張昕，楊星宇，張超然，張沖，鄭海霞，張仙紅

綠豆象熱激蛋白超家族基因的鑒定及表達(dá)分析

張昕，楊星宇，張超然，張沖，鄭海霞，張仙紅

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷 030801

【目的】鑒定綠豆象（）熱激蛋白（heat shock protein，HSP）超家族基因成員，明確高、低溫脅迫后HSP基因在綠豆象中的表達(dá)變化，為深入挖掘HSP基因功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā繌腎nsect Base 2.0下載不同昆蟲HSP基因的CDS和蛋白序列，并以此為參考在綠豆象全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行本地BLASTp和tBLASTn比對(duì)搜索，同時(shí)結(jié)合HMMER和關(guān)鍵詞兩種方法再次篩選目標(biāo)序列，最終完成搜索結(jié)果的匯總。利用CDD、MEGA、ProtParam等在線分析工具對(duì)綠豆象HSP超家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)綠豆象成蟲高、低溫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出7個(gè)候選，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)比較分析其在綠豆象不同蟲態(tài)（幼蟲、蛹、成蟲）及不同溫度脅迫下的表達(dá)特性。【結(jié)果】共鑒定出31個(gè)HSP基因，其中包括3個(gè)HSP90、8個(gè)HSP70、8個(gè)HSP60和12個(gè)sHSP（small HSP）。理化性質(zhì)分析顯示編碼的蛋白質(zhì)包含159—776個(gè)氨基酸殘基（aa），分子量介于18.4—88.9 kDa，理論等電點(diǎn)為4.95—9.17。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示多數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)基因定位于線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核。系統(tǒng)發(fā)育分析表明綠豆象熱激蛋白不同家族成員與其他昆蟲的熱激蛋白進(jìn)化關(guān)系較近，顯示了其在進(jìn)化上的保守性。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，不同蟲態(tài)在不同溫度脅迫后7個(gè)候選差異表達(dá)。經(jīng)高溫脅迫后在雌、雄成蟲體內(nèi)的表達(dá)量分別上調(diào)1 000和500倍；-經(jīng)高溫脅迫后在雌、雄成蟲體內(nèi)的表達(dá)量分別上調(diào)500和450倍；幼蟲經(jīng)高、低溫脅迫后，和-表達(dá)差異顯著?！窘Y(jié)論】通過(guò)綠豆象全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)共鑒定出31個(gè)完整的熱激蛋白超家族基因成員，分為4個(gè)亞家族，家族間蛋白結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和基因表達(dá)特征存在差異?？赡茉诔上x抵御高溫脅迫中行使重要功能，而幼蟲的高溫耐受性可能與的表達(dá)差異有關(guān)。

綠豆象；全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；熱激蛋白；基因家族；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

