韓 雪，徐 丹，徐景峨，苗小猛，伍革民，馮宇隆，伍友豪，舒 剛，趙小玲

（1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005；2.貴州宏宇畜牧技術(shù)發(fā)展有限公司，貴州貴陽 550005；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都 611130）

2021 年新一輪全國畜禽遺傳改良計(jì)劃針對地方特色品種雞生產(chǎn)性能低、生物安全體系不健全、疫病凈化不到位等問題提出了一系列的要求及目標(biāo)，強(qiáng)調(diào)了加強(qiáng)對地方雞種種源垂直傳播疫病的凈化，重點(diǎn)凈化以雞白痢沙門氏菌病、禽白血病等為主的種源垂直傳播疫病。在當(dāng)前國家政策的要求下，應(yīng)加強(qiáng)家禽疫病綜合防控工作，著力解決我國家禽養(yǎng)殖業(yè)疫病防控的短板[1]。

貴州地處中國西南部，地勢復(fù)雜，具有高原、山地、丘陵和盆地等4 種地形，其中92.5%的面積為山地和丘陵。其多樣的地形地貌和豐富的林地資源，以及多民族的人文背景，造就了極為豐富的家禽資源，擁有畢節(jié)地區(qū)烏蒙烏骨雞和威寧雞、安順地區(qū)高腳雞、黔西南地區(qū)興義矮腳雞、黔東南地區(qū)小香雞、遵義地區(qū)赤水烏骨雞、長順綠殼蛋雞、黔南地區(qū)瑤山雞等8 個(gè)國家畜禽遺傳資源品種。這些品種具有豐富多樣的體型外貌特征、優(yōu)良的肌肉品質(zhì)和突出的抗病和抗逆能力，是保障人民群眾日益豐富的物質(zhì)文化需求的重要基因庫[2]。近年來，隨著貴州生態(tài)家禽產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大，優(yōu)質(zhì)地方雞的開發(fā)利用也越來越受重視。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的壯大、集約化水平低、養(yǎng)殖環(huán)境差等因素造成各種疫病頻發(fā)，嚴(yán)重危害了貴州地方養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[3]。

為了保障貴州地方優(yōu)質(zhì)雞種產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展，減少疫病對養(yǎng)殖業(yè)的沖擊，本文首次系統(tǒng)的對貴州8 個(gè)地方雞種的各類主要疫病流行情況進(jìn)行了調(diào)查，以期為貴州地方雞養(yǎng)殖中雞白痢、大腸桿菌病、禽流感、新城疫、禽白血病等常見疫病的防控及凈化工作提供流行病學(xué)依據(jù)，為貴州地方雞種常見疫病預(yù)防提供數(shù)據(jù)支撐，促進(jìn)健康養(yǎng)殖，提高經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本采集

2021 年，本研究從貴州烏蒙烏骨雞、威寧雞、普定高腳雞、興義矮腳雞、黔東南小香雞、赤水烏骨雞、長順綠殼蛋雞和瑤山雞等8 個(gè)地方雞種雞場（戶）采集了用于禽流感和新城疫抗體滴度測定的240 份雞翅靜脈血清樣品，用于禽白血病-J 亞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測的240 份泄殖腔棉拭子，以及用于沙門氏菌和大腸桿菌分離的240 份泄殖腔棉拭子。各個(gè)群體隨機(jī)抽取30只雞（公母各半）進(jìn)行大體解剖，臨床鑒別判斷禽流感、新城疫及腫瘤病變。收集腫瘤樣本進(jìn)行組織病理學(xué)診斷，解剖過程中僅在烏蒙烏骨雞中發(fā)現(xiàn)一例腫瘤病變。樣本信息見表1。

1.2 主要試劑及儀器

禽白血病-J 亞群抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX 公司；1%公雞紅細(xì)胞懸液（自配），禽流感抗原和陽性血清由哈爾濱國生生物科技股份有限公司提供，新城疫抗原和陽性血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。LB 肉湯、SC 肉湯培養(yǎng)基、MH 肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS 瓊脂培養(yǎng)基、亞硫酸鉍培養(yǎng)基等均購于杭州天和微生物試劑有限公司。8 種藥敏紙片（多西環(huán)素、妥布霉素、阿奇霉素、氨芐西林、紅霉素、慶大霉素、諾氟沙星、新霉素）購自成都市科龍化工試劑廠。

