劉芳，徐夢貝，王巧玲，孟倩，李桂名，張宏菊，田惠丹，徐凡，羅明

棉花纖維優(yōu)勢表達(dá)基因啟動(dòng)子的克隆和功能分析

劉芳，徐夢貝，王巧玲，孟倩，李桂名，張宏菊，田惠丹，徐凡，羅明

西南大學(xué)生物技術(shù)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物技術(shù)與作物品質(zhì)改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716

【目的】棉花纖維是棉花的主要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，是由胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)極性伸長和次生壁加厚而成的單細(xì)胞。棉花纖維細(xì)胞是最長的植物細(xì)胞之一，是研究植物細(xì)胞生長發(fā)育的理想材料。鑒定纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子可為纖維發(fā)育的基礎(chǔ)研究提供控制目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控序列，為改良纖維性狀的分子育種提供依據(jù)?！痉椒ā靠寺±w維細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)基因的啟動(dòng)子，通過啟動(dòng)子序列分析網(wǎng)站PlantCARE分析克隆序列中包含的重要順式調(diào)控元件。根據(jù)部分重要順式調(diào)控元件的分布，對克隆啟動(dòng)子片段進(jìn)行5′-端刪除，共獲得4個(gè)啟動(dòng)子片段，并構(gòu)建了相應(yīng)的植物表達(dá)載體。利用構(gòu)建的植物表達(dá)載體進(jìn)行煙草和棉花的遺傳轉(zhuǎn)化，通過轉(zhuǎn)基因煙草和棉花的分子鑒定明確轉(zhuǎn)基因植株。并檢測轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官、纖維細(xì)胞不同發(fā)育時(shí)期的GUS活性?！窘Y(jié)果】克隆獲得最長啟動(dòng)子片段為2 900 bp，除了包含多個(gè)啟動(dòng)子必備轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件外，還包含多個(gè)脫落酸響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、油菜素內(nèi)酯響應(yīng)元件、種子特異調(diào)控元件、脅迫響應(yīng)元件和MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。通過5′-端刪除獲得長度分別為2 900（）、2 178（）、1 657（）和1 232 bp（）4個(gè)啟動(dòng)子片段，經(jīng)分子鑒定，獲得4個(gè)片段的轉(zhuǎn)基因煙草，在轉(zhuǎn)基因煙草中，、和不表達(dá)，而廣泛表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度與CaMV 35S啟動(dòng)子相似。和差異序列中包含4個(gè)脫落酸響應(yīng)元件、2個(gè)油菜素內(nèi)酯響應(yīng)元件和3個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)，這些順式調(diào)控元件可能與、和在轉(zhuǎn)基因煙草中不表達(dá)有一定關(guān)系。經(jīng)分子鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因棉花。在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中優(yōu)勢表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因花粉中有較低的表達(dá)，在其他組織器官中幾乎不表達(dá)。在纖維細(xì)胞的生長發(fā)育過程中，在纖維細(xì)胞早期生長階段（5 DPA）表達(dá)較低，在纖維細(xì)胞伸長期（10—15 DPA）表達(dá)水平相對較高，在纖維細(xì)胞次生壁合成期（20—30 DPA）表達(dá)水平有所降低。【結(jié)論】啟動(dòng)子是一個(gè)廣泛表達(dá)啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是一個(gè)纖維細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子，在纖維細(xì)胞伸長期表達(dá)量相對較高。可應(yīng)用于棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的功能研究和改良纖維性狀的分子育種。