0 引言

【研究意義】綠豆象（）屬鞘翅目（Coleoptera）豆象科（Bruchidae）瘤背豆象屬（），是世界范圍內(nèi)危害儲(chǔ)藏豆類最嚴(yán)重的害蟲之一。該蟲對(duì)環(huán)境溫度變化具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，50和-20 ℃的極限溫度并不會(huì)引起各蟲態(tài)綠豆象的立即死亡，且蛹在50和-20 ℃的極限溫度下仍可生存約3.71和0.85 h[1]。熱激蛋白（HSP）是昆蟲生存的重要調(diào)節(jié)因子，在昆蟲抵抗環(huán)境脅迫以及生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[2-5]。據(jù)報(bào)道，HSP基因的表達(dá)不同程度地被誘導(dǎo)上調(diào)是昆蟲抵御溫度脅迫的重要機(jī)制[6-8]，因此對(duì)綠豆象熱激蛋白超家族基因成員進(jìn)行鑒定和表達(dá)模式分析，對(duì)明確綠豆象抵御溫度脅迫的機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】當(dāng)昆蟲暴露于熱、冷和其他環(huán)境脅迫刺激時(shí)，其體內(nèi)HSP基因的表達(dá)被誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)以響應(yīng)環(huán)境的脅迫，如韭菜遲眼蕈蚊（）在經(jīng)歷40 ℃高溫處理時(shí)，其體內(nèi)HSP70和sHSP等分子伴侶協(xié)同上調(diào)[9]；美洲斑潛蠅（）在熱脅迫和冷脅迫下，編碼熱激蛋白和角質(zhì)層蛋白的基因分別顯著上調(diào)[10]；亞洲柑橘木虱（）中熱激蛋白和解毒酶等基因在熱脅迫后表達(dá)量上調(diào)，可能參與了對(duì)熱脅迫的反應(yīng)和保護(hù)[11]。此外，LI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，沉默松墨天牛（）其成蟲的耐熱性顯著降低，可能在成蟲的熱抗性中發(fā)揮作用；Dong等[13]利用RNAi方法沉默二化螟（）表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與27 ℃飼養(yǎng)溫度及陰性對(duì)照相比，39 ℃高溫和-11 ℃低溫均導(dǎo)致幼蟲存活率降低，表明可提高二化螟的環(huán)境脅迫耐受性和生理調(diào)節(jié)活性。全基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析是鑒定基因家族的主要方式，廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物的基因鑒定及表達(dá)水平研究，如Xu等[14]基于全基因組分析對(duì)重要的蛀干害蟲光肩星天牛（）HSP超基因家族成員進(jìn)行了鑒定；Wang等[15]確定了煙粉虱（）HSP家族成員的數(shù)量，并明確熱/冷脅迫誘導(dǎo)或者抑制了HSP的表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】綠豆象各蟲態(tài)均具有很強(qiáng)的耐熱性和耐寒性。45 ℃脅迫下完全消滅綠豆象需要32 h，而50 ℃下4 h即可完全防治綠豆象[1]。在極限低溫下其幼蟲、蛹和成蟲分別可在-16 ℃ 45 min、-20 ℃ 30 min、-26 ℃ 20 min死亡率達(dá)100%[16]。但有關(guān)綠豆象HSP基因家族的鑒定及功能尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于綠豆象三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定其HSP超家族基因成員。在此基礎(chǔ)上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行綠豆象不同蟲態(tài)在不同溫度脅迫下HSP基因的表達(dá)研究，為進(jìn)一步探究綠豆象HSP超家族基因成員的功能及其耐熱、耐寒機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年4月至2022年6月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 昆蟲飼養(yǎng)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

供試綠豆象為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)飼養(yǎng)數(shù)代的穩(wěn)定種群。飼養(yǎng)條件：光照培養(yǎng)箱（LRH-100CB，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)），溫度（28±1）℃，相對(duì)濕度75%—80%，光周期16L﹕8D。

挑選羽化24 h的綠豆象雌、雄成蟲，配對(duì)后置于裝有無(wú)卵綠豆的培養(yǎng)皿中，接蟲24 h后取出綠豆象，將帶卵綠豆置于上述恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行飼養(yǎng)。根據(jù)前期研究結(jié)果，選取產(chǎn)卵后13 d（幼蟲期）、23 d（蛹期）以及羽化1 d的成蟲分別進(jìn)行高溫45 ℃（金屬水浴鍋HH-S2，常州國(guó)宇儀器制造有限公司，中國(guó)）和低溫-3 ℃（低溫培養(yǎng)箱LRH-150CA，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）脅迫處理3 h。處理后的綠豆象與27 ℃飼養(yǎng)的綠豆象各蟲態(tài)樣品均勻混合后液氮速凍進(jìn)行三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（百邁客生物科技有限公司，中國(guó)北京，測(cè)序數(shù)據(jù)未發(fā)表）。同樣取上述高、低溫脅迫后的綠豆象成蟲與27 ℃飼養(yǎng)的成蟲構(gòu)建二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，用于基因的定量分析（測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI，生物項(xiàng)目編號(hào)：PRJNA810268，編錄號(hào)：SRR18148874—SRR18148882）。共計(jì)10個(gè)樣品用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：1個(gè)混合樣品（全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）；9個(gè)處理樣品（3個(gè)樣品為高溫45 ℃處理組：B1、B2、B3；3個(gè)樣品為低溫-3 ℃處理組：C1、C2、C3；3個(gè)樣品為27 ℃對(duì)照組：A1、A2、A3）。

