苗耀天，馬 強，張 晉，曹振卿，董 偉

（1.武威市畜牧獸醫(yī)總站，甘肅武威 733000；2.甘肅省家畜繁育改良管理站，甘肅武威 733000；3.武威市畜牧獸醫(yī)科學研究院，甘肅武威 733000 ）

淫羊藿是中國常見傳統(tǒng)補陽藥，具有補腎助陽的功效。藥理研究表明，淫羊藿多糖有多種生物活性，具有抗氧化、增強機體生殖能力等功能[1]。淫羊藿是常見中藥材，生長于海拔1560～3100m 高度的山地，主要產(chǎn)于山西、陜西北部和甘肅東南部。多糖是淫羊藿的主要活性成分，不同形式的淫羊藿多糖在調(diào)節(jié)機體的各種生理病理途徑中發(fā)揮了獨特的生物學功能[2]。有研究指出，淫羊藿多糖能夠在精子抗氧化和調(diào)節(jié)機體生殖功能中發(fā)揮作用[3]。牛冷凍精液是一項非常完善的技術(shù)，然而在低溫保存精液的過程中，精子的活力、生存能力和受精率在相當大的程度上受到損害。已有研究表明，在稀釋液的配制過程中，用具有抗氧化作用的中藥有效成分來取代抗生素，可以在殺菌的同時抑制精子冷凍時的抗氧作用[4]。本研究旨在分離純化淫羊藿有效成分淫羊藿多糖，并評估淫羊藿多糖對牛精子冷凍效果的影響，以及對牛精子膜完整性、活力和人工授精受胎率的影響。

1 試驗材料

1.1 儀器

電熱套（國華電器有限公司），冷凝回流裝置（國華電器有限公司），層析柱，BSZ-160 自動部分收集器；實驗室專用超純水機CREAT，SHZ循環(huán)水真空泵，精子密度儀、顯微鏡、冷凍程控儀和封裝打印機等冷凍精液設備，液氮罐和液氮由甘肅家畜繁育改良管理站提供；人工授精母牛，配種設備由武威市涼州區(qū)城西肉牛專業(yè)養(yǎng)殖合作社提供。2kg 淫羊藿購自武威市同仁堂藥店。

1.2 試劑

主要試劑：95%乙醇、正丁醇、氯仿、苯酚、濃硫酸、考馬斯亮藍、葡萄糖標準品、牛血清蛋白標準品和稀釋液等，由甘肅省家畜繁育改良管理站提供。

2 方法

2.1 淫羊藿多糖的提取

2.1.1 打粉取藥店購買的淫羊藿2kg，制成淫羊藿粉末，裝入雙層紗布藥袋，扎牢袋口。

2.1.2 除雜、水提醇沉

加入95%的乙醇沒過淫羊藿粉末，170℃煮沸2～3h，重復多次直至煮出液顏色明顯變淺。將干燥后濾出的淫羊藿粉末用雙蒸水煮沸，2～3h 濾出淫羊藿粉末，重復多次直至煮出液顏色變?yōu)椴枭?，最后將所有煮出液濃縮至1L，待其冷卻后，添加95%的乙醇沉淀并過夜，得到粗多糖。

2.2 淫羊藿粗多糖的分離純化

2.2.1 Sevage 法脫蛋白

用正丁醇和氯仿反復沉淀離心除去蛋白，分液漏斗濾去有機溶劑，重復多次直至沒有沉淀生成。95%乙醇沉淀過夜，得到去完蛋白雜質(zhì)的淫羊藿粗多糖。

2.2.2 DEAE Fast Flow 柱層析

采用280mL 柱床體積的層析柱，稱取6g 淫羊藿粗多糖溶于60mL 蒸餾水里，充分攪拌。

（1）裝柱

旋緊層析柱的下方，使其呈單向封閉狀態(tài)，向柱內(nèi)注入約1/4 柱體積的蒸餾水。反復混勻填料,并緩慢倒入柱內(nèi)，待其自然沉降。沉降過夜后打開出水口，調(diào)節(jié)流速，等到液面降至膠面2～3cm 時，再旋緊層析柱下方關閉出水口，繼續(xù)添加填料，重復上述操作直至填料體積到達層析柱體積的85%，在整個灌注過程中保證膠的均勻，膠內(nèi)無氣泡，若存在氣泡或者紋路則重新裝柱。

