周嬡婷 彭睿琦 王芳 伍建榕，2 馬煥成

（1.西南林業(yè)大學林學院，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，昆明 650224）

特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）作為芽孢桿菌屬（Bacillus）中具有較好拮抗作用的一類生防微生物，可以通過產生抗生素、細胞壁水解酶、揮發(fā)性物質、次級代謝產物等來抑制靶標病原菌或細菌的生長繁殖，促進植物生長［1-3］。多方面的研究已經得到證實，Kiran等［4］發(fā)現(xiàn)從海洋中分離得到的B.tequilensis MSI45對耐藥性極強的金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌及抗氧化活性。Li等［5］從白芷中分離到了一株對稻瘟病菌具有較高抑制活性的內生菌B.tequilensis GYLH001，是能夠在農業(yè)上用于防治稻瘟病的潛力生防治劑，這對于提升綠色糧食質量具有重要作用。Zhou等［6］從健康水稻植株中獲得了一株能夠抑制多種植物病原菌發(fā)生發(fā)展的菌株B.tequilensis JN-369，除了具有較好的拮抗作用外，還能促進水稻種子萌發(fā)和幼苗植株生長，提高植物防御酶活性，顯著減少水稻葉瘟病和穗瘟病，并且能夠提高田間水稻的產量，是一種潛在的稻瘟病生物防治劑和水稻栽培生物肥料。Shultana等［7］在沿海受鹽影響的水稻種植區(qū)收集并篩選到了潛在耐鹽植物生長促進菌B.tequilensis UPMRB9，它能夠增強滲透保護特性，提高抗氧化酶活性，是一種潛在的生物增強劑。綜上，可見特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）在一定程度上可以減輕農林業(yè)生產中化學農藥的使用劑量，提高作物對脅迫因素的抵抗力，增加生物量等。

代謝組學是生物學科中的新興組學，研究的是生命體內的代謝產物種類、數量及其變化規(guī)律的科學，能夠更直接、更準確地反映生物體的生理狀態(tài)，揭示其參與的生命活動機制［8-9］。其中，非靶向分析模式能夠將生物體內代謝水平的擾動情況最大程度地反應出來，側重于系統(tǒng)性和整體性的分析。作者發(fā)現(xiàn)B.tequilensis DZY6715能夠有效防控油茶炭疽菌，且該菌株在生長前期和生長后期對油茶炭疽菌的抑菌活性存在差異，尤以后期階段的抑制活性高，并且隨著培養(yǎng)時間的遞增，防效越明顯。所以，本文擬通過非靶代謝組的方法研究菌株DZY6715在生長前期和生長后期發(fā)揮主要抑菌活性的物質，探究這兩個時期差異代謝物的種類、調控機制及功能作用等，為生防菌株DZY6715的抑菌活性分子機制提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）DZY6715和油茶炭疽菌（Colletotrichum fructicola）是筆者分別從油茶健康葉片和油茶炭疽病葉片中分離獲得的，保存在西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院病理學實驗室。

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20，pH自然，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，備用；PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株DZY6715生長曲線測定 首先將菌株DZY6715在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，然后用無菌接種針把單菌落移至200 mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別?。╰=6、12、24、48、72、96 h）的菌液稀釋后涂布，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后計數，根據稀釋倍數計算每毫升菌液中的活菌數量［10］。

1.2.2 不同時期培養(yǎng)液對油茶炭疽菌的抑制活性 采用平板對峙法［11］測定菌株DZY6715在生長前期（t=24 h）和生長后期（t=72 h）兩個階段對油茶炭疽菌的抑菌活性，抑菌率的計算公式為：抑菌率（%）＝［（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑］×100%。此外，在光學顯微鏡下觀察經處理后的炭疽菌菌絲結構的變化情況。

1.2.3 樣本準備 菌株DZY6715在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，取適量轉移到LB液體培養(yǎng)基，以28℃，180 r/min在搖床上培養(yǎng)。根據菌株生長曲線的結果，收集生長前期（t=24 h）和生長后期（t=72 h）菌液，置于-80℃冰箱保存。菌株DZY6715在24 h和72 h的編號分別為DZYB24h和DZYB72h。