1.2 綠豆象HSP超家族基因的鑒定和序列分析

1.2.1 基因家族的鑒定 為準(zhǔn)確鑒定綠豆象HSP超家族基因成員，從昆蟲基因組網(wǎng)站http://v2.insect- genome.com/Genomeo[17]基因家族模塊中下載不同昆蟲的HSP蛋白序列和CDS序列，以下載的HSP數(shù)據(jù)為目標(biāo)序列進(jìn)行本地BLASTp和tBLASTn比對(duì)。通過(guò)Pfam蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://xfam.org/）下載HSP90（PF00183）、HSP70（PF00012）、HSP60（PF00118）和HSP20（PF00011）的隱馬爾可夫模型（HMM）文件，并以-value＜10-5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用HMMER3.0進(jìn)行綠豆象蛋白序列中4個(gè)結(jié)構(gòu)域的搜索[18]。同時(shí)，使用關(guān)鍵詞“Heat shock protein”和“Hsp”于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中查找，利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cg）和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http://smart.embl-heidelberg. de/）進(jìn)一步對(duì)候選的綠豆象目標(biāo)序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的確定。

1.2.2 序列理化性質(zhì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 分別使用ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）和ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)鑒定出的綠豆象HSP超家族基因序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，并通過(guò)WoLF PSORT（https://www.genscript.com/ tools/psort）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。將候選的綠豆象HSP基因編碼的蛋白序列通過(guò)NCBI在線BLAST比對(duì)，下載與其他昆蟲比對(duì)后的fasta結(jié)果文件，然后使用MEGA 7.0軟件中的ClustalW對(duì)HSP進(jìn)行多序列比對(duì)生成樹文件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.2.3結(jié)構(gòu)特征分析 基于綠豆象全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的GFF3文件，利用GSDS（http://gsds.cbi.pku.- edu.cn/）對(duì)進(jìn)行CDS和UTR結(jié)構(gòu)分析。使用MEME在線程序（https://meme-suite.org/meme/index. html）進(jìn)一步評(píng)估熱激蛋白中的保守基序（Motif）。參數(shù)設(shè)置如下：Motif位點(diǎn)分布，每個(gè)序列零個(gè)或一個(gè)位點(diǎn)；最大Motif數(shù)目，10；Motif寬度，Hsp90、Hsp70和Hsp60設(shè)置為30—70個(gè)殘基。由于Hsp20家族的序列都較短，因此設(shè)置的寬度為10—40個(gè)殘基，預(yù)測(cè)結(jié)果通過(guò)TBtools軟件可視化[20]。采用DNAMAN軟件（Lynnon Bio-soft，Quebet，美國(guó)）進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)Swissmodel （https://swissmodel.expasy.org/）在線軟件對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行PDB文件下載，再結(jié)合ESPript 3.0 （https://espript.ibcp.fr/）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 基因表達(dá)特性分析

1.3.1 候選的確定 綠豆象三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的聯(lián)合分析避免了差異表達(dá)基因（DEG）的假陽(yáng)性。通過(guò)對(duì)照和高溫脅迫下的綠豆象成蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析，篩選差異表達(dá)顯著的HSP并作為候選基因。

1.3.2 RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 收集高、低溫脅迫處理和對(duì)照的綠豆象幼蟲、蛹及雌、雄成蟲，液氮迅速冷凍，分別使用UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒（生工生物，中國(guó)上海）和HiScript? III第一鏈cDNA合成試劑盒（諾維贊，中國(guó)南京）進(jìn)行樣品的總RNA提取、cDNA模板的反轉(zhuǎn)。超微量核酸蛋白測(cè)定儀和1%瓊脂糖凝膠電泳用于檢測(cè)RNA的純度、濃度和完整性。使用Primer Premier 5.0（http://www. premierbiosoft.com/primerdesign/）設(shè)計(jì)7個(gè)候選HSP基因的qRT-PCR特異性引物，詳細(xì)信息列于表1中。qRT-PCR使用Stratagene Mx3000P（安捷倫，美國(guó)）定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，20 μL的反應(yīng)體系如下：2×ChamQ Universal SYBR qRT-PCR Master Mix（諾維贊，中國(guó)南京）10 μL，正反向引物各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，ddH2O 8.4 μL。擴(kuò)增程序采用二步法：95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線則為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量[21]，每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物信息及結(jié)果分析

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0（https://www.ibm.com/products/ spss-statistics）進(jìn)行單因素（ANOVA）方差分析和最小顯著性差異（LDS）檢驗(yàn)，同時(shí)利用GraphPad Prism 9.0（https://www.graphpad.com/）進(jìn)行雙尾T檢驗(yàn)（two-tailed test）并將結(jié)果可視化。以＜0.05作為顯著差異標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 綠豆象HSP超家族基因的鑒定

