楊逸帆， 杜萬威， 王霞， 楊廣德， 李麗， 傅涓涓， 潘修成

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染性疾病科， 江蘇 徐州 221002

肝硬化是多種慢性肝病的共同階段，在我國HBV慢性感染是其主要病因。進(jìn)展期肝硬化或失代償期肝硬化等晚期肝硬化階段往往伴隨突出的免疫功能障礙，被稱為肝硬化相關(guān)免疫障礙（cirrhosis-associated immune dysfunction，CAID）［1］。一方面表現(xiàn)為全身性炎癥反應(yīng)，而另一方面表現(xiàn)為免疫功能低下［2］。

在肝硬化狀態(tài)下，腸源性脂多糖通過Toll樣受體（TLR）4激活單核巨噬細(xì)胞分泌大量炎癥因子被認(rèn)為是系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的主要機制［3-4］。近年研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，微生物或宿主細(xì)胞來源的DNA通過環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）誘導(dǎo)炎癥分子表達(dá)在機體抗感染免疫和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

STING是調(diào)控Ⅰ型IFN基因表達(dá)的重要接頭蛋白。細(xì)胞內(nèi)游離的雙鏈DNA在cGAS作用下，催化合成的環(huán)鳥苷酸-腺苷酸（cyclic GMP-AMP，cGAMP）直接激活STING蛋白，然后通過TANK結(jié)合激酶1（TBK1）介導(dǎo)IFN調(diào)節(jié)因子3核轉(zhuǎn)移進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅰ型IFN表達(dá)以及通過核因子-κB誘導(dǎo)IFN-β、IL-6和TNF-α表達(dá)［7-10］。

筆者前期研究［11-13］發(fā)現(xiàn)肝硬化患者肝組織單核/巨噬細(xì)胞STING表達(dá)明顯升高，這些細(xì)胞的激活導(dǎo)致血清促炎細(xì)胞因子水平增加，包括TNF-α、IL-6、Ⅰ型IFN和IL-17等。然而迄今為止，尚無關(guān)于肝硬化狀態(tài)下CAID與STING通路誘導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答之間關(guān)系的研究報道。本研究擬通過STING信號通路對乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步闡明乙型肝炎肝硬化患者免疫失調(diào)的發(fā)生機制，從而為乙型肝炎肝硬化的免疫治療提供新的思路和靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年5月—10月于本院感染性疾病科住院治療的乙型肝炎肝硬化患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）HBsAg陽性，病程超過6個月；（2）肝硬化病史診斷明確，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年美國肝病學(xué)會的實踐指南［14］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）混合感染HCV、HDV、HIV；（2）合并其他肝臟疾病，包括脂肪性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃耘c血色素沉積；（3）合并任何惡性腫瘤或其他嚴(yán)重慢性疾??；（4）孕婦；（5）無法對患者本人或法定代理人知情告知。另選取同期本院體檢中心健康體檢者作為對照。

1.2 材料 人外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒（Solarbio，中國），IFN-α、IFN-β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（Elabsience，中國），2′，3′-cGAMP（Invitrogen，法國），STING抑制劑CCCP（Selleck，美國），Phagotest單核細(xì)胞吞噬活性定量測定試劑盒（Glycotope Biotechnology GmbH，德國）。

1.3 主要方法

1.3.1 外周血單核細(xì)胞的分離純化 分別采集乙型肝炎肝硬化患者和健康體檢者外周靜脈血，使用外周血單核細(xì)胞分離液試劑提取其單核細(xì)胞，重懸細(xì)胞后用單核細(xì)胞培養(yǎng)基以106個/mL的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于細(xì)胞板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)2～4 h。除去細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入含有2% EDTA和2%FBS的PBS，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2～3 min，鏡下看到貼壁細(xì)胞形狀變圓后加入含10% FBS的RPMI1640終止消化，常溫離心細(xì)胞后重懸單核細(xì)胞。

1.3.2 單核細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細(xì)胞分為Control組、cGAMP組和cGAMP+CCCP組，Control組細(xì)胞加入等量的PBS后將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；后兩組細(xì)胞加入cGAMP（1 μg/mL），其中cGAMP+CCCP組于培養(yǎng)1 h后加入CCCP（l μmol/L）。留取培養(yǎng)上清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 ELISA法檢測細(xì)胞因子 根據(jù)ELISA試劑盒說明書分別檢測研究對象細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α水平。

1.3.4 單核細(xì)胞吞噬實驗 采集乙型肝炎肝硬化患者與健康體檢者外周靜脈血3 mL，分為Control、cGAMP、cGAMP+CCCP三組，分別加入PBS（1 μg/mL）、cGAMP（1 μg/mL）、cGAMP（1 μg/mL）+ CCCP（l μmol/L）（培養(yǎng)1 h后加入CCCP）室溫靜置12 h。將熒光標(biāo)記E.coli加入以上各組共同孵育。實驗嚴(yán)格按照Phagotest試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作。經(jīng)處理后的樣本使用流式細(xì)胞儀分析單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統(tǒng)計圖。計量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入乙型肝炎肝硬化患者35例（乙型肝炎肝硬化組），其中男19例，女16例，平均年齡（41.43±8.60）歲。納入健康體檢者10例（健康組），其中男6例，女4例，平均年齡（45.52±11.15）歲。兩組研究對象在年齡、性別方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。