（2）平衡

旋緊層析柱上下進出水口，再將上方進水口導管插入蒸餾水中，使流速保持在適當?shù)姆秶鷥?nèi)，均衡約3 個層析柱的柱床體積。

（3）上樣

將層析柱進水口導管從蒸餾水中取出，待柱內(nèi)蒸餾水流至膠表面，用50mL 注射器加入1/20柱體積的配制好的淫羊藿粗多糖溶液，沿層析柱管壁緩慢勻速加入多糖樣品，調(diào)整液體流速為0.5mL/min，組份收集器的轉(zhuǎn)速為8min/ 管，采取苯酚硫酸法，對糖進行實時檢測，在490nm 下測定各個收集管的吸光度。描繪洗脫曲線，將吸收峰一樣的洗脫液合并在到一起，待多糖溶液全部流入膠體，用注射器加蒸餾水至距離進水口約3cm，旋緊進水口，繼續(xù)將進水口導管插入蒸餾水中。

（4）洗脫

用蒸餾水洗脫，控制液體流速5s/ 滴，洗脫3個柱床體積。

（5）再生

采用堿-酸-堿的方式去除DEAE 離子交換柱上的雜質(zhì)，將填料從柱子上取出后，①置于0.5mol/L 的氫氧化鈉溶液中浸泡半個小時，半小時后使用蒸餾水反復抽濾清洗，直到pH 接近7。②接著應用事先配制好的0.5mol/L 的鹽酸水溶液浸泡30min，用蒸餾水反復抽濾清洗直到pH 接近7。重復①，清洗后儲存于70%乙醇中。

2.3 淫羊藿多糖的測定

2.3.1 溶液的制備

配5%苯酚、0.08mg/mL 葡萄糖標準品、50μg/mL 粗多糖溶液。

2.3.2 硫酸苯酚法繪制標準曲線

將0.08mg/mL 葡萄糖標準品，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 和0.8mL 配制的葡萄糖標準品，用雙蒸水補足至2mL，加入1mL 的苯酚，5mL 的濃硫酸；等到溶液冷卻后，在OD490處測定其吸光度。標準曲線圖以葡萄糖濃度為水平軸，490nm 處的吸光度為垂直軸繪制。

2.3.3 粗多糖中糖含量測定

取1mL 配制的50μg/mL 淫羊藿粗多糖液與1mL 雙蒸水混合。向混合液中加5%的苯酚1mL后，再加濃硫酸5mL。等待溶液冷卻后，在OD490 處測定吸光度，將所得的結(jié)果代入標準曲線，求得淫羊藿粗多糖中糖含量。

2.4 淫羊藿多糖中蛋白質(zhì)含量的測定

2.4.1 溶液的制備

配制0.05mg/mL 牛血清白蛋白標準品液、100μg/mL 淫羊藿粗多糖溶液。

2.4.2 考馬斯亮藍法繪制蛋白質(zhì)標準曲線

將0.05mg/mL 牛血清白蛋白標準品，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 和0.8mL 配制的葡萄糖標準品，用雙蒸水補足至1mL，加入5mL考馬斯亮藍，在OD595 處測定吸光度。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標（X），垂直軸為595nm 處吸收（Y）的回歸方程，繪制標準曲線。

2.4.3 粗多糖中蛋白含量測定

取1mL 的100μg/mL 淫羊藿粗多糖溶液加入5mL 考馬斯亮藍，在OD595 處測定吸光度。結(jié)果代入標準曲線，求得淫羊藿粗多糖中蛋白質(zhì)含量。

2.5 含淫羊藿多糖的牛凍精制作

2.5.1 淫羊藿多糖稀釋液制備

用超純水配制含淫羊藿多糖濃度分別為8、4、2、0mg/mL（對照組）成 品Optidyl 稀釋液（購自法國CRYO-VET 公司）各500mL。淫羊藿多糖組分EPs-1 和EPs-2 相對分子質(zhì)量為81.64×103、60.53×103，本文淫羊藿多糖相對分子質(zhì)量取兩組分平均值71.08×103[5]。

2.5.2 牛凍精制作

西蒙塔爾種公牛精液采集、活力檢測、密度測量、封裝冷凍和存儲嚴格按照《牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》（NY/T 1234—2018）的要求執(zhí)行。取10 頭西蒙塔爾種牛精液，稱重測量體積，每份精液用移液槍均分為5 等份，分別對應2.5.1中不同多糖濃度稀釋液稀釋，封裝冷凍后檢測凍精活力和畸形率，每種濃度制作凍精數(shù)量1000支。

2.5.3 凍精質(zhì)量檢測

將冷凍后凍精置于40℃溫水中解凍15s，剪去兩端封口滴入蓋玻片，400 倍顯微鏡下檢測活力；解凍凍精用姬姆薩染色后檢測，凍精畸形率。操作按《牛冷凍精液》（GB 4143—2008）的要求執(zhí)行。