棉花；啟動(dòng)子；功能分析；；鞘脂delta8-去飽和酶

0 引言

【研究意義】棉花是世界上最重要的天然纖維作物，中國是棉花生產(chǎn)和消費(fèi)大國，棉花生產(chǎn)在中國國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。傳統(tǒng)的育種方法曾在棉花品種改良上取得較大的成功，但近年來，改良棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的育種進(jìn)入平臺期。利用現(xiàn)有的遺傳資源和傳統(tǒng)育種手段難以再大幅度提高棉花產(chǎn)量?；蚬こ谭椒ň哂泻蟠子诜€(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點(diǎn)，可以打破物種間的遺傳障礙，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移，是改良棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的有效途徑。但基因工程在作物改良中的作用發(fā)揮取決于3個(gè)方面的進(jìn)展程度：目標(biāo)基因的功能、調(diào)控目標(biāo)性狀形成的分子機(jī)理和控制目標(biāo)基因在特定部位和特定時(shí)間表達(dá)的特異啟動(dòng)子。在棉花纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的基因工程改良中，常常需要在纖維細(xì)胞中超量或抑制一些基因的表達(dá)，來達(dá)到提高產(chǎn)量或改良品質(zhì)的目的。在棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)理研究中，也需要纖維細(xì)胞特異表達(dá)啟動(dòng)子來上調(diào)或下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，進(jìn)而分析其在纖維細(xì)胞中的功能。最大限度地減少目標(biāo)基因?qū)ζ渌M織和器官的不良影響。因此，棉花纖維特異或優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子的克隆和功能分析，對棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因功能研究和棉花纖維改良的基因工程具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】啟動(dòng)子是一段能被RNA聚合酶識別并結(jié)合的，位于結(jié)構(gòu)基因5′上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶并指導(dǎo)相應(yīng)類型的RNA聚合酶與模板的正確結(jié)合，決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間、空間和表達(dá)的強(qiáng)度。最早在棉花中克隆和功能分析的啟動(dòng)子是的啟動(dòng)子，的2.5 kb啟動(dòng)子序列能夠指導(dǎo)報(bào)告基因在5—28 DPA（day post anthesis）的纖維中表達(dá)，在15—22 DPA表達(dá)量最高，而在其他組織中不表達(dá)[1-2]。說明啟動(dòng)子是纖維發(fā)育早期特異表達(dá)的啟動(dòng)子。隨后，于曉紅等[3]從亞洲棉中克隆了纖維特異表達(dá)基因的5′端約1.5 kb的上游序列，通過轉(zhuǎn)基因煙草證明該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在煙草的根、莖、葉、表皮毛及維管組織中表達(dá)，說明該啟動(dòng)子不具備纖維細(xì)胞特異表達(dá)特性。吳靄民等[4]進(jìn)一步驗(yàn)證了614 bp啟動(dòng)子的功能，發(fā)現(xiàn)只在煙草葉片的表皮毛中檢測到報(bào)告基因表達(dá)，推測614 bp的啟動(dòng)子序列已足夠驅(qū)動(dòng)基因在棉花纖維中特異表達(dá)。Rinehart等[5]克隆了纖維發(fā)育中后期特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子并進(jìn)行了5′刪除試驗(yàn)。瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明，的5′端2.3 kb片段已經(jīng)具備啟動(dòng)子活性，其表達(dá)活性約為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV 35S啟動(dòng)子的1/3，是早期特異表達(dá)的啟動(dòng)子的3倍。3個(gè)脂轉(zhuǎn)移蛋白基因（、和）在纖維伸長期特異表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因煙草分析其啟動(dòng)子活性，結(jié)果顯示，報(bào)告基因僅在煙草表皮毛中表達(dá)。啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性較弱，僅為CaMV 35S啟動(dòng)子的1/1000左右。啟動(dòng)子的活性強(qiáng)于啟動(dòng)子[6-10]。棉花纖維素合成酶4亞基基因（）在纖維次生壁沉積起始期和沉積期表達(dá)。該基因2.6 kb啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)報(bào)告基因在纖維細(xì)胞次生壁合成期表達(dá)[11-12]。棉花肌動(dòng)蛋白基因（）0.8 kb啟動(dòng)子序列能夠指導(dǎo)報(bào)告基因在纖維中高量表達(dá)[13]。2個(gè)的啟動(dòng)子（1 679 bp）和（1 285 bp）能驅(qū)動(dòng)在纖維細(xì)胞中高量表達(dá)[14]。啟動(dòng)子（1 000 bp）僅在轉(zhuǎn)基因棉花苞葉和花藥中表達(dá)[15]。（seed coat and fiber protease）啟動(dòng)子（1 006 bp）指導(dǎo)報(bào)告基因在纖維細(xì)胞中特異表達(dá)，是一個(gè)纖維細(xì)胞發(fā)育早期的特異啟動(dòng)子[16]。啟動(dòng)子在棉花纖維發(fā)育過程中優(yōu)勢表達(dá)，且表達(dá)活性較高，該啟動(dòng)子活性受赤霉素誘導(dǎo)和脫落酸抑制[17]。是一個(gè)纖維伸長期優(yōu)勢表達(dá)基因，其啟動(dòng)子（961 bp）指導(dǎo)在0—20 DPA纖維以及柱頭、雄蕊、萼片、胚根、子葉和根中表達(dá)[18]。這些研究結(jié)果為解析目標(biāo)基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供了重要數(shù)據(jù)，也為改良纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的分子設(shè)計(jì)提供更多可選擇的調(diào)控序列。但迄今為止，可選擇的纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢表達(dá)的啟動(dòng)子還十分有限。【本研究切入點(diǎn)】棉花纖維細(xì)胞中特異/優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但由于棉花遺傳轉(zhuǎn)化比較困難，多數(shù)在纖維細(xì)胞中特異/優(yōu)勢表達(dá)基因的啟動(dòng)子還沒有通過轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行功能鑒定。部分啟動(dòng)子通過轉(zhuǎn)基因擬南芥或煙草進(jìn)行了功能鑒定，但僅是間接地揭示了目標(biāo)啟動(dòng)子的功能。同時(shí)，由于纖維細(xì)胞的生長發(fā)育包含纖維細(xì)胞起始、伸長和次生壁沉積等不同發(fā)育過程，不同時(shí)空和不同表達(dá)效率的啟動(dòng)子還十分缺乏。鞘脂（sphingolipid）在棉花纖維細(xì)胞生長發(fā)育中具有重要作用，但不同的鞘脂分子在棉花不同組織、器官和細(xì)胞中的積累差異較大[19-21]。與此相對應(yīng)，參與鞘脂分子修飾的鞘脂合成酶基因的表達(dá)也具有明顯的組織器官特異性。鞘脂delta8-去飽和酶（GhSLD1）介導(dǎo)LCB（long chain base）鏈C-8的去飽和反應(yīng)，在棉花纖維細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過克隆啟動(dòng)子序列和構(gòu)建不同長度啟動(dòng)子（5′-刪除）植物表達(dá)載體，利用轉(zhuǎn)基因煙草和棉花，分析啟動(dòng)子的功能，證明具有纖維細(xì)胞表達(dá)特異性，為棉花纖維發(fā)育基礎(chǔ)研究和現(xiàn)代育種分子設(shè)計(jì)提供新的纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花遺傳轉(zhuǎn)化受體材料為棉花品種冀棉14（J14），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬峙英教授所贈(zèng)，西南大學(xué)生物技術(shù)中心保存。煙草遺傳轉(zhuǎn)化受體為cv.xanthi，由西南大學(xué)生物技術(shù)中心保存。

