張 娟， 許 力， 張文鵬， 孫 琦， 奚江波

（1.武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，武漢 430205；2.清華大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，北京 100084）

0 引言

近年來，為響應(yīng)國家培養(yǎng)創(chuàng)新型人才的號召，各高校均相應(yīng)增加了儀器分析實驗教學(xué)學(xué)時。事實上，實驗教學(xué)相對于理論教學(xué)來說更加直觀，更能發(fā)揮學(xué)生的主觀能動性，是培養(yǎng)學(xué)生知識創(chuàng)造能力、應(yīng)用能力和實踐能力的重要環(huán)節(jié)［1-3］。而傳統(tǒng)的儀器分析實驗課程教學(xué)大多聚焦儀器的操作使用方法，實驗內(nèi)容選題不具有吸引力，多為單一性的驗證性實驗，缺乏應(yīng)用型實驗設(shè)計案例，導(dǎo)致學(xué)生學(xué)習(xí)主觀能動性不高。儀器分析實驗課程教學(xué)應(yīng)該與科研工作緊密結(jié)合，從現(xiàn)實問題出發(fā)，設(shè)計和建立實驗方案，完成實驗的整個過程，讓學(xué)生體驗科研實踐工作的重要性。筆者及團(tuán)隊成員長期從事儀器分析教學(xué)和科研的相關(guān)工作，在磁性固相萃?。?-6］、管內(nèi)固相萃?。?-8］、固相微萃取［9］結(jié)合色譜分析法用于生物標(biāo)記物、抗生素殘留、環(huán)境污染物等化合物的分析和檢測方面積累了大量的經(jīng)驗，這些都為培養(yǎng)學(xué)生實踐、探索和創(chuàng)新能力提供了有力支撐。

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類含2 個或2 個以上苯環(huán)組成的有機(jī)污染物，可通過大氣、水體和食物攝取等方式進(jìn)入人體，具有遺傳毒性、突變性和致癌性，因此檢測水體中的多環(huán)芳烴對人類生命健康具有重要意義［10］。氣相色譜法是分析有機(jī)環(huán)境污染物最為常用的方法，具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點［11-12］。然而，由于實際樣品基質(zhì)中PAHs的含量較低，需要通過樣品前處理技術(shù)對樣品富集濃縮后才能被檢測到。固相微萃取（SPME）是一種及采樣、濃縮、進(jìn)樣、分析于一體的重要的樣品前處理技術(shù)，它具有操作簡單、無須使用溶劑、對環(huán)境友好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點［13］，非常適合于用于本科生教學(xué)實驗。目前SPME技術(shù)在本科生實驗中還未涉及，本實驗將SPME 技術(shù)與氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GC-FID）結(jié)合引入本科儀器分析實驗中，采用廉價易得的鉛筆芯作為涂層材料制備SPME探針，結(jié)合氣相色譜用于檢測環(huán)境水中的污染物PAHs，該實驗設(shè)計使學(xué)生充分了解SPME探針的制備、樣品前處理、氣相色譜分離和定量檢測整個分析流程。通過較為簡單的實驗，獲得實際環(huán)境樣本中污染物的含量信息，激發(fā)學(xué)生對檢測技術(shù)的興趣。該實驗選題貼近生活，使學(xué)生充分意識到環(huán)境污染問題的嚴(yán)重性，增強學(xué)生的環(huán)境保護(hù)意識，讓學(xué)生學(xué)以致用，真真切切感受到儀器分析實驗的重要性，在對實驗原理和流程完全理解和掌握的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力，拓寬學(xué)生的專業(yè)視野，培養(yǎng)綜合思維以及創(chuàng)新能力［14-16］。