2.5.4 試驗動物

選自武威市涼州區(qū)城西肉牛養(yǎng)殖合作社的300 頭體重適宜、情期規(guī)律、無病適齡的母牛。

2.5.5 配種

采用同期發(fā)情技術(shù)，所有試驗母牛注射25mg 氯前列腺醇鈉，次日注射12.5mg，挑選發(fā)情變現(xiàn)明顯母牛200 頭，隨機分為5 組。分別用淫羊藿多糖濃度為8、4、2、0mg/mL 的凍精進行配種，0mg/mL 組作為對照，輸精3 個月時直腸孕檢。

2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 21 版軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 水提醇沉法提多糖

通過水提醇沉技術(shù)，從2kg 淫羊藿原材料中提取得到 255.9134g 淫羊藿粗多糖干品。255.9134g 淫羊藿多糖干品溶解在雙蒸水中，用Savege 法脫蛋白去除淫羊藿多糖中的蛋白，然后用分液漏斗去除有機層，用醇沉法獲得109.6112g 淫羊藿多糖。

3.2 葡萄糖標準曲線

配制0.08mg/mL 葡萄糖標準品，如表1 加入試劑，在OD490 處測定吸光度。標準曲線圖以葡萄糖濃度為水平軸（X），在490nm 處的吸光度為垂直軸（Y）做回歸方程，得處相關系數(shù)為0.9997、方程為y=0.0458x+0.0035的標準曲線（見圖1）。

表1 多糖含量測定結(jié)果

圖1 葡萄糖標準曲線

3.3 蛋白標準曲線配

制0.05mg/mL 牛血清白蛋白標準品，如表2加入試劑，在OD595 處測定吸光度。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標（X），垂直軸為595nm 處吸收（Y）的回歸方程，得處相關系數(shù)為0.9971、方程為y=0.059x+0.0088 的標準曲線（見圖2）。

表2 多糖含量測定結(jié)果

圖2 蛋白質(zhì)標準曲線

3.4 粗多糖糖含量測定

分別配制50μg/mL 醇沉后的淫羊藿粗多糖和Sevage 法去蛋白后的淫羊藿粗多糖溶液，取1mL配制的淫羊藿粗多糖母液，加入1mL 雙蒸水、1mL 5%苯酚、5mL 濃硫酸，待其冷卻后，在OD490 處測定吸光度。測定結(jié)果如表1，由表可以看出，醇沉后的淫羊藿粗多糖的相對質(zhì)量58.86%，去蛋白后的淫羊藿粗多糖的相對質(zhì)量84.12%。

3.5 粗多糖中蛋白含量測定

測定結(jié)果如表2，由表可以看出，醇沉后的淫羊藿粗多糖的相對質(zhì)量7.93%，去蛋白后的淫羊藿粗多糖的相對質(zhì)量14.9%。

3.6 DEAE Fast Flow 柱層析

淫羊藿多糖流色譜法快速后，用苯酚-硫酸法測定OD 值，490nm 處吸光度檢測。用蒸餾水洗脫出一個峰，合并54～76 管。得到純化的淫羊藿多糖，將收集的糖溶液凍干后，獲得純度為94.8%的淫羊藿中性多糖51.2411g。洗脫曲線如圖3。

圖3 DEAE 快流多糖洗脫曲線

3.7 淫羊藿多糖稀釋液對精子抗凍性比較

由表3 可知，2mg/mL 與其他3 組對比精子活力明顯提高，說明2mg/mL 稀釋液時最適合凍精復蘇，能最大限度保存精子生殖功能；4mg/mL、2mg/mL 與其他其他組對比，精子畸形率降低，表明此兩種淫羊藿多糖濃度可改善畸形精子。

表3 淫羊藿多糖稀釋液對精子抗凍性比較

3.8 淫羊藿多糖凍精人工授精受胎率

由表4 可知，稀釋液中淫羊藿濃度為8mg/mL 時母牛受胎率最低（50.00%），其次是4mg/mL（56.67%），與對照組相比明顯偏低。稀釋液中淫羊藿多糖濃度為2mg/mL 時人工授精受胎率最高為80.00%；2mg/mL 濃度組凍精與對照組相比，受胎率、平均每頭牛所用凍精數(shù)量為差異不大，證明牛冷凍精液稀釋液中添加2mg/mL淫羊藿多糖不會對母牛受孕造成影響。

表4 人工授精對母牛受胎率

4 結(jié)論

淫羊藿多糖在配比濃度為2mg/mL 時最適合凍精復蘇，能最大限度保存精子活力、頂體完整率，且對母牛人工授精不會產(chǎn)生負面影響，人工授精受胎率高達80.00%。