1.2 克隆GhSLD1的啟動(dòng)子序列

位于陸地棉D(zhuǎn)亞基因組（），利用的cDNA序列，搜索已公布的棉花D-亞基因組序列（http://www.phytozome.net）。獲得的5′-上游調(diào)控序列，進(jìn)而在ATG上游約3.0 kb處設(shè)計(jì)特異引物-up（5′-ATTCTCCACC ACATGCAAACC-3′）和在近ATG位點(diǎn)處設(shè)計(jì)特異引物-down（5′-GGCTTGATCATGTCTAG ACTC-3′），以冀棉14基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收，與克隆載體pMD19（TaKaRa，中國大連）連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證和測序，獲得擴(kuò)增片段長度為2 900 bp，并命名為。采用PlantCare數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析啟動(dòng)子順式調(diào)控元件。為了進(jìn)行啟動(dòng)子5′-端刪除試驗(yàn)，根據(jù)啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析結(jié)果，分別設(shè)計(jì)特異引物（-up：5′- cctaaagcaaccacatgcttc-3′，-up：5′-catcacgtgacatccttctct-3′，-up：5′-ttaggtgatgaatggcacgac-3′）。以為模板進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得2178 bp、1 657 bp和1 232 bp。

1.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建

用dⅢ和Ⅰ內(nèi)切酶從pMD19--—載體上酶切不同長度的啟動(dòng)子片段，與經(jīng)dⅢ和Ⅰ雙酶切的pBI121載體片段連接，從而使啟動(dòng)子片段置換了pBI121載體中的CaMV35S啟動(dòng)子。通過酶切驗(yàn)證，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121--—::GUS。

1.4 棉花的遺傳轉(zhuǎn)化

參照LUO等[22]棉花遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化。取50顆剝?nèi)ネ鈿さ募矫?4種子，放入一個(gè)三角瓶中，先用75%乙醇滅菌1 min，再用3%過氧化氫滅菌10 min，滅菌期間用手不斷搖晃三角瓶；用無菌水沖洗8—10次，直至將泡沫洗凈；在三角瓶中加入約50 mL無菌水，置于搖床，早晚各換一次無菌水；1 d之后就可以選擇長出根的種子，并將其插入種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，于26 ℃暗培養(yǎng)1—2 d，選擇適宜的下胚軸進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。將棉花下胚軸切成小段，放入制備好的農(nóng)桿菌菌液，于26 ℃ 90 r/min浸染40—60 min；侵染后的下胚軸段轉(zhuǎn)移到棉花共培養(yǎng)基上，于26 ℃暗培養(yǎng)2 d之后，將其轉(zhuǎn)移到下胚段篩選培養(yǎng)基中，15 d后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基直到大量長出愈傷組織；將其轉(zhuǎn)移到棉花胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；當(dāng)大量出現(xiàn)胚性愈傷時(shí)，可進(jìn)行胚性愈傷懸浮培養(yǎng)，于26 ℃ 120 r/min搖床培養(yǎng)15 d左右；將體胚鋪于體胚伸長培養(yǎng)基上，體胚轉(zhuǎn)入體胚伸長培養(yǎng)基；待體胚伸長到1—2 cm后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上（繼代培養(yǎng)基、胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基每隔15 d繼代一次）。抗性幼苗在培養(yǎng)基中長大后，栽種于溫室培養(yǎng)缽。