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠），微量加樣器（德國Eppendorf公司），超凈工作臺(tái)（江蘇蘇靜集團(tuán)泰安有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），氣浴恒溫振蕩器（金壇市科析儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-4，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司），電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司），旋渦混合器（XW-80A，上海青浦滬西儀器廠），徠卡顯微成像系統(tǒng)（DM1000，德國Leica），石蠟切片機(jī)（RM2235，德國Leica）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 禽白血病及新城疫、禽流感抗體水平測定

按照禽白血病-J 亞群的ELISA 抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行抗體檢測和結(jié)果判定。新城疫抗體檢測參照《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T16550—2020），采用血凝（HA）血凝抑制試驗(yàn)（HI）方法進(jìn)行，HI 抗體≥4log2 的樣品判定為合格。禽流感H5 亞型H5（Re-6）、H5（Re-8）、H9 亞型禽流感抗體檢測參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2020），采用血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）方法進(jìn)行，HI 抗體≥5log2的樣品判定為合格[4]。

1.3.2 大腸桿菌和沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性檢測

（1）細(xì)菌分離純化

無菌采集泄殖腔棉拭子樣本，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12～24h，在麥康凱培養(yǎng)基上生長出表面光滑濕潤、邊緣整齊稍凸起，直徑1～2mm 的紅色圓形菌落，接種到SS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12～24h，生長出粉紅菌落，在亞硫酸鉍瓊脂表現(xiàn)不生長，革蘭氏染色陰性小桿菌，則判定為大腸桿菌；在麥康凱培養(yǎng)基上生長出淡黃色半透明單個(gè)菌落，接種到SS 培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12～24h，生長出無色至灰白色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)呈黑色的菌落，在亞硫酸鉍瓊脂生長為綠色單個(gè)菌落，革蘭氏染色陰性小桿菌，則判定為沙門氏菌。重復(fù)上述純化步驟2 次[5]。

（2）藥敏試驗(yàn)

采用平板計(jì)數(shù)法將菌液濃度調(diào)至1.0×106CFU/mL，將調(diào)制后菌液200μL 均勻涂抹于普通瓊脂培養(yǎng)基，取8 種抗生素藥敏紙片（慶大霉素、妥布霉素、新霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素、紅霉素、諾氟沙星、氨芐西林），平整貼在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h 后，測定細(xì)菌抑菌圈大小。藥敏試驗(yàn)采用Kirby-bauer 瓊脂擴(kuò)散法[6]，依照藥敏紙片的抑菌效果范圍標(biāo)準(zhǔn)判定藥物敏感程度（表2）。

表2 藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 腫瘤組織病理學(xué)診斷

將4%多聚甲醛固定的組織樣本，經(jīng)流水沖洗30min，進(jìn)行組織修塊，放入病理包埋塑料筐中進(jìn)行脫水（75%乙醇6h，85%乙醇10h，95%乙醇4h，無水乙醇Ⅰ2h，無水乙醇Ⅱ2h），透明（二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ15min），浸蠟3h，包埋組織塊于石蠟中。隨后采用Leica RM2235切片機(jī)將組織切成5μm 厚的薄片，在溫水中將組織展平后撈在載玻片上，60℃烘烤切片至少2h。之后，切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，流水洗滌20min，用蘇木素染色30min，流水洗滌20min，鹽酸酒精分化，伊紅染色5min，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明后用樹脂膠封片。在顯微鏡下觀察腫瘤的病理變化，完整地瀏覽整張組織片，對各組明顯病變的部位均采用顯微成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將檢測結(jié)果錄入Excel，按區(qū)域和場點(diǎn)類別對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和描述，分析得出不同地區(qū)、不同品種雞群疫病流行情況。

