劉雯錦 馬瑞 劉升燕 楊江偉，2 張寧，2 司懷軍，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科茄屬一年生草本植物，是世界重要的糧食、蔬菜兼經(jīng)濟(jì)作物，在糧食安全和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用［1］。干旱是一種常見的不利環(huán)境因素，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展有著極大的影響。馬鈴薯對(duì)水分十分敏感，干旱條件下，馬鈴薯根、莖、葉的生長(zhǎng)發(fā)育都會(huì)受到影響，其結(jié)薯能力以及塊莖對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收也會(huì)受到抑制，從而降低塊莖的品質(zhì)［2-3］，因此，干旱成為嚴(yán)重制約馬鈴薯生長(zhǎng)生產(chǎn)的重要因素之一［3-6］。

鈣離子是一種重要而保守的第二信使，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，在植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著至關(guān)重要的作用［7］。當(dāng)植物在受到不利環(huán)境刺激時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的濃度就會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的變化，即產(chǎn)生Ca2+振蕩。Ca2+感受器接受到振蕩信號(hào)并繼續(xù)向下游傳遞，從而引起植物一系列的生理生化反應(yīng)［8］。目前，已知高等植物中的Ca2+感受器有鈣調(diào)蛋白（calmodulin, CaM）、鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白（calcineurin B-like protein, CBLs）、鈣調(diào)蛋白類似蛋白（calmodulin-like protein, CMLs）和鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPKs），這四大類感受器的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中均含有EF手型（EF-hand）結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在與Ca2+結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生改變［9］。CBL是植物體內(nèi)多種鈣離子感受器中較為特殊的一類小分子鈣結(jié)合蛋白，其自身沒有活性，需與下游的CBL結(jié)合蛋白激酶（CBL interacting protein kinase,CIPK）特異性互作，激活下游靶標(biāo)，解碼Ca2+信號(hào)［10-11］。CIPKs是植物中特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族［12］，前人研究發(fā)現(xiàn)CIPK參與調(diào)節(jié)植物各種生理反應(yīng)從而調(diào)節(jié)植物應(yīng)激耐受性［13-15］。植物在遭受干旱脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS），造成嚴(yán)重的氧化損傷，破壞膜系統(tǒng)的完整性［16］，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde, MDA）的含量可以反映出植物所受傷害的程度［17］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和過氧化物酶（peroxidase, POD）可有效分解植物體內(nèi)的自由基，對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用。在缺水環(huán)境下，植物會(huì)通過改變體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)水平來維持正常生理功能，而脯氨酸（proline, Pro）是植物響應(yīng)滲透脅迫抗性的重要指標(biāo)，逆境中脯氨酸的累積可降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，保護(hù)質(zhì)膜免受缺水的有害影響［18-19］。

再者，食品行業(yè)有時(shí)需要運(yùn)輸海鮮、魚、肉等需要保鮮的東西，冬天還好，但是在夏天，天氣炎熱使很多物資都浪費(fèi)在了路上，損失的也不是小數(shù)目。這些問題一直到現(xiàn)在都是無法徹底解決的，公司的管理層對(duì)此也是非常地頭大，雖然物資運(yùn)輸慢是可以克服的，但是想要運(yùn)輸成批量的保鮮食品的難度還是非常大的。

近年來，有關(guān)CIPK響應(yīng)非生物脅迫過程的機(jī)制已在擬南芥、水稻、玉米、小麥等多種植物中進(jìn)行了大量研究，如AtCIPK6介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的鈣結(jié)合肽來調(diào)節(jié)對(duì)干旱的抗性［20］；過表達(dá)OsCIPK15可提高水稻對(duì)低溫、干旱和鹽脅迫耐受能力［21］；小麥過表達(dá)TaCIPK24可提高植株耐鹽性［22］；干旱脅迫后ZmCIPK8在玉米葉片和根部的表達(dá)發(fā)生了顯著變化［23］；SlCIPK8在番茄響應(yīng)干旱、低溫和鹽脅迫過程中都起到一定作用［24］；CaCIPK13在辣椒耐冷性機(jī)制中發(fā)揮積極作用［25］。

Ma等［26］完成了馬鈴薯CIPK家族基因系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯植株在干旱脅迫后StCIPK11的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，但關(guān)于馬鈴薯StCIPK11在干旱脅迫方面的研究還較為罕見。