1.5 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。取煙草種子用1%次氯酸鈉滅菌，再用無菌水沖洗5—8次，三角瓶中加入約50 mL無菌水，置于搖床培養(yǎng)2 d后種子至露白，然后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基，約1個(gè)月可取葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在無菌條件下將葉片除去主葉脈，切成0.5 cm2大小的葉片，轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的菌液中，于26 ℃ 90 r/min搖床浸染30—50 min，將浸染后的葉片轉(zhuǎn)移到煙草共培養(yǎng)基上，于26 ℃暗培養(yǎng)2 d后，將其轉(zhuǎn)移到煙草篩選培養(yǎng)基中，10 d后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基直到大量長出不定芽，將其切取轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中。幼苗長大后栽種于溫室培養(yǎng)缽。

1.6 植物gDNA的提取

依據(jù)北京艾德來生物科技公司的新型植物基因組DNA（gDNA）快速提取試劑盒操作說明書提取植物基因組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 棉花RNA的提取

選取新鮮棉花材料（根、莖、葉、花、開花后0 d的胚珠和纖維至開花后6 d的胚珠和纖維、開花后6 d的纖維至開花后20 d的纖維、開花后6 d的胚珠至開花后20 d的胚珠），利用北京艾德來（Aidlab，中國）生物科技公司的EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（貨號：RN09）提取各個(gè)樣品的總RNA，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.8 基因表達(dá)分析

將上述RNA合成cDNA（TakaRa），-20 ℃保存。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增分析的表達(dá)水平。反應(yīng)體系包括10 μL擴(kuò)增混合緩沖液（試劑盒提供）、5′-端和3′-端引物各1 μL（5 μmol·L-1）、1 μL cDNA，去離子水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用棉花作內(nèi)參基因，引物為（5′-ATGCCCAAGGACATCCAGTTG-3′）和（5′-CCTACCACTACCATCATGGCT-3′）。的引物為-1（5′-GATACAGAGTGG TTGGATAGG-3′）和-2（5′-GATCCTAGCAA AGCACATGAC-3′）。

1.9 轉(zhuǎn)基因煙草和棉花的分子鑒定

提取轉(zhuǎn)基因煙草和棉花抗性苗基因組DNA，以特異引物-up、-up、-up和-up分別和結(jié)合5′-端的3′引物-down（5′-ATCGAAACGCAGCACGATACG-3′）擴(kuò)增抗性煙草或棉花基因組DNA，電泳檢測。

1.10 轉(zhuǎn)基因棉花中GUS活性的檢測

隨機(jī)選取5株P(guān)CR陽性轉(zhuǎn)基因棉花植株進(jìn)行全面的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）活性檢測。樣品中加適量植物組織GUS染液，37 ℃避光處理1 h，每隔一定時(shí)間更換一次75%酒精進(jìn)行脫色。脫色完全后，在體視鏡下拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 GhSLD1的表達(dá)分析

為了分析鞘脂在棉花纖維細(xì)胞生長發(fā)育中的功能，從陸地棉中克隆了擬南芥鞘脂delta8-去飽和酶（SLD）基因的同源基因。首先檢測了該基因在棉花不同組織器官和纖維胚珠不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性（圖1）。結(jié)果顯示，主要在纖維細(xì)胞中表達(dá)，在胚珠早期發(fā)育階段（6—12 DPA）有較低的表達(dá)，在根、莖、葉、花以及開花當(dāng)天胚珠和14—20 DPA胚珠中幾乎檢測不到表達(dá)信號。在不同發(fā)育時(shí)期的纖維細(xì)胞中，該基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)8 DPA和10 DPA，隨后，表達(dá)水平快速降低。在14—20 DPA纖維細(xì)胞中維持較低的表達(dá)水平。說明是一個(gè)纖維細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)基因，在纖維細(xì)胞不同發(fā)育時(shí)期，該基因的表達(dá)水平有明顯差異，在纖維細(xì)胞快速伸長期的表達(dá)水平最高。