2 結(jié)果

2.1 血清抗體檢測結(jié)果

8 個(gè)貴州地方品種雞群的血清禽白血病抗體檢測結(jié)果如表3 所示，禽白血病平均抗體陽性率為38.75%。不同品種雞群中禽白血病抗體的陽性率存在一定差異：興義矮腳雞最低（10%），赤水烏骨雞最高（76.66%）；威寧雞、烏蒙烏骨雞和赤水烏骨雞三個(gè)品種雞群禽白血病陽性率超過50%。貴州黔南自治區(qū)、貴州黔東南自治區(qū)、貴州省畢節(jié)市、貴州黔西南自治區(qū)和貴州省遵義市5 個(gè)區(qū)域的禽白血病陽性率結(jié)果對比顯示，貴州黔西南自治區(qū)最低（10%），貴州省遵義市最高（76.66%），貴州省畢節(jié)市禽白血病陽性率也超過50%。此外，從樣本來源角度分析，保種場來源的雞群禽白血病陽性率為46.11%，而保護(hù)區(qū)農(nóng)戶來源的雞群禽白血病陽性率為16.67%。

表3 貴州省各地方品種雞雞群禽白血病抗體檢測結(jié)果

8 個(gè)貴州地方品種雞群的血清新城疫和禽流感抗體檢測結(jié)果如表4 所示，所有品種新城疫抗體效價(jià)均高于4log2，符合免疫要求。威寧雞和赤水烏骨雞禽流感病毒H9 亞型抗體效價(jià)低于5，需要補(bǔ)充疫苗接種；興義矮腳雞和普定高腳雞禽流感病毒H5N8 亞型抗體效價(jià)為0，可能沒有注射該血清型疫苗，需要補(bǔ)充疫苗接種；興義矮腳雞、黔東南小香雞和普定高腳雞禽流感病毒H5N6 亞型抗體效價(jià)低于5，需要補(bǔ)充疫苗接種。此外，臨床解剖診斷未發(fā)現(xiàn)禽流感和新城疫感染病例，所有泄殖腔棉拭子樣本均未檢出禽流感病毒和新城疫病毒特異性核酸，8 個(gè)地方品種雞群無禽流感和新城疫感染。

表4 貴州省各地方品種雞雞群新城疫和禽流感抗體檢測結(jié)果 單位：nlog2 個(gè)滴度

2.2 大腸桿菌和沙門氏菌的分離及耐藥性檢測結(jié)果

細(xì)菌分離結(jié)果如表5 所示，從長順綠殼蛋雞、興義矮腳雞、黔東南小香雞、普定高腳雞、赤水烏骨雞和瑤山雞泄殖腔棉拭子中分離出大腸桿菌菌株；從普定高腳雞和赤水烏骨雞泄殖腔棉拭子中分離出沙門氏菌菌株。威寧雞與烏蒙烏骨雞未分離出大腸桿菌及沙門氏菌菌株。

表5 貴州各地方品種雞肛門拭子細(xì)菌分離情況

所分離出的大腸桿菌和沙門氏菌藥敏結(jié)果如表6 所示，結(jié)果顯示來自貴州省6 個(gè)地方品種雞泄殖腔棉拭子所分離的大腸桿菌和沙門氏菌均存在不同程度的耐藥問題。其中從長順綠殼蛋雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星和阿奇霉素敏感，對妥布霉素、紅霉素和氨芐西林耐藥；從黔東南小香雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素、多西環(huán)素、紅霉素、和諾氟沙星敏感，對妥布霉素和氨芐西林耐藥。從興義矮腳雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素和妥布霉素敏感，對紅霉素、多西霉素和氨芐西林耐藥；從普定高腳雞分離出的大腸桿菌菌株對慶大霉素、妥布霉素和新霉素敏感，對多西霉素、紅霉素、阿奇霉素和氨芐西林耐藥；從瑤山雞分離出的大腸桿菌菌株僅對慶大霉素敏感，對多西環(huán)素、妥布霉素、紅霉素、阿奇霉素和氨芐西林耐藥；從赤水烏骨雞分離出的大腸桿菌菌株僅對諾氟沙星敏感，對慶大霉素、多西環(huán)素、妥布霉素、新霉素、紅霉素和氨芐西林耐藥。對于所分離出的沙門氏菌菌株，從赤水烏骨雞中分離的菌株對多西環(huán)素、妥布霉素、阿奇霉素和氨芐西林耐藥，對慶大霉素敏感；從普定高腳雞所分離出的菌株僅對紅霉素和氨芐西林耐藥，對慶大霉素、多西環(huán)素、妥布霉素、新霉素和諾氟沙星敏感。