通過(guò)本地BLASTp、tBLASTn、HMM和關(guān)鍵詞的搜索，分別獲得178、209和165個(gè)HSP相關(guān)基因。去除重復(fù)序列84個(gè)及不完整序列109個(gè)，最終得到31個(gè)綠豆象HSP超家族基因序列，包括3個(gè)HSP90、8個(gè)HSP70、8個(gè)HSP60和12個(gè)sHSP（表2）。NCBI中的CDD以及SMART分析結(jié)果顯示，鑒定出的序列均含有相應(yīng)亞家族特定的保守區(qū)域。以“”命名綠豆象熱激蛋白基因，根據(jù)分子量大小將小熱激蛋白基因保留3位小數(shù)。編碼的蛋白質(zhì)，氨基酸長(zhǎng)度介于159—776 aa，分子量大小為18.4—88.9 kDa，理論等電點(diǎn)為4.95—9.17。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示多數(shù)被定位于細(xì)胞質(zhì)中，但也有少數(shù)基因定位于線粒體基質(zhì)、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（表2）。

2.2 CcHsp的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步研究的進(jìn)化關(guān)系，將篩選出的31個(gè)HSP序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，并使用MEGA7.0軟件鄰接法進(jìn)行1 000次抽樣分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果顯示，HSP基因家族分為HSP90、HSP70和HSP60 3支（圖1-A）。3個(gè)各自單獨(dú)成支，在進(jìn)化距離上關(guān)系較遠(yuǎn)。-與赤擬谷盜（）聚為一支，同源性關(guān)系較近；-與米象（）和馬鈴薯甲蟲（）的氨基酸序列一致性高達(dá)90%以上；而-在進(jìn)化關(guān)系上則與螢火蟲（）距離較近。8個(gè)分別聚類到兩個(gè)大分支和一個(gè)單獨(dú)的小分支。-、-、-和-聚為一支（A支）；-、-和-聚為另一大支（B支）；-則單獨(dú)成支（C支）。在進(jìn)化距離上，A支和B、C兩支關(guān)系較遠(yuǎn)，而B與C支的進(jìn)化距離關(guān)系較近。A支與光肩星天牛、松墨天牛和馬鈴薯甲蟲聚為一支，同源性最高；B支與鞘翅目其他昆蟲的HSP70基因也能較好地聚為一支；而C支則與黑腹果蠅（）在進(jìn)化距離上關(guān)系較近。8個(gè)共聚為4支，-、-和-分別單獨(dú)聚為一小分支，并在進(jìn)化距離上關(guān)系較遠(yuǎn)。剩余的5個(gè)聚為一支，同源性高，進(jìn)化距離近。

表2 綠豆象HSP超家族基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

A: HSP; B: sHSP

由于sHSP家族成員的序列較短，無(wú)法與上述的HSP家族其他成員進(jìn)行準(zhǔn)確比對(duì)，因此單獨(dú)構(gòu)建了綠豆象sHSP與相關(guān)昆蟲獨(dú)立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1-B）。結(jié)果顯示，12個(gè)綠豆象sHSP基因間部分聚為一支，部分單獨(dú)成支，聚類結(jié)果具有一定的分散性。由于sHSP家族基因在進(jìn)化上的廣泛性，導(dǎo)致部分綠豆象HSP基因與不同種昆蟲的親緣關(guān)系比同種昆蟲更為密切。

2.3 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

利用MEGA7.0軟件構(gòu)建了編碼蛋白間的進(jìn)化關(guān)系（圖2-A）。結(jié)果顯示，分為4組，每一組代表一個(gè)亞家族，且同一亞家族中的基因很好地匯集。利用MEME工具預(yù)測(cè)了10個(gè)保守基序，以探索超家族基因的結(jié)構(gòu)多樣性，同時(shí)使用TBtools軟件將基序進(jìn)行可視化分析（圖2-B）。結(jié)果表明，綠豆象HSP70家族中，除-缺少M(fèi)otif 7外，其他蛋白序列均含有10個(gè)相同基序；HSP60家族中，-僅含有4個(gè)基序，-、-和-則缺少了一個(gè)相同的基序Motif 10；在HSP90家族中，3條蛋白序列都有完整的10個(gè)Motif，僅在位置上略有差異。在綠豆象sHSP家族中，蛋白序列均不完整，但個(gè)別序列之間的Motif組成高度相似，如、和均含有6個(gè)Motif基序，和均包含5個(gè)Motif基序等。綠豆象sHSP家族的多序列比對(duì)（圖3-A）結(jié)果顯示，所有的12個(gè)均具有保守的晶體結(jié)構(gòu)域，并且在其保守區(qū)域內(nèi)含有6條折疊結(jié)構(gòu)域。使用相同的方法依次構(gòu)建了綠豆象HSP60、HSP70和HSP90家族的多序列比對(duì)（圖3-B、3-C和3-D），與綠豆象sHSP家族相同的是，各亞家族均具有該家族蛋白保守的特征結(jié)構(gòu)域。