圖1 GhSLD1在棉花不同器官和不同發(fā)育時(shí)期纖維胚珠中的表達(dá)特征

2.2 GhSLD1啟動(dòng)子的克隆和序列分析

基因的啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的主要元件，棉花纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢表達(dá)調(diào)控序列是棉花纖維發(fā)育研究和現(xiàn)代分子設(shè)計(jì)育種的重要序列。是一個(gè)在纖維細(xì)胞快速伸長期優(yōu)勢表達(dá)的基因，為了深入研究的表達(dá)特性和調(diào)控機(jī)制以及獲得纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢表達(dá)的調(diào)控序列，首先克隆的啟動(dòng)子并對克隆序列進(jìn)行了分析。以（3）的5′-上游序列為參考，設(shè)計(jì)特異引物，從陸地棉（冀棉14）基因組中克隆獲得約3 000 bp的片段（圖2），通過克隆測序顯示擴(kuò)增片段長2 900 bp。將該序列導(dǎo)入PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/）進(jìn)行順式調(diào)控元件分析（表1），結(jié)果顯示，序列中除具有一般啟動(dòng)子所具有的大量TATA框和CAAT框，以及較多的光反應(yīng)元件外，還具有許多特異性響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件（CACGTG/ ACGTG）、厭氧響應(yīng)元件（AAACCA）、油菜素內(nèi)酯響應(yīng)元件（CANNTG）、茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA）、MYB結(jié)合位點(diǎn)（AACCTAA/TAACCA/CAACCA/ TAACTG），防御與脅迫響應(yīng)元件（ATTCTCTAAC）等（表1）。說明的表達(dá)受到多種因子的調(diào)控。

M：DNA marker；GhSLD1-P1：GhSLD1的啟動(dòng)子P1

表1 GhSLD1-P1啟動(dòng)子序列中的順式調(diào)控元件

2.3 啟動(dòng)子功能分析及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為了尋找啟動(dòng)子的核心區(qū)段，根據(jù)重要調(diào)控元件的分布，進(jìn)行5′-刪除試驗(yàn)。共獲得4個(gè)片段，長度分別為2 900（）、2 178（）、1 657（）和1 232 bp（），分別構(gòu)建啟動(dòng)子植物表達(dá)載體（圖3）。由于許多研究者認(rèn)為棉花纖維細(xì)胞的生長發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制與植物表皮毛相似[23-26]，為了探究啟動(dòng)子各區(qū)段的功能，將構(gòu)建的表達(dá)載體先進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。

LB：T-DNA區(qū)段左邊界；RB：T-DNA區(qū)段右邊界；NPTII：卡那霉素抗性基因；GUS：b-葡萄糖酸苷酶基因（報(bào)告基因）；Ter：終止子；CaMV 35S：花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子

2.4 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定

利用構(gòu)建的植物表達(dá)載體進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。待抗性再生苗移栽成活后，提取再生苗基因組DNA，利用特異引物-up、-up、-up和-up分別和結(jié)合5′-端的3′引物GUS-down擴(kuò)增煙草基因組DNA（圖4）。結(jié)果表明，各個(gè)植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草都擴(kuò)增出特異條帶，該擴(kuò)增帶與各自載體質(zhì)粒的擴(kuò)增帶大小一致，而以非轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板的陰性對照和以水為模板的空白對照沒有任何特異擴(kuò)增產(chǎn)物。表明包含不同啟動(dòng)子長度的T-DNA區(qū)段整合到煙草基因組DNA中，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。

2.5 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草GUS活性分析

為了明確不同長度的啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)模式，對不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草的根、莖、葉、花等不同部位進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色（圖5）。結(jié)果表明，在、和轉(zhuǎn)基因煙草的各部位均未檢測到GUS活性。在轉(zhuǎn)基因煙草各部位均檢測到GUS活性，包括葉片和莖的表皮毛中也具有較強(qiáng)的GUS信號。說明1 232 bp的啟動(dòng)子序列具有啟動(dòng)子的必要元件，可以控制基因的表達(dá)，但不具有表達(dá)特異性。-2 900— -1 232 bp序列中可能具有調(diào)控特異性表達(dá)的元件。由于也沒有GUS染色信號，進(jìn)一步分析了-1 657—-1 232 bp間的序列特征，該序列包含4個(gè)脫落酸響應(yīng)元件（G-box，ACGTG），同時(shí)與2個(gè)油菜素內(nèi)酯響應(yīng)元件（E-box，CANNTG）重疊；包含3個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)（AACCTAA、CAACCA和TAACCA），這些順式調(diào)控元件可能與、和在轉(zhuǎn)基因煙草中沒有明顯GUS信號有一定關(guān)系。特別是全長啟動(dòng)子中共有4個(gè)脫落酸響應(yīng)元件（表1），都集中在這段序列中，而中沒有脫落酸響應(yīng)元件，推測該元件與表達(dá)特性有密切關(guān)系。