表6 抑菌圈直徑 單位：mm

2.3 腫瘤病理檢測結(jié)果

在烏蒙烏骨雞中這例腫瘤樣本病理診斷結(jié)果為肝臟組織膽管癌。組織病理學(xué)顯示肝內(nèi)膽管系統(tǒng)上皮惡性細(xì)胞增生。瘤細(xì)胞呈立方形，泡狀核，胞質(zhì)中的嗜堿性顆粒較少，排列以管狀結(jié)構(gòu)為主。大量增生的膽管上皮細(xì)胞為立方柱狀上皮細(xì)胞，呈腺體樣復(fù)合排列，有或無管腔，通過組織細(xì)胞隔彼此分離，與腫瘤增殖相關(guān)的異嗜性粒細(xì)胞浸潤明顯（圖1）。

圖1 烏蒙烏骨雞雞肝臟膽管瘤病理切片圖

3 討論

從監(jiān)測結(jié)果來看，貴州地方品種雞有不同程度禽白血病感染情況，應(yīng)加強(qiáng)對禽白血病的防控，特別是貴州省畢節(jié)市畢節(jié)地區(qū)威寧雞和烏蒙烏骨雞以及貴州省遵義市赤水烏骨雞存在嚴(yán)重感染。該病尚無疫苗和特效藥，有效的防控方法是以“檢測-淘汰陽性雞”為主的凈化措施。張小波等人在2019 年對貴州地方品種雞禽白血病流行病學(xué)調(diào)查的研究中同樣提示畢節(jié)地區(qū)威寧雞和烏蒙烏骨雞存在禽白血病嚴(yán)重感染的現(xiàn)象[7]。此外，本試驗(yàn)采用泄殖腔棉拭子ELISA 檢測，而雞基因組中內(nèi)源性的禽白血病-E 亞群cDNA 在一定條件下會(huì)表達(dá)出完整的禽白血病，因此可能出現(xiàn)禽白血病陽性率檢測偏高的現(xiàn)象[8]。禽白血病多以隱性感染形式存在于臨床健康雞群中，當(dāng)雞群因各種應(yīng)激因素導(dǎo)致抵抗力降低時(shí)，這些病毒就會(huì)大量復(fù)制，從而引起雞群發(fā)病和死亡，并可垂直傳播給下一代，導(dǎo)致上述病原難以根除。外來品種帶入、自然感染和部分禽用疫苗制品質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，可能是導(dǎo)致這些病原在雞群中廣泛存在的重要原因[9]。因此，貴州地方品種雞群對禽白血病的防控不僅應(yīng)該注意雞群之間的傳播，也應(yīng)該對地區(qū)之間禽類交易及運(yùn)輸做好相關(guān)的措施。此外，本試驗(yàn)在8 個(gè)貴州地方雞群中均未檢出禽流感和新城疫感染病例，提示雞場對這兩種疾病的防控工作效果較好。新城疫抗體水平較為理想，基礎(chǔ)免疫程序合理，疫苗免疫效果良好，為雞群提供了較好的保護(hù)力。禽流感是一種嚴(yán)重危害家禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展的烈性傳染病[10]，貴州8 個(gè)地方雞種禽流感抗體水平不整齊，特別是農(nóng)戶散養(yǎng)土雞興義矮腳雞和普定高腳雞，這兩個(gè)雞群禽流感各血清型的抗體效價(jià)不夠高或者離散度大，抗體滴度差距大，建議定期開展免疫抗體監(jiān)測，同時(shí)增加免疫程序管理，提高雞群免疫抗體保護(hù)力。

