唐 楊,邵高海

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院脊柱外科,重慶 402160)

幽門螺桿菌(HP)是一種革蘭陰性螺旋狀致病菌,可通過水解尿素產(chǎn)生二氧化碳和氨,從而中和胃酸,使HP長期定居于胃黏膜表面。長期的HP感染可引起慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等疾病。HP有引起全身炎性反應(yīng)的能力,與幾種胃外表現(xiàn)有關(guān),包括內(nèi)分泌疾病,如自身免疫性甲狀腺疾病、糖尿病、血脂異常和肥胖[1]。目前的流行病研究顯示,全球一半以上人口感染了HP,其中超過4億人有臨床癥狀[2],而我國的HP感染率在41.5%～72.3%[3],HP及其相關(guān)疾病對社會及經(jīng)濟(jì)造成了巨大負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松癥(OP)是以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的一種全身性、代謝性骨病[4]。OP可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。導(dǎo)致原發(fā)性O(shè)P的原因包括絕經(jīng)后雌激素水平降低、增齡造成骨重建失衡等,繼發(fā)性O(shè)P指由任何影響骨代謝的疾病和(或)藥物及其他明確病因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松。最新的一項多中心橫斷面研究估計,在我國40歲或以上成年人中,男性O(shè)P發(fā)生率為5.0%,女性為20.6%[5]。OP的臨床表現(xiàn)為骨痛及骨質(zhì)疏松性骨折,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。HP感染和OP作為2種臨床上常見疾病可能有著密切關(guān)系.有研究認(rèn)為,HP感染可誘發(fā)炎癥和免疫反應(yīng),如增加白細(xì)胞介素(IL)1和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平[6],從而可能引發(fā)骨吸收并調(diào)節(jié)骨再生。OP的危險因素有年齡、性別、體重指數(shù)、飲酒和吸煙等[7]。有研究指出,HP感染也是OP的危險因素[8-9],但這一結(jié)論存在爭議[10-11]。因此,HP感染可能與OP密切相關(guān),但二者關(guān)系尚不明確[12]。本研究主要通過生物信息學(xué)方法檢索獲得HP感染與OP的共同基因,構(gòu)建疾病共同基因的蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)并篩選出關(guān)鍵靶點基因,對關(guān)鍵基因進(jìn)行基因本體論(GO)功能和京東基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,闡述HP感染與OP的共同發(fā)病機(jī)制,理解二者在疾病過程中的相關(guān)性,為相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供理論參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 在Disgenet、OMIM、TTD、GeneCards、Pharmgkb等基因數(shù)據(jù)庫中查找引起OP和HP感染的疾病基因,去重整合后獲得關(guān)鍵靶點。

1.2方法

1.2.1疾病靶點獲取 在Disgenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Pharmgkb數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)中,以“helicobacter pylori”和“osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索HP感染及OP的疾病基因。在Disgenet、GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選獲得相關(guān)度較大的基因,將2組基因去重整合,通過在線網(wǎng)站Bioinformatics &Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集獲得韋恩圖,得到交集的共同靶點基因。

1.2.2PPI網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵靶基因篩選 將獲得的HP感染與OP共同靶點基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),物種設(shè)置為“Homo sapiens”得到PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape_v3.9.1軟件優(yōu)化PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖,并以度值大于或等于26篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中前10的關(guān)鍵靶點基因。

1.2.3基因富集分析 借助DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對HP感染與OP的共同靶點基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,篩選并列出前10的關(guān)鍵信號通路。使用在線網(wǎng)站微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)繪制富集結(jié)果氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1HP感染與OP基因收集情況 通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫初步獲得HP感染相關(guān)基因2 572個,OP相關(guān)基因5 061個。在Disgenet數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Score≥0.3進(jìn)行篩選,最終獲得HP感染相關(guān)基因798個。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Relevance score≥10,在Disgenet數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Score≥0.3進(jìn)行篩選,最終獲得OP相關(guān)基因493個,HP感染相關(guān)基因798個,通過取交集后獲得69個HP感染與OP共同靶點基因。見圖1。