1.2.4 樣本提取 -80℃冰箱凍存的樣本送至上海中科新生命生物科技有限公司完成菌懸液的樣品制備、QC制備、樣品LC-MS/MS質譜分析和生物信息學分析。

1.2.5 差異代謝物分析 本文通過有監(jiān)督的偏最小二乘法分析（PLS-DA）方法建立判別模型來區(qū)分組間的總體差異，以OPLS-DA VIP＞1和P value＜0.05為標準篩選差異代謝物，并在KEGG數據庫（https:www.kegg.jpkeggpathway.html）進行代謝通路注釋。

1.2.6 數據處理 試驗每個處理3個重復，數據和圖表處理采用Excel 2010和Origin 2023軟件，顯著性分析采用SPSS Statistics 20.0，差異水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 菌株DZY6715的生長曲線

菌株DZY6715在6-24 h是對數生長期，24-48 h是生長穩(wěn)定期，48 h以后開始表現(xiàn)出下降的趨勢，72 h進入衰亡平穩(wěn)期（圖1）。生長穩(wěn)定期（生長前期）和衰亡期（生長后期）分別是代謝產物生產比較穩(wěn)定的時期和代謝產物累積較多的時期，因此，本文將對這兩個點的代謝產物進行后續(xù)分析。

圖1 菌株DZY6715的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain DZY6715

2.2 菌株DZY6715在不同生長期對炭疽菌的抑菌活性

圖2和圖3可以看出，t=24 h和t=72 h的菌液對油茶炭疽菌都有抑制作用，但二者的抑菌活性存在差異，表現(xiàn)為生長后期的抑菌活性較高。另外，隨著培養(yǎng)時間的遞增，抑菌率也隨之增加，并且72 h處理組的抑菌率始終高于24 h處理組，在培養(yǎng)過程中，二者的抑菌率范圍分別為18.05%-55.25%和11.82%-48.88%（培養(yǎng)第3-7天）。另外，對處理后的菌絲形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的菌絲通直，粗細均勻，伸展性好，未出現(xiàn)膨大加粗或細胞空泡化現(xiàn)象，而24 h和72 h處理組的菌絲均出現(xiàn)不同程度的畸形，具體表現(xiàn)為，24 h處理組的菌絲細胞長度變短，中央細胞膨大成橢圓形，相比24 h處理組，72 h處理組的菌絲細胞長度更短，表現(xiàn)為整體均勻膨大，菌絲細胞側邊分支產生球狀或念珠狀的數量較多，整體來說，72 h處理組的畸形現(xiàn)象更突出（圖4）。

圖2 菌株DZY6715在不同生長期對油茶炭疽菌的抑菌效果Fig.2 Antifungal effects of strain DZY6715 against C.fructicola at different growth stages

圖3 菌株DZY6715在不同生長期對油茶炭疽菌的抑菌率Fig.3 Inhibition rate of strain DZY6715 against C.fructicola at different growth stages

圖4 不同生長期的菌株DZY6715處理后對油茶炭疽菌菌絲形態(tài)的影響（10×100倍）Fig.4 Effects of strain DZY6715 on mycelial morphology of C.fructicola at different growth stages（10×100 times）

2.3 數據質控

QC工作是進行基于質譜技術的代謝組學研究時獲得可靠且高質量的代謝組學數據的基礎，采用主成分分析方法（PCA）對數據進行質控分析。如圖5所示，紫色QC樣本檢測結果密集的聚在一起，說明QC重復性良好，分析系統(tǒng)穩(wěn)定，所采集的樣品數據可以進一步差異分析。