1.2.5 馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定 將構(gòu)建好的p1300-StCIPK11和pBI121-amiR-StCIPK11重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中。參見Qi等［17］方法進(jìn)行試管薯的誘導(dǎo)，參考Huai［27］方法進(jìn)行馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料

所用供試馬鈴薯品種‘大西洋’試管苗由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供；pMD18-T克隆載體購(gòu)于TaKaRa公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌GV3101、載體pCAMBIA1300、pRS300和pBI121均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 根據(jù)TIANGEN總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取‘大西洋’葉片總RNA。根據(jù)TIANGEN Fast Quant RT試劑盒（天根，北京）合成第一鏈cDNA。

1.2.4.2 馬鈴薯StCIPK11干擾表達(dá)載體構(gòu)建 利用WMD3網(wǎng)站（http://wmd3.weigelworld.org/）獲取StCIPK11的amiRNA干擾序列（5′-TTCTATTTCCGCGCTAGCCTC-3′）和PCR擴(kuò)增引物序列（表1），將引物序列提交至金唯智生物科技（蘇州）有限公司進(jìn)行合成。以pRS300質(zhì)粒為模板，進(jìn)行amiRStCIPK11前體片段a（引物A和IV）、b（引物III和II）、c（引物I和B）的擴(kuò)增；再以a、b、c小片段混合物為模板擴(kuò)增d（引物A和B）片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收。將回收的d片段與pMD18-T克隆載體連接成功后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR檢測(cè)后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序檢驗(yàn)，以測(cè)序正確的pMD18-amiR-StCIPK11為基礎(chǔ)，采用酶切連接法將干擾片段amiR-StCIPK11插入pBI121質(zhì)粒中，命名為pBI121-amiR-StCIPK11。

1.2.4.1 馬鈴薯StCIPK11過表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)StCIPK11序列，通過（https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning）網(wǎng)站設(shè)計(jì)上下游引物并在5′端分別添加Kpn I和BamH I酶切位點(diǎn)（表1）。引物由金唯智生物科技（蘇州）有限公司合成。

2.全面清理不利于民營(yíng)企業(yè)發(fā)展的法律法規(guī)和規(guī)范性文件。統(tǒng)籌協(xié)調(diào)正在開展的相關(guān)法律法規(guī)清理工作，在2018年年底前集中清理現(xiàn)行法律法規(guī)和規(guī)范性文件中有悖于平等保護(hù)原則、不利于民營(yíng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的相關(guān)內(nèi)容，及時(shí)予以廢止或者調(diào)整完善，打破各種各樣的“卷簾門”“玻璃門”“旋轉(zhuǎn)門”。進(jìn)一步加強(qiáng)法規(guī)規(guī)章備案審查，及時(shí)糾正有悖于保護(hù)民營(yíng)經(jīng)濟(jì)的法規(guī)規(guī)章規(guī)定，積極為民營(yíng)企業(yè)發(fā)展提供平等法治保障。

1.2.4 載體構(gòu)建

泄漏7 200 d后，上覆第四系松散孔隙含水層氟化物污染羽狀物繼續(xù)向南側(cè)擴(kuò)散遷移，濃度也在持續(xù)增大，但遷移距離為75 m，擴(kuò)散面積12 800 m2;此時(shí)下伏巖溶含水層出現(xiàn)低濃度氟化物迅速向南側(cè)遷移，最遠(yuǎn)遷移距離約300 m,擴(kuò)散面積36 600 m2。

1.2.3 StCIPK11的生物信息學(xué)分析 從馬鈴薯PGSC數(shù)據(jù)庫(kù)（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml）中獲取StCIPK11序列（Soltu.DM.06G002800.1），利用NCBI ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找StCIPK11開放閱讀框；通過ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)該蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Ex-PASy-ProtScale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析其基本理化性質(zhì)；利用SOPMA（https://blog.csdn.net/wangli-ang_f/article/details/22859187）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/NJSqC4/models/）預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、WOLF PSORT（http://www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用MEGAX軟件對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（采取鄰近法、使用Poisson模式，重復(fù)次數(shù)為1 000，其他參數(shù)默認(rèn)）。