1 實驗教學(xué)目標(biāo)與安排

本實驗項目定位為綜合性或開放性儀器分析實驗。實驗時長8 學(xué)時，教學(xué)組織方面可以采用2 人1組或4 人1 組，要求學(xué)生共同設(shè)計實驗方案并分工協(xié)作。第1 階段（2 學(xué)時）：任課教師講解實驗原理、儀器操作和實驗注意事項，重點引導(dǎo)學(xué)生熟悉實驗內(nèi)容和方案。學(xué)生配制相關(guān)溶液，制備固相微萃取探針，掌握氣相色譜儀的原理和操作。第2 階段（2 學(xué)時）：學(xué)生按分組進(jìn)行頂空固相微萃取條件和解吸條件的優(yōu)化。第3 階段（4 學(xué)時）：學(xué)生在最佳萃取條件和解析條件下，測定不同濃度的混合PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行方法學(xué)考察，建立分析方法。利用本實驗建立的方法，對湖水、雨水、自來水中的PAHs 進(jìn)行分析測定，并進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，考察方法的準(zhǔn)確性。學(xué)生按分組自愿選擇其中一種水樣進(jìn)行測定，并進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗。

2 實驗方法

2.1 儀器與試劑

儀器：氣相色譜儀（Agilent 7820A），配備氫火焰離子化檢測器，HP-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m × 0.32 mm（i.d.）× 0.25 μm），商品化固相微萃取手柄，離心機(jī)，超聲波清洗儀，UPDR-II-20L超純水制取系統(tǒng)。

試劑：多環(huán)芳烴包括萘（Nap），苊烯（Any），苊（Ana），芴（Flu），菲（Phe）均購自阿拉丁試劑公司，湖水采自校園內(nèi)靜思湖，甲醇購自國藥集團(tuán)，2B 鉛筆購自學(xué)校超市，實驗用水均為超純水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg的Nap、Any、Ana、Flu、Phe置于10 mL的容量瓶中，加入少量甲醇溶解，再用甲醇稀釋定容，配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4℃冰箱保存。分別取1 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容后得到濃度為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用甲醇逐級稀釋成濃度為50、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 色譜條件

色譜條件：設(shè)定進(jìn)樣口溫度為280 ℃，檢測器溫度為300 ℃；升溫程序，初溫45 ℃保持1 min，然后以15℃/min升至130 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min 升至280 ℃；載氣為高純氦氣（純度≥99.99%），流速2 mL/min；空氣流速為250 ml/min；不分流模式。

2.4 鉛筆芯固相微萃取探針的制備

取2B鉛筆，用小刀刮下鉛筆芯，瑪瑙研缽碾碎，用甲醇、水分別洗滌數(shù)次，離心分離后于100 ℃下真空（-0.1 MPa）干燥0.5 h 得到鉛筆芯粉末。取市售2 cm不銹鋼絲（直徑為0.1 mm）一段約1 cm 用砂紙打磨粗糙后，分別用甲醇和水清洗，于60 ℃烘箱中干燥后備用。稱取0.5 g硅酮密封膠用1 mL環(huán)己烷稀釋，將一端經(jīng)處理的不銹鋼絲插入上述溶液中5 s 后取出，隨后立即插入到鉛筆芯粉末中，取出后于稱量紙上旋轉(zhuǎn)按壓得到均勻的涂層，將其放入60 ℃烘箱中加熱10 min除去殘留的溶劑，將涂敷有鉛筆芯的不銹鋼絲固定在SPME不銹鋼套管的內(nèi)管中，最后將該探針插入氣相色譜進(jìn)樣口280 ℃老化1 h，得到鉛筆芯固相微萃取探針。

2.5 頂空固相微萃取實驗和水樣的處理

用鉛筆芯固相微萃取探針對PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行SPME實驗，SPME流程如圖1 所示。取20 μL濃度為50 μg/mL 的PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于密封的玻璃瓶中，加水稀釋至20 mL 得到濃度為0.05 μg/mL 的PAHs水溶液，將鉛筆芯固相微萃取探針插入該密封玻璃瓶的溶液上方，溶液磁力攪拌，萃取完成后，將涂層收回到內(nèi)管并拔出探針，迅速插入氣相色譜進(jìn)樣口并推出涂層熱解吸，氣相色譜儀檢測信號。對學(xué)生進(jìn)行分組，優(yōu)化萃取和解析條件，每組學(xué)生選做一個條件的優(yōu)化實驗，每個條件自主選取5 個點，分別考察萃取時間（5 ～50 min）、萃取溫度（20 ～70 ℃）、水溶液中NaCl鹽濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）（0 ～30%）和解析時間（1 ～10 min）對萃取性能的影響，以確定最佳萃取條件和解析條件。