A：GhSLD1-P1轉(zhuǎn)基因煙草；B：GhSLD1-P2轉(zhuǎn)基因煙草；C：GhSLD1-P3轉(zhuǎn)基因煙草；D：GhSLD1-P4轉(zhuǎn)基因煙草。M：DNA Marker；+：陽性對照，以對應(yīng)片段的啟動(dòng)子表達(dá)載體質(zhì)粒為擴(kuò)增模板；-：陰性對照，以野生型煙草gDNA為擴(kuò)增模板；H2O：空白對照，以水為PCR擴(kuò)增模板；1—4：對應(yīng)片段的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草植株

CaMV 35S：組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S轉(zhuǎn)基因煙草；GhSLD1-P1— GhSLD1-P4：分別為GhSLD1-P1、GhSLD1-P2、GhSLD1-P3和GhSLD1-P4轉(zhuǎn)基因煙草。A：柱頭，B：雄蕊，C：葉片，D：葉柄橫切，E：莖橫切，F(xiàn)：莖縱切，G：花瓣，H：開花當(dāng)天的子房，I：根

2.6 轉(zhuǎn)基因棉花的鑒定

結(jié)合前面的轉(zhuǎn)基因煙草GUS活性的結(jié)果，將對進(jìn)行進(jìn)一步探索。利用不同長度啟動(dòng)子控制的植物表達(dá)載體和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化，獲得的卡那（kan）抗性再生苗。進(jìn)一步提取再生苗基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增引物分別結(jié)合于的5′序列和5′-端序列（圖6）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花植株中能夠擴(kuò)增出一條與陽性對照一致的帶，而陰性對照和空白對照均無任何擴(kuò)增帶。說明植物表達(dá)載體的T-DNA區(qū)段整合到了棉花基因組中。

M：DNA Marker；+：陽性對照（以GhSLD1-P2植物表達(dá)載體質(zhì)粒為模板）；C：陰性對照（以野生型基因組DNA為模板）；W：空白對照（以水為模板）；1—4：轉(zhuǎn)基因棉花株系1—4

2.7 轉(zhuǎn)基因棉花中GUS活性分析

為了分析轉(zhuǎn)基因棉花中GUS活性，對不同組織器官和纖維細(xì)胞發(fā)育不同時(shí)期進(jìn)行組織化學(xué)分析，并以組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV 35S控制的轉(zhuǎn)基因棉花為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因棉花為陰性對照（圖7—圖9）。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因棉花植株的根、莖、葉中均未檢測到GUS信號，在開花當(dāng)天（0 DPA）也未檢測到GUS信號，僅在花粉中有較弱GUS信號（圖7和圖8）。為了明確啟動(dòng)子在不同發(fā)育時(shí)期的纖維細(xì)胞中的表達(dá)特性，檢測5、10、15、20、25和30 DPA纖維細(xì)胞中GUS信號（圖9）。結(jié)果顯示，纖維細(xì)胞中有較強(qiáng)的GUS信號，相對而言，5 DPA中的信號較弱，10和15 DPA中的GUS信號最強(qiáng)，隨后GUS信號有所降低。說明主要在纖維細(xì)胞中表達(dá)，其次在花粉中有較低水平表達(dá)，是一個(gè)纖維細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子，而且在纖維細(xì)胞伸長期表達(dá)水平最高。

3 討論

3.1 GhSLD1-P2啟動(dòng)子在棉花纖維基礎(chǔ)研究和分子育種中有重要應(yīng)用

啟動(dòng)子是基因組中控制基因表達(dá)的主要序列。分析目標(biāo)基因啟動(dòng)子的功能不僅有助于解析目標(biāo)基因的表達(dá)特性和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，而且能夠獲得具有特殊時(shí)空表達(dá)特性的啟動(dòng)子。在基因功能研究和改良作物性狀的分子設(shè)計(jì)中具有重要作用。傳統(tǒng)基因工程中常使用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV 35S，但過度的表達(dá)水平和不適的表達(dá)時(shí)空常常帶來副作用，即使改良了目標(biāo)性狀，也嚴(yán)重干擾了其他生產(chǎn)性狀。因此，啟動(dòng)子的功能鑒定是作物分子生物學(xué)的重要方面。