(1) 本文通過興趣點(diǎn)、土地開發(fā)情況、逗留人數(shù)、車站交通銜接條件等數(shù)據(jù)的挖掘，利用雷達(dá)圖分析法找到評(píng)價(jià)各車站的相對(duì)分值，該評(píng)價(jià)值與車站的出站客流量相關(guān)性較高，可以近似反應(yīng)各站客流量的變化趨勢(shì)。因此，該方法可以在城市軌道交通客流評(píng)價(jià)中進(jìn)行應(yīng)用。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

利用同源重組法將1.2.2中的回收產(chǎn)物連接至pCAMBIA1300質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為p1300-StCIPK11。

1.2.2 StCIPK11基因克隆 以1.2.1合成的cDNA為模板進(jìn)行StCIPK11的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。按照天根生化科技（北京）有限公司DNA膠回收試劑盒說明書，回收經(jīng)電泳檢測(cè)后的StCIPK11片段。

本研究克隆StCIPK11并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建其過表達(dá)載體和干擾表達(dá)載體，對(duì)轉(zhuǎn)化馬鈴薯薯塊獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PEG脅迫，測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中StCIPK11的表達(dá)水平和生理生化指標(biāo)，解析StCIPK11在響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮的作用，以期為深入研究StCIPK11響應(yīng)馬鈴薯抗旱調(diào)控的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

通過查找比對(duì)馬鈴薯StCIPK11蛋白與其他11個(gè)物種同源性蛋白序列發(fā)現(xiàn)，HRDLKPENLL這段序列在12個(gè)比對(duì)的物種間高度保守（圖2）。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析StCIPK11蛋白在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果（圖3）表明，馬鈴薯與智利番茄的親緣關(guān)系最近。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株StCIPK11的表達(dá)分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析StCIPK11在不同轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)情況。以非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板，延伸因子lα（elongation factor 1α, Ef1α）基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），使用TIANGEN Super Real PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為Super Real PreMix Plus（2×）10 μL、上、下游引物各0.6 μL、模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)。3次技術(shù)重復(fù)，根據(jù)相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式2-ΔΔCt法計(jì)算StCIPK11的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析方法 利用Office 2020對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與整理，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值，用LSD法進(jìn)行顯著性分析，星號(hào)表示顯著性差異（*：P＜0.05，顯著差異；**：P＜0.01，極顯著差異）。

1.2.7 PEG6000脅迫下轉(zhuǎn)基因植株StCIPK11的生理生化指標(biāo)測(cè)定 將轉(zhuǎn)基因植株接種于含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基（25℃ 16 h光照/8 h黑暗20 d），倒出液體培養(yǎng)物，并含20% PEG6000新MS液體培養(yǎng)基取代［28-29］。處理1 d后取樣，液氮速凍后-80℃保存，每個(gè)樣品采集自獨(dú)立的植株，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)》操作方法［30］，測(cè)定葉片中SOD活性、POD活性、MDA含量和Pro含量。

面對(duì)全新的發(fā)展環(huán)境，各醫(yī)院必須緊緊圍繞在戰(zhàn)略部署的周圍，深化理解現(xiàn)代醫(yī)院管理制度的現(xiàn)實(shí)需要，實(shí)現(xiàn)對(duì)財(cái)務(wù)管理各崗位職能與責(zé)任義務(wù)的優(yōu)化配置，進(jìn)而為構(gòu)建嶄新財(cái)務(wù)管理組織奠定基礎(chǔ)，適應(yīng)公立醫(yī)院綜合改革的現(xiàn)實(shí)需要。在實(shí)現(xiàn)崗位優(yōu)化配置的實(shí)踐中，應(yīng)該將重點(diǎn)放在財(cái)務(wù)管理職能逐步強(qiáng)化這一視角之上，整合《會(huì)計(jì)法》、《行政事業(yè)單位內(nèi)部控制規(guī)范》、《醫(yī)院財(cái)務(wù)制度》等相關(guān)法律法規(guī)與政策部署中的要求與路線指引，公立醫(yī)院應(yīng)該將進(jìn)一步提高內(nèi)部治理能力為基本著眼點(diǎn)與發(fā)力點(diǎn)，盡快構(gòu)建起將總會(huì)計(jì)師作為核心的領(lǐng)導(dǎo)管理機(jī)制，使得財(cái)務(wù)部門可以盡快實(shí)現(xiàn)集中化、統(tǒng)一化管理，實(shí)現(xiàn)財(cái)務(wù)核算職能與管理職能的相互分離。