圖1 頂空SPME流程示意圖

實際樣品為湖水、河水等天然水源，用0.45 μm微孔濾膜過濾后直接采用上述流程進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 鉛筆芯涂層的表征

用場發(fā)射掃描電鏡（FESEM）對涂層表面形貌進(jìn)行了表征。如圖2 所示，裸蝕刻的不銹鋼絲表面較為光滑，而涂覆鉛筆芯粉末后，不銹鋼絲表面呈現(xiàn)粗糙多孔狀、且涂層分布均勻，表明鉛筆芯涂層均勻的涂敷到不銹鋼絲表面。FESEM測試由老師操作完成。

圖2 蝕刻不銹鋼絲（a）和涂敷鉛筆芯的不銹鋼絲（b）FESEM圖像（×200）

3.2 萃取條件和解析條件優(yōu)化

3.2.1 萃取時間的選擇

萃取時間直接影響探針對PAHs 萃取性能的好壞，選取5 個不同萃取時間（10、20、30、40、50）min，考察萃取時間對PAHs萃取性能的影響。學(xué)生通過不同萃取時間下，氣相色譜分離得到的PAHs色譜圖的峰面積進(jìn)行比較分析。如圖3 所示，隨著萃取時間從10 min增加到50 min，Nap、Any 和Ana 的峰面積沒有明顯變化，這是由于對于相對分子質(zhì)量小的、具有相對高擴(kuò)散系數(shù)的PAHs，吸附劑對其吸附平衡時間較短；而Flu和Phe的峰面積隨著萃取時間的增加先增加后基本保持不變，這是由于對于苯環(huán)多的相對分子質(zhì)量較大的PAHs，其具有相對較低的擴(kuò)散系數(shù)，與低相對分子質(zhì)量的多環(huán)芳烴相比，達(dá)到吸附平衡時間較長，因此峰面積先增加后基本保持不變。因此，選擇最佳萃取時間為30 min。

圖3 萃取時間對PAHs萃取峰面積的影響

3.2.2 萃取溫度的選擇

萃取溫度影響PAHs 在水相里面的分配，進(jìn)而影響探針的萃取性能。學(xué)生自主選取20、30、40、50、60℃，考察不同萃取溫度對PAHs 萃取性能的影響。通過比較不同溫度下萃取色譜圖的PAHs峰面積來選擇最佳萃取溫度。如圖4 所示，隨著萃取溫度從20 ℃升高到60 ℃，低相對分子質(zhì)量PAHs（如Nap、Any 和Ana）的峰面積逐漸減小，這是由于吸附過程是個放熱過程，對于沸點低的小分子PAHs 應(yīng)選擇較低的萃取溫度；Flu的峰面積隨著萃取溫度升高先增大后減小，而Phe的峰面積隨著萃取溫度升高先增大后基本保持不變，這是由于提高萃取溫度會加速分析物向頂空的擴(kuò)散，但大多數(shù)吸附過程是放熱過程，高萃取溫度會導(dǎo)致纖維上吸附的多環(huán)芳烴量被解吸；綜合考慮后，選擇萃取最佳溫度為30 ℃。

圖4 萃取溫度對PAHs萃取峰面積的影響

3.2.3 鹽濃度的選擇

水溶液中鹽的濃度影響PAHs在兩相之間的分配系數(shù)，學(xué)生自主選取了NaCl 鹽濃度分別為15%、20%、25%、27%和30%，考察水溶液中鹽濃度對PAHs萃取性能的影響。根據(jù)色譜圖峰面積大小，選擇最佳鹽濃度。如圖5 所示，隨著水溶液中鹽濃度的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)逐漸增加到27%時，萃取所得的PAHs 峰面積最大，當(dāng)繼續(xù)增加鹽濃度時，水溶液中NaCl 有少量析出，故選擇鹽濃度為27%。