A：31個(gè)HSP基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建的無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹，不同顏色區(qū)域代表不同CcHsp The unrooted phylogenetic tree was constructed from 31 amino acid sequences encoded by HSP genes, different CcHsps were marked with different colors；B：蛋白質(zhì)保守基序分析，不同顏色方塊代表不同基序Conserved motif of proteins, different color squares represented different motifs；C：綠豆象HSP超家族基因的CDS和UTR分析CDS and UTR analysis of the HSP proteins in C. chinensis

2.4 引物擴(kuò)增效率檢測(cè)

內(nèi)參基因與目的基因擴(kuò)增效率的一致性是qRT-PCR相對(duì)定量測(cè)定的前提，7個(gè)和內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)（2）均大于0.98，擴(kuò)增效率和斜率分別介于90%—110%和-3.6—-3.1，且與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致，滿足試驗(yàn)要求，因此可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（表1）。

2.5 高、低溫脅迫后不同發(fā)育階段CcHsp表達(dá)分析

利用綠豆象成蟲高、低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析31個(gè)的表達(dá)譜。結(jié)果表明，所有的在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中均可被找到，且不同基因表達(dá)水平不同，如、、經(jīng)高溫脅迫后高水平表達(dá)，而、、、-、-和-經(jīng)高溫和低溫脅迫后差異表達(dá)不顯著（表3）。

比較對(duì)照組和高溫處理組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)有51個(gè)具有HSP注釋的DEG（表4）。根據(jù)基因的差異表達(dá)變化，在不同的亞家族分別選擇、1、、-、-、-和-共7個(gè)作為候選基因進(jìn)行后續(xù)的表達(dá)分析。

qRT-PCR分析了高溫45 ℃和低溫-3 ℃脅迫3 h后7個(gè)候選的表達(dá)變化，以27 ℃室溫下7個(gè)候選基因在各蟲態(tài)的表達(dá)量作為對(duì)照（圖4）。結(jié)果顯示，7個(gè)候選基因在綠豆象幼蟲期、蛹期和成蟲期均檢測(cè)到表達(dá)。經(jīng)-3 ℃低溫誘導(dǎo)后，、-和-在綠豆象不同發(fā)育階段的表達(dá)量無(wú)明顯變化，而在蛹期差異上調(diào)表達(dá)。經(jīng)歷45 ℃高溫脅迫后，7個(gè)候選基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均上調(diào)表達(dá)，其中和-的表達(dá)量上調(diào)最為顯著。經(jīng)高溫脅迫后在雌、雄成蟲體內(nèi)的表達(dá)量分別上調(diào)1 000和500倍；-經(jīng)高溫脅迫后在雌、雄成蟲體內(nèi)的表達(dá)量分別上調(diào)500和450倍。在同一發(fā)育階段，不同溫度脅迫后各的表達(dá)變化也不相同。大致可分為3類：Ⅰ無(wú)顯著差異，包括幼蟲期-和-，蛹期、-和-，雌性成蟲期的-和雄性成蟲期的-；Ⅱ 顯著差異（*：＜0.05；**：＜0.01）：包括幼蟲期、、和-，蛹期、、-和-，雌性成蟲期-和-，雄性成蟲期、和-；Ⅲ 極顯著差異（***：＜0.001；****：＜0.0001）：包括幼蟲期-，雌性成蟲期、、和-，雄性成蟲期。