2 結(jié)果

2.1 StCIPK11基因克隆

以馬鈴薯品種‘大西洋’的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（圖1-A），瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，在1 000-2 000 bp之間有明顯條帶，大小約為1 341 bp，與預(yù)期大小一致。

圖1 StCIPK11的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶及 amiR-StCIPK11前體片段擴(kuò)增Fig.1 StCIPK11 amplified product bands and amiRStCIPK11 precursor fragments amplification

2.2 StCIPK11生物信息學(xué)分析

根據(jù)馬鈴薯StCIPK11序列（Soltu.DM.06G0028 00.1），該基因位于第6染色體，全長(zhǎng)1 747 bp，包含一個(gè)1 341 bp開放閱讀框，含有2個(gè)外顯子。StCIPK11共編碼456個(gè)氨基酸，總原子數(shù)7 238個(gè)、化學(xué)分子式C2281H3663N611O659S24、相對(duì)分子量50 960.31 Da、等電點(diǎn)8.47、不穩(wěn)定指數(shù)38.01。通過在線軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，StCIPK11蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲（40.36%）為主，α-螺旋（31.61%）次之，最后為延伸鏈（19.0%）和β轉(zhuǎn)角（8.97%）；StCIPK11蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，是不具有跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性蛋白。

通過CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，利用表達(dá)載體pCAMBIA1300上特有的HYG抗性標(biāo)記序列和pBI121上特有的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NPT II，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以非轉(zhuǎn)基因植株DNA和質(zhì)粒p1300-StCIPK11、pBI121-amiR-StCIPK11作為對(duì)照，分別擴(kuò)增HYG和NPT II，篩選轉(zhuǎn)基因植株用于后續(xù)測(cè)定。

Step3：將屬于同一類別的所有用戶評(píng)分和情境信息平均值作為該類中心；返回Step2，直到聚類中心不再發(fā)生變化。

2.3 StCIPK11過表達(dá)載體與干擾表達(dá)載體構(gòu)建

利用同源重組法獲得重組質(zhì)粒p1300-StCIPK11，經(jīng)Kpn I和BamH I酶切驗(yàn)證，結(jié)果（圖4-A）顯示，片段在1 000和1 500 bp中間有明顯條帶，大小約為1 341 bp，符合目的基因預(yù)期效果，結(jié)合測(cè)序結(jié)果，進(jìn)一步說明馬鈴薯過表達(dá)載體p1300-StCIPK11構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Double-digestion verification of recombinant plasmid

以pRS300為模板，擴(kuò)增獲得a（272 bp）、b（171 bp）、c（298 bp）片段（圖1-B），以a、b、c的膠回收產(chǎn)物以等量混合后擴(kuò)增d片段，片段大小與預(yù)期相符（圖1-C）。利用雙酶切法獲得干擾表達(dá)載體pBI121-amiR-StCIPK11，經(jīng)Kpn I和Xba I雙酶切驗(yàn)證，插入的目的片段大小為512 bp（圖4-B），與預(yù)期片段的大小相符，結(jié)合測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明干擾表達(dá)載體pBI121-amiR- StCIPK11構(gòu)建成功。

2.4 馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)

對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)化植株用HYG和NPT II進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果表明，目的基因已整合到馬鈴薯基因組中。RT-qPCR結(jié)果表明，StCIPK11在過表達(dá)株系中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株，OE-1和OE-2的表達(dá)水平分別是NT植株的11.59和21.76倍；StCIPK11在干擾表達(dá)株系中的表達(dá)水平顯著低于NT，Ri-1和Ri-2的表達(dá)水平分別是NT植株的0.21和0.22倍，抑制效率達(dá)到78%以上（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的RT-qPCR檢測(cè)Fig.5 RT-qPCR detection of the transgenic plants

2.5 PEG6000脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)測(cè)定

模擬干旱條件下，過表達(dá)植株中MDA含量是NT植株的1.24-1.32倍以上，而Pro含量是NT植株的0.91倍，SOD和POD活性也較低，僅為NT植株的82%-84%；干擾表達(dá)植株中MDA含量是NT植株的0.84-0.86倍，Pro含量是NT植株的1.18-1.32倍，SOD、POD活性顯著高于NT植株和過表達(dá)植株，是NT植株的1.25-1.40倍（圖6）。