2.2 cGAMP誘導(dǎo)乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細(xì)胞炎癥因子的分泌 乙型肝炎肝硬化組外周血單核細(xì)胞接受cGAMP刺激后所分泌的IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α均顯著高于健康組（P值均＜0.05）（表1）。此外，cGAMP組IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α水平均明顯高于cGAMP+CCCP組和Control組（P值均＜0.05），而cGAMP+CCCP組與Control組比較，各炎癥因子水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）（表2）。

表1 cGAMP作用下乙型肝炎肝硬化患者和健康成人外周血單核細(xì)胞炎癥因子分泌水平比較Table 1 Comparison of inflammatory factor secretion levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with hepatitis B cirrhosis and healthy adults under the effect of cGAMP

表2 cGAMP作用下乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細(xì)胞炎癥因子分泌水平Table 2 Inflammatory factor secretion levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with hepatitis B cirrhosis under the influence of cGAMP

2.3 cGAMP刺激人外周血單核細(xì)胞后的吞噬殺菌能力 乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細(xì)胞在有或無cGAMP /cGAMP+CCCP處理下，吞噬細(xì)菌能力均較健康組顯著降低（t值分別為4.647、2.790、2.504，P值均＜0.05）（圖1）。而cGAMP或cGAMP+CCCP處理對乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力均無明顯影響（P值均＞0.05）（圖2）。

圖1 不同處理情況下乙型肝炎肝硬化組和健康組外周血單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力比較Figure 1 Phagocytic ability of peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis B cirrhosis and healthy people under different treatments

圖2 不同處理情況下乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力比較Figure 2 Phagocytic ability of peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis B cirrhosis under different treatments

3 討論

有研究［15-16］報道，從肝硬化特別是失代償期肝硬化患者外周血循環(huán)中檢測出DNA分子，主要來自于細(xì)菌或宿主細(xì)胞的裂解。因此理論上，肝硬化患者外周血單核細(xì)胞STING通路應(yīng)該受到影響。筆者在前期的工作中發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者外周血單核細(xì)胞STING蛋白表達(dá)較健康體檢者顯著升高，推測在肝硬化狀態(tài)下，外周血單核細(xì)胞STING通路可能參與全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生機制。

本研究以cGAMP刺激外周血單核細(xì)胞STING通路，結(jié)果顯示肝硬化患者外周血單核細(xì)胞分泌IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α水平均顯著高于健康組和Control組，進(jìn)一步證實肝硬化狀態(tài)下外周血單核細(xì)胞STING通路處于高度活化狀態(tài)，對肝硬化狀態(tài)下全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生可能發(fā)揮了重要作用。同時，在STING通路被特異性抑制劑CCCP阻斷后，本研究發(fā)現(xiàn)IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α四種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平與cGAMP組相比均顯著下降，并且與Control組無顯著差異。提示可以通過特異性阻斷STING通路，進(jìn)而減輕肝硬化狀態(tài)下的全身炎癥反應(yīng)，這為今后晚期肝病全身炎癥反應(yīng)綜合征的治療提供了新的選擇。

進(jìn)展期肝硬化尤其是失代償期肝硬化為主的晚期肝病，往往伴隨CAID的出現(xiàn)［17-18］，一方面表現(xiàn)為全身性炎癥反應(yīng)，另一方面表現(xiàn)為固有免疫和適應(yīng)性免疫功能的低下或缺陷，增加了感染風(fēng)險。其中固有免疫功能低下，主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力下降［19］，其確切機制尚未完全清楚。Ashare等［20］研究證實了慢性肝病患者循環(huán)系統(tǒng)中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞的細(xì)菌清除功能受損。此外，肝硬化狀態(tài)下肝組織炎癥微環(huán)境和外周炎癥反應(yīng)狀態(tài)影響了吞噬細(xì)胞殺菌能力。為進(jìn)一步研究STING通路活化是否會影響肝硬化患者單核細(xì)胞的吞噬功能，本研究檢測了肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的吞噬細(xì)菌能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力較健康成人顯著降低，與Bernsmeier等［21］研究結(jié)果一致，而STING通路激活或抑制對單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌功能無顯著影響，提示肝硬化狀態(tài)下外周血單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌功能低下，但是STING通路的激活與否對其無明顯影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，外周血單核細(xì)胞STING通路的活化參與了乙型肝炎肝硬化狀態(tài)下全身性炎癥反應(yīng)的發(fā)生機制，并可能發(fā)揮重要作用，這為乙型肝炎肝硬化患者免疫紊亂狀態(tài)的診斷和免疫治療提供了新的靶點。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020年7月2日經(jīng)由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號XYFY2020-KL075-01，入組患者均采取自愿原則，并簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊逸帆、杜萬威、潘修成負(fù)責(zé)課題設(shè)計；楊逸帆、杜萬威、李麗負(fù)責(zé)實驗操作，資料分析和撰寫論文；楊逸帆、李麗、王霞、楊廣德、傅涓涓參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；潘修成負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。