圖1 HP感染與OP共同靶點基因韋恩圖

2.2PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點基因 通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建HP感染與OP共同靶點基因的PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)圖中包括66個節(jié)點和456條邊。見圖2。為確定HP感染與OP的關(guān)鍵靶點基因,利用Cytoscape_v3.9.1軟件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前10位的節(jié)點,包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、清蛋白(ALB)、CTNNB1、雌激素受體1(ESR1)、IL1B、IL6、瘦素(LEP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、MYC、TNF等。見圖3。

圖2 HP感染與OP共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 HP感染與OP共同核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3GO功能和KEGG通路富集分析 將HP感染與OP共同靶點基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO功能主要富集在序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)節(jié)、Ⅰ-κB激酶/核因子κB信號傳導(dǎo)、IL-8合成的正向調(diào)節(jié)等方面。見表1、圖4。KEGG通路包括人巨細(xì)胞病毒感染、沙門菌感染等信號通路。見表2、圖5。

表2 KEGG通路富集分析(前10條)

圖4 GO功能富集分析氣泡圖(前10條)

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖(前10條)

3 討 論

HP感染與OP作為2種常見的多發(fā)性疾病,其發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜,但在各自龐大的基因網(wǎng)絡(luò)中也有部分重合的基因信息。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)尋找龐大基因交叉部分,通過對核心靶點進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),HP感染與OP之間相互影響主要涉及以下生物過程:細(xì)胞凋亡過程的負(fù)向調(diào)節(jié)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、DNA模板化轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、胰島素分泌調(diào)節(jié)、NO生物合成過程的正向調(diào)節(jié)等。同時,通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),HP感染與OP之間可涉及多條共同信號通路,主要涉及炎癥因子、感染、腫瘤代謝等方面。通過映射獲得OP與HP感染的核心交集靶點,AKT1、ALB、CTNNB1、ESR1、IL1B、IL6、LEP、MMP9、MYC、TNF等為影響二者的重要靶點。這些核心交集靶點是可以通過不同的作用機(jī)制來影響人體的HP感染和OP。有研究表明,可通過抑制AKT/叉頭框蛋白O1信號通路抑制OP,從而改善OP[13]。長鏈非編碼RNA DANCR和miR-320a通過CTNNB1抑制調(diào)節(jié)OP成骨分化過程中的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路[14],從而影響OP。此外,ESR1包含許多多態(tài)性(Xbal和PvuⅡ),這可能在OP中起重要作用,其被認(rèn)為是骨折的易感基因[15]。部分候選基因如ESR1(骨中雌激素作用的主要介質(zhì))和骨密度與OP有關(guān)[16-18]。miR-874-3p通過下調(diào)LEP的表達(dá)促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化,從而抑制OP[19]。MMP9的過表達(dá)減弱破骨細(xì)胞形成,并抑制促炎細(xì)胞因子分泌[20]。MYC通過調(diào)節(jié)miR-320a/磷酸酶與張力蛋白同源物通路增強(qiáng)核因子κB受體活化因子配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成[21]。這一系列核心靶點可通過不同的作用機(jī)制影響HP感染及OP的骨形成或骨吸收的病理生理過程。

在所有核心靶點中,TNF、IL1B和IL6是HP感染和OP相互作用的關(guān)鍵節(jié)點。HP感染可誘發(fā)與消化道外疾病相關(guān)的個體炎癥和免疫反應(yīng)[22]。HP感染人體后可釋放細(xì)胞因子如TNF-α、IL1和IL6,這些細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)骨骼的吸收和轉(zhuǎn)化,促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成,進(jìn)而引起局部或全身性O(shè)P[6]。HUANG等[23]的一項研究駁斥了全身炎癥與OP有關(guān)的觀點,其認(rèn)為HP感染除了引起炎癥外還可能導(dǎo)致OP。如慢性HP感染可能導(dǎo)致胃黏膜萎縮,減少胃酸分泌,進(jìn)而抑制鈣的吸收,從而有可能對骨量產(chǎn)生不利影響[24]。同樣,長期使用質(zhì)子泵抑制劑治療或預(yù)防胃十二指腸黏膜損傷與骨密度降低和骨折相關(guān)[25]。此外,對于男性患者而言,OP的另一個潛在機(jī)制可能是雌激素水平降低,這反過來又可能增加CagA+HP菌株的骨吸收[26]。因此,HP的感染主要通過炎癥因子及感染從而影響患者OP。