沙門氏菌和大腸桿菌均是條件性致病菌，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降時(shí)，細(xì)菌與宿主的生態(tài)平衡被打破，細(xì)菌的致病性便會(huì)表現(xiàn)出來，嚴(yán)重危害機(jī)體健康[11,12]。大腸桿菌與沙門氏菌既可單獨(dú)感染雞群，也可與其他病原菌混合感染致發(fā)病，實(shí)際生產(chǎn)中大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例尤為突出，在我國養(yǎng)雞行業(yè)廣泛存在，其危害貫穿整個(gè)養(yǎng)殖周期，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益下降等一系列問題[5]。因此，對沙門氏菌的流行和感染狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測具有十分重要的意義。本試驗(yàn)檢測結(jié)果提示威寧雞與烏蒙烏骨雞日常衛(wèi)生管理水平良好，清欄、消毒等措施較佳，未檢出大腸桿菌和沙門氏菌；其他6 個(gè)貴州地方品種泄殖腔棉拭子中均分離出大腸桿菌菌株，且普定高腳雞和赤水烏骨雞的泄殖腔棉拭子中分離出沙門氏菌菌株，提示有沙門氏菌和大腸桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，建議相關(guān)養(yǎng)殖場（戶）加強(qiáng)日常管理，提高生物安全意識(shí)，嚴(yán)格落實(shí)各項(xiàng)消毒制度，從而降低大腸桿菌病和雞白痢的發(fā)生及危害。

大腸桿菌和沙門氏菌都易產(chǎn)生對抗生素的耐受性，而且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，尤其是大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的病例[13]?；旌细腥緯r(shí)，雞的死亡率較高，用藥難度較大，其發(fā)病率、死亡率顯著增高。兩種細(xì)菌血清型種類較多，不同地區(qū)差別較大，不同菌株之間不產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，極易產(chǎn)生耐藥性[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，來自貴州省6 個(gè)地方品種雞泄殖腔棉拭子所分離的大腸桿菌和沙門氏菌均存在不同程度的耐藥問題，提示這些雞場可能存在抗生素濫用的情況，因此建議這些雞場若發(fā)生此類型病情時(shí)應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)科學(xué)用藥，且應(yīng)注意交替用藥，或選用中藥抗菌制劑，以獲得良好的治療效果。根據(jù)大腸桿菌與沙門氏菌的流行特點(diǎn)，要有效控制和預(yù)防疾病的發(fā)生，首先應(yīng)該加雞場強(qiáng)飼養(yǎng)管理水平，改善環(huán)境衛(wèi)生條件，同時(shí)提高雞群免疫力和雞場生物安全管理能力，從而有效抵御病原的侵襲，減少重大疫病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8 個(gè)貴州地方品種雞群隨機(jī)大體剖檢結(jié)果，僅僅發(fā)現(xiàn)一列腫瘤病變，彰顯了貴州地方雞種獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)性、抗寒、抗潮濕、抗病性[2]。與本試驗(yàn)監(jiān)測結(jié)果一致，前人研究發(fā)現(xiàn)貴州地方雞常見疾病為病毒或細(xì)菌引起的傳染病[15]?；厮葙F州8 個(gè)地方種雞群采樣場群發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖環(huán)境、不同種雞品種及其來源地區(qū)等與病毒或細(xì)菌性疾病的發(fā)生情況密切相關(guān)。因此，在開展貴州地方品種雞保種選育及開發(fā)利用過程中，針對不同地區(qū)和不同品種，加強(qiáng)持續(xù)不斷地監(jiān)測，及時(shí)淘汰患病陽性雞；改善飼養(yǎng)條件，重視雞舍建筑；加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和消毒殺菌技術(shù)，制定合理的免疫防控措施；逐步實(shí)現(xiàn)對貴州地方雞群傳染性疾病的凈化。

4 結(jié)論

8 個(gè)貴州省地方雞種白血病陽性率為10%～76.66%；新城疫抗體水平較為理想，但禽流感抗體水平不整齊，未檢出禽流感和新城疫感染病例；除威寧雞和烏蒙烏骨雞外，其他6 個(gè)貴州地方品種泄殖腔棉拭子中均分離出大腸桿菌菌株，普定高腳雞和赤水烏骨雞的泄殖腔棉拭子中分離出沙門氏菌菌株，且均存在不同程度的耐藥。通過掌握貴州地方雞的常見疾病，做好相對應(yīng)的防治措施，可有效提升貴州地方雞的生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖效益，有利于開展和推進(jìn)貴州地方雞的品種保護(hù)工作，提升貴州地方雞的價(jià)值。