Non-T：陰性對照，非轉(zhuǎn)基因棉花；8DP2-GUS：pBI121-GhSLD1-P2::GUS載體轉(zhuǎn)基因棉花；35S-GUS：陽性對照，pBI121-CaMV35S::GUS載體轉(zhuǎn)基因棉花。下同

圖8 轉(zhuǎn)基因棉花花器官中的GUS活性檢測

5—30 DPA：開花后5—30 d的胚珠和纖維細(xì)胞 5-30 DPA: The ovules and fiber cells at 5-30 day post anthesis

棉花纖維是棉花的主要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，是由胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)極性伸長和次生壁加厚而成的單細(xì)胞纖維。纖維細(xì)胞的生長發(fā)育包含起始、伸長、次生壁沉積和脫水成熟4個(gè)階段，具有一個(gè)植物細(xì)胞生長和衰老的全過程。纖維細(xì)胞中的基因表達(dá)和物質(zhì)代謝具有相對獨(dú)立的體系。因此，研究纖維發(fā)育相關(guān)基因的功能和調(diào)控機(jī)制迫切需要纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子，以控制目標(biāo)基因在纖維細(xì)胞中表達(dá)而不影響或少影響棉花植株的生長發(fā)育；同時(shí)，也使轉(zhuǎn)基因材料更具有可用性。如利用種皮特異啟動(dòng)子控制生長素合成酶基因iaaM能夠促進(jìn)纖維細(xì)胞起始[27]。利用CaMV 35S控制棉花類固醇5α-還原酶基因（）難以獲得正常生長的轉(zhuǎn)基因棉花，而利用FBP7控制能夠獲得生長正常的轉(zhuǎn)基因棉花，且能夠促進(jìn)纖維細(xì)胞的起始和伸長[22]。本研究中，啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因棉花纖維細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)，且在纖維細(xì)胞伸長期（10—15 DPA）的表達(dá)水平相對較高；同時(shí)，與CaMV 35S相比，該啟動(dòng)子的總體表達(dá)水平較低。這些表達(dá)特性更有利于在纖維細(xì)胞中適時(shí)適量地調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)變化。

3.2 GhSLD1啟動(dòng)子中脫落酸響應(yīng)元件可能對表達(dá)具有重要影響

由于許多研究者認(rèn)為纖維細(xì)胞的生長發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制與植物表皮毛相似[28-29]。因此，多個(gè)棉花纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢表達(dá)基因啟動(dòng)子的功能分析都在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥中進(jìn)行。（棉花可逆糖基化多肽基因）啟動(dòng)子能在轉(zhuǎn)基因煙草根中表達(dá)[30]，（棉花葡糖醛基因）可在轉(zhuǎn)基因煙草種皮、花粉、表皮毛和根冠中表達(dá)[31]，啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)在轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛中優(yōu)勢表達(dá)[18]。（棉花纖維素合成酶基因）啟動(dòng)子在煙草表皮毛和葉脈以及下胚軸和莖的維管組織中表達(dá)[11]。啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥的表皮毛中特異表達(dá)[32]。這些研究說明模式植物煙草和擬南芥分析棉花基因啟動(dòng)子的功能具有一定的可行性。本研究中，4個(gè)不同長度的的啟動(dòng)子載體都進(jìn)行了煙草的遺傳轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)基因植株。其中3個(gè)較長的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中不表達(dá)，而最短的啟動(dòng)子（）在轉(zhuǎn)基因煙草的各個(gè)檢測樣品中均表達(dá)，而且表達(dá)強(qiáng)度與CaMV 35S相似。說明具備啟動(dòng)子表達(dá)的基本元件，但不含有組織器官特異表達(dá)元件。在-2 900—-1 232 bp序列中可能存在控制在纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢表達(dá)的元件。由于（1 657 bp）無表達(dá)，而（1 232 bp）能夠表達(dá)，說明-1 657—-1 232 bp的425 bp序列可能具有重要的作用。為此分析了這段序列中的順式調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)這段序列中包含4個(gè)脫落酸響應(yīng)元件，其中2個(gè)元件與油菜素內(nèi)酯響應(yīng)元件重疊，以及3個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)。有趣的是：全長啟動(dòng)子序列（2 900 bp）中也只有4個(gè)脫落酸響應(yīng)元件，說明這個(gè)啟動(dòng)子的脫落酸響應(yīng)元件就集中在這段序列中。3個(gè)有這段序列的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中無表達(dá)，缺失這段序列的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中有表達(dá)，推測這段序列可能與該啟動(dòng)子的表達(dá)特性有密切關(guān)系。下一步可能針對這段序列進(jìn)行深入研究。（2 178 bp）在轉(zhuǎn)基因棉花的非纖維部分與煙草相似，也無表達(dá)信號；但在纖維細(xì)胞中有明顯的表達(dá)信號。由此推測：抑制啟動(dòng)子在非纖維的組織器官中表達(dá)的元件可能存在于-2 178—-1 232 bp。下一步研究將對這段啟動(dòng)子序列進(jìn)行更加密集的5′-端刪除，可望找到控制基因在纖維細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)的核心序列。