通過核心靶點富集分析可以發(fā)現(xiàn),諸多靶點通過調(diào)控多條通路發(fā)揮對HP感染及OP的作用。這些信號通路多為炎癥感染有關(guān)的通路。乙型肝炎病毒相關(guān)性肝硬化是OP的危險因素,骨吸收增強(qiáng)是嚴(yán)重肝硬化患者OP風(fēng)險增加的原因[27]。而肝硬化多為乙型肝炎感染所致。在對77 515例患者3年的隨訪中發(fā)現(xiàn),HP感染女性患者OP發(fā)生率高于未感染女性患者[28]。最近的研究表明,HP感染不僅與胃腸道疾病有關(guān),還與缺鐵性貧血、免疫性血小板減少性紫癜、維生素B12缺乏、非酒精性脂肪性肝病、冠狀動脈疾病、代謝綜合征和糖尿病等有關(guān)[29-30].因此,HP感染可導(dǎo)致胃腸道外的全身各種炎癥。HP感染可導(dǎo)致全身產(chǎn)生TNF因子,TNF超家族成員11調(diào)節(jié)多種生理或病理功能,包括破骨細(xì)胞分化和OP[31],TNF-α可誘導(dǎo)獨立于核因子-κB受體活化因子及其配體系統(tǒng)的破骨細(xì)胞分化[32],從而導(dǎo)致OP。肝臟炎癥和骨質(zhì)流失病理生理學(xué)的潛在關(guān)鍵因素之一是TNF-α。幾位獨立研究人員報道了非酒精性脂肪性肝病患者TNF-α水平會增加[33]。HP感染多通過消化系統(tǒng)及全身的炎癥感染影響患者骨代謝變化,從而導(dǎo)致OP。這為合并有HP感染的OP患者的治療提供一個指導(dǎo)方向。在嚴(yán)重OP患者中可進(jìn)行HP感染的篩查,若合并HP感染,抗骨質(zhì)疏松治療的同時可予以抗HP治療,這樣可能比單純的抗OP治療具有更好的效果。目前關(guān)于此種治療方案的臨床報道較少見,值得進(jìn)一步探索。本研究通過對多個基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因信息整合發(fā)現(xiàn)了HP感染和OP的核心交集靶點,同時發(fā)現(xiàn)了炎性反應(yīng)在2種疾病中扮演的角色。HP感染后可導(dǎo)致一系列炎性反應(yīng),而炎性反應(yīng)可產(chǎn)生多種炎癥因子(如TNF、IL1和IL6等),該炎癥作用于多種信號通路,影響骨形成和骨吸收,從而導(dǎo)致OP。因此,對于OP患者或OP合并HP感染患者,積極地治療與控制HP導(dǎo)致的感染及炎癥,可能對控制OP有十分重要的作用。

綜上所述,HP感染多通過導(dǎo)致炎性反應(yīng)產(chǎn)生炎癥因子,從而作用于影響骨吸收及骨形成的信號通路,最終導(dǎo)致或加重OP。本研究初步探討了HP感染與OP之間存在的相同致病基因和密切相關(guān)的信號調(diào)節(jié)途徑,為探索HP感染與OP的治療靶點提供了一定理論參考。本研究存在一定局限性,未對上述疾病靶點基因和信號通路進(jìn)行驗證,需要在今后進(jìn)一步臨床及基礎(chǔ)研究中明確其具體機(jī)制。