和CyclinD1 蛋白表達低于miR-NC 轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但是這些蛋白的表達在miR-132-3p 和FZD4 共轉(zhuǎn)染組又高于miR-132-3p 和pcDNA 共轉(zhuǎn)染組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖5 MiR-132-3p和FZD4過表達在RA-FLSs中對β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表達的影響Figure 5 Effects of overexpression of miR-132-3p and FZD4 on β-catenin,c-Myc,and CyclinD1 protein expression in RA-FLSs

3 討論

RA 患者FLSs 的過度生長是關(guān)節(jié)損傷的原因之一，F(xiàn)LSs 能夠促進炎性因子和趨化因子產(chǎn)生，這種特性使得骨和軟骨侵蝕加重，并能加重RA 疾病程度[12]。最近的研究指出一些miRNAs 在RA 患者中是異常表達的，并且有助于RA 發(fā)展[13-14]。Cheng 等[15]運用基因表達綜合數(shù)據(jù)庫說明了miR-132-3p 可能通過結(jié)合核富含豐富的轉(zhuǎn)本1 參與RA 疾病進程；Zhang 等[16]研究數(shù)據(jù)顯示miR-132-3p 可通過結(jié)合circsirt1 抑制RA-FLSs 凋亡以及加重炎癥反應(yīng)。本研究主要分析了miR-132-3p 對RA-FLSs增值和侵襲的影響。結(jié)果表明miR-132-3p 在RA 患者滑膜組織以及RA-FLSs中的表達降低，并且能夠抑制RA-FLSs增值和侵襲。

隨后的數(shù)據(jù)表明miR-132-3p 能夠結(jié)合FZD4。FZD4是一種卷曲蛋白，研究指出這個蛋白能夠通過circPTN/miR-145-5p/FZD4[17]、circ_0003972/miR-654-5p/FZD4[18]以及circ_0088036/miR-326/FZD4[19]等通路促進RA疾病進程。當前的工作說明了FZD4在RA患者以及RA-FLSs 中表達增加，并且參與miR-132-3p 介導(dǎo)的RA-FLSs增值和侵襲。Wnt蛋白家族能夠調(diào)控增殖、器官發(fā)生和遷移，且證據(jù)表明Wnt/β-catenin通路有助于FLSs增值[20]。Wnt1屬于Wnt蛋白家族成員，能夠和FLSs 中的FZD4 蛋白作用，這種聯(lián)系加重破骨細胞分化導(dǎo)致的骨侵蝕[21]。另外證據(jù)證實了Wnt1 誘導(dǎo)的基質(zhì)降解酶的分泌和細胞因子釋放涉及FZD4[22]。學(xué)者也說明Wnt1 和FZD4 的聯(lián)合能促進滑膜細胞中β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄因子的活化[23]。因此本研究又分析是否miR-132-3p 能夠通過抑制FZD4 的表達來調(diào)控Wnt/β-catenin 通路，結(jié)果表明Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc 和CyclinD1 蛋白表達在miR-132-3p過表達后被抑制，但是miR-132-3p和FZD4 的共轉(zhuǎn)染釋放了miR-132-3p 過表達對這些蛋白表達的影響，表明miR-132-3p 能夠通過調(diào)控FZD4 來抑制Wnt/β-catenin通路的激活。

綜上所述，miR-132-3p 通過抑制FZD4/Wnt/β-catenin 通路激活來抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖和侵襲，說明miR-132-3p 可能限制RA發(fā)展，開發(fā)miR-132-3p相關(guān)藥物制劑可能是治療RA的一種新策略。但是當前的研究僅在細胞模型中說明miR-132-3p 對RA有抑制作用，隨后的研究還應(yīng)用鼠模型實驗驗證此結(jié)論。