4 結(jié)論

（1 232 bp）啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中是一個(gè)廣泛表達(dá)啟動(dòng)子，（2 900 bp）、（2 178 bp）和（1 657 bp）在轉(zhuǎn)基因煙草中不表達(dá)。和之間的差異序列（425 bp）可能對表達(dá)特異性有重要影響。是一個(gè)棉花纖維細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子，在纖維細(xì)胞伸長期（10—15 DPA）表達(dá)水平相對較高，總體表達(dá)強(qiáng)度低于組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV 35S。該啟動(dòng)子可應(yīng)用于棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的功能研究和改良纖維性狀的分子育種。

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Cloning and functional characterization of the promoter ofgene That predominantlyexpressed in cotton fiber

LIU Fang, XU Mengbei, WANG Qiaoling, MENG Qian, LI Guiming, ZHANG Hongju, TIAN Huidan, XU Fan, LUO Ming

Biotechnology Research Center, Southwest University/Key Laboratory of Biotechnology and Crop Quality Improvement, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chongqing 400716

【Objective】Cotton fiber is the main economic product of cotton. It is the epidermal cells of the ovule outer integument through polar elongation and secondary wall thickening. As one of the longest plant cells, the cotton fiber cells are regarded as an ideal material in the study of plant cell growth and development. Identification of promoters specifically or preferentially expressed in fiber cells is of great significance for basic research on fiber development and molecular breeding for improving fiber traits. 【Method】In this study, we cloned the promoter ofgene, which is predominantly expressed in fiber cells. Through the PlantCARE website for promoter sequence analysis, we identified the important-regulatory elements contained in the cloned sequence. According to the distribution of some important-regulatory elements, the cloned promoter fragments were deleted at 5′- end. A total of 4 promoter fragments were obtained and the corresponding plant expression vector was constructed. The constructed plant expression vectors were used for genetic transformation of tobacco and cotton. The transgenic plants were identified through molecular identification of transgenic tobacco and cotton. GUS activity in different tissues, organs and fiber cells of transgenic plants at different development stages was also investigated. 【Result】The longest promoter cloned was 2 900 bp in length. In addition to a lot of transcription regulatory elements in the promoter, the sequence also contained multiple abscisic acid response elements, the elements essential for the anaerobic induction, methyl jasmonate response elements, brassinolide response elements, the elements involved in seed-specific regulation, the elements involved in defense and stress responsiveness, and MYB transcription factor binding sites. Four promoter fragments with a length of 2 900 bp (), 2 178 bp (), 1 657 bp () and 1 232 bp () were obtained by the 5′-terminal deletion, respectively. The transgenic tobacco plants were generated after confirmed by molecular identification.,anddid not express in transgenic tobacco, whileis widely expressed, and the expression level ofwas similar to that of CaMV 35S promoter. The different sequence betweenandcontained four abscisic acid response elements, two brassinolide response elements, and three MYB binding sites. These-regulatory elements may be associated with the non-expression of,, andpromoters in transgenic tobacco. The transgenic cotton plants ofwere obtained after confirmed by molecular identification.predominantly expressed in transgenic cotton fibers, and its expression level was higher at the elongation stage (10-15 DPA) of fiber cells while lower in the early developmental stage (5 DPA) of fiber cells and the stage of secondary cell wall deposition (20-30 DPA). 【Conclusion】Thepromoter was a widely expressed promoter, and thepromoter was a fiber predominant expression promoter, which was highly expressed during the elongation of fibers. It could be applied to the study on the gene function involved in cotton fiber development and molecular breeding for improving fiber traits.

cotton; promoter; functional characterization;; sphingolipid delta8-desaturase

2022-11-07；

2022-12-13

國家自然科學(xué)基金（31971984，31571722）

劉芳，Tel：15330430736；E-mail：lf530805@163.com。通信作者羅明，Tel：13996007163；E-mail：luo0424@126.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.002

（責(zé)任編輯 李莉）