3 討論

3.1 綠豆象HSP基因超家族成員的鑒定與分析

本研究基于綠豆象全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)共鑒定出31個(gè)HSP基因，包括3個(gè)HSP90、8個(gè)HSP70、8個(gè)HSP60和12個(gè)sHSP。前人研究發(fā)現(xiàn)，在光肩星天牛、赤擬谷盜、褐飛虱（）和煙粉虱中分別鑒定出47、20、18和26個(gè)HSP基因[14-15,17,20]?？梢?jiàn)不同昆蟲間熱激蛋白基因的數(shù)量不同，這可能一方面與物種進(jìn)化過(guò)程中基因的重復(fù)或缺失而導(dǎo)致基因家族成員的擴(kuò)展和收縮有關(guān)[21]，也可能與參考基因組的來(lái)源和數(shù)量不同有關(guān)[22]。由于目前綠豆象基因組測(cè)序還未完成，本文僅利用模式昆蟲、近緣種昆蟲及其他科和目共計(jì)10種昆蟲基因組中的HSP基因作為目標(biāo)序列，在綠豆象全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中進(jìn)行本地BLAST，最后完成HSP基因超家族成員的鑒定[23-24]，但缺少本物種基因組作為參考可能會(huì)造成部分鑒定結(jié)果的不完整。

據(jù)Wang等[25]報(bào)道，HSP75是線粒體維護(hù)的關(guān)鍵調(diào)控因子，線粒體為真核生物提供了大部分的細(xì)胞能量，其功能的調(diào)整可能是環(huán)境適應(yīng)的基礎(chǔ)[26]。通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，綠豆象經(jīng)高溫脅迫后上調(diào)表達(dá)的-屬于HSP75和G高溫蛋白，亞細(xì)胞定位于線粒體，推測(cè)該基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能在綠豆象應(yīng)對(duì)高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。在篩選的8個(gè)中，僅-和-的氨基酸C末端與已知的HSP70蛋白家族C端特異性基序不同，這可能與亞細(xì)胞的定位有關(guān)[27]。HSP60家族包括Ⅰ型Hsp60和Ⅱ型TCP-1-a/CCT-a[14]。綠豆象8個(gè)中，僅-屬于Ⅰ型HSP60，其余7個(gè)均屬于Ⅱ型HSP60，而亞細(xì)胞定位于線粒體基質(zhì)的-則是Ⅱ型HSP60的另一個(gè)亞家族。本研究中，除-—、-—、—以及-、—、外，其他亞家族成員均缺乏一些基序。因此，蛋白結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致了熱激蛋白功能的差異[14]。

3.2 HSP的表達(dá)在綠豆象各發(fā)育階段發(fā)揮不同功能

目前，許多與溫度適應(yīng)性和脅迫相關(guān)的sHSP基因已在不同昆蟲中得到了研究，且大量的試驗(yàn)證實(shí)HSP家族基因的表達(dá)上調(diào)在昆蟲抵御高溫脅迫中發(fā)揮著重要作用[28-32]。此外，HSP基因上調(diào)倍數(shù)因脅迫程度及昆蟲種類不同而存在差異。赤擬谷盜中的小熱激蛋白HSP22.2在高溫45 ℃脅迫1 h后表達(dá)量達(dá)到峰值，為對(duì)照組的15 000倍[2]；40 ℃高溫脅迫2 h引起三葉斑潛蠅（）表達(dá)量的上調(diào)且為對(duì)照組的140倍[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫后7個(gè)候選均被誘導(dǎo)表達(dá)，且雌、雄成蟲經(jīng)45 ℃處理后，雌成蟲和-上調(diào)顯著，分別為1 000和500倍，雄成蟲兩個(gè)基因上調(diào)分別近500倍，表明和-的上調(diào)表達(dá)可能在綠豆象成蟲抵御高溫脅迫中發(fā)揮作用。相似地，42.5 ℃高溫脅迫3 h導(dǎo)致-2在松墨天牛雌、雄成蟲體內(nèi)的表達(dá)差異顯著[12]；在經(jīng)歷高、低溫處理的幼蟲中和-表達(dá)量差異顯著，推測(cè)其可能有助于綠豆象幼蟲抵御高溫脅迫；綠豆象蛹期，、和-在低溫處理后的上調(diào)水平顯著高于高溫脅迫，推測(cè)這3個(gè)基因可能在蛹應(yīng)對(duì)低溫脅迫中發(fā)揮作用。相比于高溫脅迫，低溫并未誘導(dǎo)7個(gè)基因的顯著性響應(yīng)，這與BAI等[34]研究低溫處理煙粉虱后3個(gè)sHSP表達(dá)上調(diào)不顯著的結(jié)果相似。