圖5 鹽濃度對PAHs萃取峰面積的影響

3.2.4 解吸時間的選擇

解吸時間在一定程度上影響PAHs峰面積。短的解吸時間可能導(dǎo)致探針上PAHs 解吸不完全，因此學(xué)生自主選擇了1、2、3、4 和5 min 5 個不同解吸時間，考察不同解析時間對PAHs萃取性能的影響。從圖6 可以看出，解析時間對PAHs峰面積影響較小，表明吸附在探針表面的PAHs在高溫下能快速從吸附劑上解析下來，考慮時間成本，故選擇解析時間為1 min。

圖6 解析時間對PAHs萃取峰面積的影響

3.3 方法的線性范圍，檢測限和精密度

為建立PAHs 的固相微萃取-氣相色譜分析檢測方法，每組學(xué)生將一系列不同濃度的PAHs 水溶液在最優(yōu)的萃取和解吸條件下進(jìn)行進(jìn)樣分析，考察線性范圍、線性方程、線性相關(guān)系數(shù)的平方、檢測限（LOD）（信噪比為3）、定量限（LOQ）（信噪比為10）及精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD），并計算結(jié)果，其中一組學(xué)生數(shù)據(jù)見表1。從表中可以看出，基于鉛筆芯為固相微萃取探針的SPME-GC-FID分析方法線性范圍寬、檢測靈敏度高、精密度好。

表1 多環(huán)芳烴濃度的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限和精密度

3.4 環(huán)境水樣品的測定和加標(biāo)回收率

利用本實驗建立的方法，對湖水、雨水、自來水中的PAHs進(jìn)行分析測定。每組學(xué)生自愿選擇一種水樣進(jìn)行測定，進(jìn)行3 個濃度的加標(biāo)回收率實驗，并計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。表2 為其中一組學(xué)生檢測湖水中PAHs 及加標(biāo)回收率的結(jié)果，在湖水中未檢測到PAHs，3 種不同濃度PAHs 加標(biāo)回收率在66.76% ～114.17%，結(jié)果令人滿意。圖7 為湖水（A）和加標(biāo)濃度為10 ng/mL（B）的湖水經(jīng)SPME 的氣相色譜圖。這些研究結(jié)果表明本實驗建立的SPME-GC 方法是一種準(zhǔn)確檢測痕量PAHs的分析方法。

表2 湖水樣品中多環(huán)芳烴的分析結(jié)果

圖7 湖水（A）和加標(biāo)濃度為10 ng·mL -1的湖水（B）經(jīng)SPME后的氣相色譜圖

4 結(jié)語

設(shè)計了基于廉價易得的鉛筆芯為涂層材料的固相微萃取探針用于氣相色譜檢測環(huán)境水中的多環(huán)芳烴，是對原有儀器分析實驗的改進(jìn)，增加了固相微萃取相關(guān)內(nèi)容，擴(kuò)大了學(xué)生的知識面，讓學(xué)生充分了解從材料制備、萃取分析和定量檢測整個實驗流程，使學(xué)生對儀器分析的實際應(yīng)用有了更深刻的認(rèn)識、了解和掌握。學(xué)生對分析條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)萃取條件和解吸條件，分別為萃取時間30 min、萃取溫度30 ℃、鹽濃度的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)27%、解吸時間1 min。在最優(yōu)條件下建立了基于鉛筆芯涂層的SPME-GC 方法檢測環(huán)境水體中的PAHs。該方法線性范圍寬，檢測靈敏度高，精密度高，加標(biāo)回收率為66.76% ～114.17%。本實驗設(shè)計結(jié)合了筆者相關(guān)的科研工作，將科研實踐工作與儀器分析實驗教學(xué)相結(jié)合，讓學(xué)生認(rèn)識到固相微萃取技術(shù)對分析檢測的重要性，通過該實驗讓學(xué)生熟練掌握氣相色譜儀的原理和操作，提高學(xué)生對數(shù)據(jù)結(jié)果的分析和處理能力，激發(fā)了學(xué)生的求知欲和創(chuàng)新意識，擴(kuò)展學(xué)生的視野，讓學(xué)生真切體會科研工作的重要性和趣味性，為后續(xù)職業(yè)發(fā)展和規(guī)劃提供一定的引導(dǎo)作用。