圖6 PEG6000處理下轉(zhuǎn)基因植株和NT植株生理指標(biāo)分析Fig.6 Analysis of physiological indices of transgenic and NT potato plants under PEG6000 treatment

3 討論

干旱是威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和生態(tài)平衡的主要環(huán)境因素之一［31］。當(dāng)植物遭受干旱脅迫時(shí)，細(xì)胞中的鈣離子濃度會(huì)迅速累積［17］。CBL-CIPK作為Ca2+信號(hào)通路中的重要感受器之一，在維持植物正常生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)環(huán)境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用?；谇叭藢?duì)馬鈴薯CIPK基因家族的研究，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PEG模擬干旱脅迫條件下，干擾表達(dá)StCIPK11可以提高馬鈴薯抗氧化酶（SOD、POD）活性和脯氨酸含量，減少M(fèi)DA含量，減輕細(xì)胞受損程度，從而降低馬鈴薯幼苗對(duì)水分的敏感性。

本研究對(duì)StCIPK11進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，StCIPK11編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥［28］、紫花苜蓿［32］和小麥［33］等CIPK蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，均以無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)為主；研究發(fā)現(xiàn)AtCIPK11蛋白在擬南芥中雙定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中［31］，而本研究亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示StCIPK11蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)上，后期需進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)再次鑒定。

在其他調(diào)味品應(yīng)用上，Nisin主要是與其他防腐劑進(jìn)行復(fù)配使用，而非單一添加應(yīng)用，因此后續(xù)在開發(fā)Nisin防腐效果上，應(yīng)采用復(fù)配型防腐劑。

為進(jìn)一步研究StCIPK11響應(yīng)非生物脅迫的分子和生理機(jī)制，通過構(gòu)建過表達(dá)載體和干擾表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得StCIPK11轉(zhuǎn)基因植株。本研究中，在20% PEG條件下，NT植株和轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)MDA、Pro含量和SOD、POD活性較脅迫前均有升高，過表達(dá)植株中MDA含量高于NT植株，而Pro含量和SOD、POD活性均顯著低于NT植株，說明干旱條件下，StCIPK11過表達(dá)植株更易受到損傷，且清除活性氧的能力較弱；干擾表達(dá)植株中MDA含量略低于NT植株，而Pro含量和SOD、POD活性則是NT植株的1.18-1.40倍，說明干擾表達(dá)植株對(duì)干旱脅迫具有更高的抵抗力。前人發(fā)現(xiàn)，AtCIPK11不僅響應(yīng)干旱、高pH脅迫，還參與鐵離子和脫落酸（abscisic acid, ABA）調(diào)節(jié)［24,34-35］；ZmCIPK27在玉米遭受干旱脅迫后表達(dá)水平顯著上升［36］；馬鈴薯中，StCIPK11在響應(yīng)干旱、PEG、NaCl及部分激素脅迫后其表達(dá)水平存在顯著差異［26,37］；擬南芥過表達(dá)AtCIPK11植株在干旱脅迫下，MDA含量最高，脯氨酸含量顯著低于NT植株［35］，與本研究結(jié)果一致。StCIPK11可能是通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)抗氧化酶活性，清除體內(nèi)自由基含量，增加有機(jī)物質(zhì)積累從而響應(yīng)干旱脅迫，其作用機(jī)理及分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果初步表明了StCIPK11負(fù)調(diào)控馬鈴薯的抗旱性。

綜上所述，護(hù)理臨床帶教中實(shí)施分層次教學(xué)目標(biāo)管理，應(yīng)用價(jià)值較高，可有效提供帶教效果，為實(shí)習(xí)生日后工作奠定良好基礎(chǔ)，利于醫(yī)療事業(yè)良性發(fā)展。

4 結(jié)論

從馬鈴薯中克隆獲得StCIPK11，全長(zhǎng)1 747 bp，包含一個(gè)1 341 bp開放閱讀框，編碼456個(gè)氨基酸。StCIPK11對(duì)干旱脅迫有響應(yīng)，在馬鈴薯中干擾其表達(dá)，會(huì)使馬鈴薯植株抗旱能力升高。