表3 31個(gè)CcHsp在綠豆象成蟲高、低溫轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)譜

柱上不同大、小寫字母分別代表高溫（45 ℃）和低溫（-3 ℃）條件下發(fā)育階段間表達(dá)量差異顯著（P＜0.05，單因素方差分析和最小顯著性差異檢驗(yàn)）；星號(hào)和ns分別代表同一發(fā)育階段不同溫度處理下表達(dá)量差異顯著和不顯著（P＜0.05，雙尾T檢驗(yàn)）

表4 高、低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組中HSP基因差異表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析

續(xù)表4 Continued table 4

Count：比對(duì)到基因組上的reads個(gè)數(shù)the number of reads compared to the genome；FDR：衡量錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的指標(biāo)，所有檢驗(yàn)中假陽(yáng)性的概率A measure of the false discovery rate, the probability of false positives in all tests；Log2FC：差異倍數(shù)以Log2FC的形式展示，F(xiàn)C＝實(shí)驗(yàn)組表達(dá)情況/對(duì)照組表達(dá)情況The differential multiple was presented as Log2FC, FC＝expression of experimental group/expression of Control group

4 結(jié)論

綠豆象全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中鑒定出4個(gè)亞家族共31個(gè)HSP超家族基因成員，不同亞家族間具有不同的蛋白結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式，其中綠豆象成蟲和在經(jīng)歷高溫脅迫后，表達(dá)量上調(diào)顯著，推測(cè)這兩個(gè)基因可能在綠豆象成蟲抵御高溫脅迫中起重要作用。

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Identification and expression analysis of heat shock proteinsuperfamily genes in

ZHANG Xin, YANG XingYu, ZHANG ChaoRan, ZHANG Chong, ZHENG HaiXia, ZHANG XianHong

College of Plant Protection, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【Objective】The purpose of this study is to identify the gene members of theheat shock protein (HSP) superfamily, and to clarify the expression changes of HSP genes inafter high and low temperature stress, so as to provide a theoretical basis for further exploration of HSP gene function.【Method】The CDS and protein sequences of HSP genes of different insects were downloaded from Insect Base 2.0 and used as a reference for local BLASTp and tBLASTn comparison search in the full-length transcriptome sequencing database of. At the same time, target sequences were screened again by combining HMMER and key words to complete the summary of search results. Bioinformatics analysis of HSP superfamily genes inwas performed using CDD, MEGA, ProtParam, and other online analytical tools. Seven candidate HSP genes were screened out based on high and low temperature transcriptome sequencing data ofadults and the expression characteristics of 7s were compared and analyzed by qRT-PCR technique under different developmental stages and temperature stresses of.【Result】A total of 31 HSP genes were identified, including 3 HSP90s, 8 HSP70s, 8 HSP60s, and 12 sHSPs (small HSP). Physicochemical analysis showed that the proteins encoded bys contain 159-776 amino acid residues (aa), the molecular weights are about 18.4-88.9 kDa, and the theoretical isoelectric points are 4.95-9.17. Subcellular localization results showed that mosts were located in the cytoplasm, while a few genes were located in the mitochondrial matrix, endoplasmic reticulum and nucleus. Phylogenetic analysis showed that different family members of HSPs incould integrate well with HSP in other insects, which indicating their evolutionary conservation. The results of qRT-PCR showed that the 7 candidates were differentially expressed under different temperature stresses. after high temperature stress, the expression level of-in male and female adults was up-regulated by 500 and 450 times. after the larvae undergoing high and low temperature stress, the expression level ofand-was significantly different.【Conclusion】A total of 31 complete HSP superfamily gene members were identified by the full-length transcriptome sequencing data of, which were divided into 4 subfamilies. Different HSP families had different gene structures, protein conserved domains and gene expression characteristics. The differential expression of 7 candidates in different developmental stages and under different temperature stresses indicated that they played different functions and roles. It is speculated thatandmay perform important functions in the adult resistance to high temperature stress, and the high temperature tolerance of larvae may be related to the differential expression ofand.

; full-length transcriptome sequencing; heat shock protein; gene family; bioinformatics analysis; expression analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.009

2023-06-19；

2023-07-03

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1600603-01）、山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（雜糧）（2022-03）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-08-G10）

張昕，E-mail：sxauzx2018@163.com。通信作者張仙紅，E-mail：zxh6288@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）