圖5 QC樣本的PCA得分圖Fig.5 PCA score chart of the QC samples

2.4 主成分（PCA）分析

不同顏色表示不同生長時期的樣品，同一顏色表示同一生長時期下的樣品重復（圖6）。DZYB 24h和DZYB 72h兩組的樣本點均分布集中，說明組內樣本重復性較好，不同處理間樣本點分布明顯分離，說明DZYB 24h和DZYB 72h的代謝物存在差異，本次數據質量高，檢測性好。

圖6 DZYB72h-vs-DZYB24h的PCA得分圖Fig.6 PCA score chart of DZYB72h-vs-DZYB24h

2.5 偏最小二乘判別（PLS-DA）分析

經7-fold cross-validation（7次循環(huán)交互驗證）得到的模型評價參數（R2和Q2），一般Q2和R2大于0.5，表明模型穩(wěn)定可靠。如圖7所示，正、負離子模式下，樣本在空間位置上聚類明顯，分成兩組，表明PLS-DA模型穩(wěn)定可靠，組間有明顯的差異。為避免有監(jiān)督模型在建模過程中發(fā)生過擬合，采用置換檢驗（Permutation test）對模型進行檢驗，可以看出隨著置換保留度逐漸降低，隨機模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)健性良好。

圖7 DZYB72h-vs-DZYB24h的得分圖（A1, B1）和置換檢驗圖（A2, B2）Fig.7 PLS-DA score（A1, B1）and permutation test chart（A2, B2）of DZYB72h-vs-DZYB24h

2.6 差異代謝物篩選

把OPLS-DA VIP＞1和P value ＜ 0.05作為差異代謝物的篩選標準。將樣本中正負離子模式合并后篩選到差異代謝物共239個，100個上調，139個下調（圖8）。

圖8 DZYB72h-vs-DZYB24h的差異代謝物火山圖Fig.8 Differential metabolite volcano plot of DZYB72h-vs-DZYB24h

2.7 KEGG Pathway分析

DZYB72h_vs_DZYB24h樣本中，顯著性差異代謝物注釋到了32條代謝通路中，Top20的代謝通路被顯示在圖9中，共富集到差異代謝物183個。顯著性通路分別為：蛋白質消化和吸收，氨酰tRNA生物合成，氨基酸的生物合成，礦物吸收，ABC轉運蛋白，賴氨酸降解，2-氧代羰酸代謝，各種次生代謝物的生物合成/第3部分，氰氨基酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，精氨酸生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，Tropanc、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，泛酸和CoA生物合成，苯丙氨酸代謝，mTOR信號通路，苯乙烯降解，谷胱甘肽代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，芥子油苷生物合成，酪氨酸代謝，軸突再生，硫胺素代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，組氨酸代謝，β-丙氨酸代謝，嘧啶代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，賴氨酸生物合成，神經活性配體-受體相互作用，GABA能突觸，cGMP-PKG信號通路。

Pathway通路分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質消化和吸收、氨酰tRNA生物合成、氨基酸的生物合成、ABC轉運蛋白、2-氧羰基酸代謝這5條通路在拓撲分析中的影響較大，重要性在0.2174-0.3830之間，差異代謝物的數量分別為19、14、19、17、15（表1），后續(xù)主要重點分析這些通路。

表1 5條重要代謝通路中的差異代謝物Table 1 Differential metabolites in 5 metabolic pathways

分析這5條代謝通路發(fā)現(xiàn)，共涉及27種差異代謝物，主要是氨基酸、有機酸、高檸檬酸鹽、苯酚、腺苷、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、諾氟沙星、硫胺素（表2）。其中，氨基酸占比最高，為61%，其次是有機酸，占比為18%，說明氨基酸和有機酸對細胞生長前期和后期的影響較大，可能調控著細胞的生命過程。

表2 5條代謝通路的差異代謝物分析Table 2 Differential metabolite analysis of five metabolic pathways

2.8 差異代謝物表達量分析

菌株DZY6715生長前期氨基酸總的表達量顯著高于生長后期，并且各氨基酸在不同生長階段的表達量也存在差異，總體上生長前期的表達量高于生長后期。在兩個生長階段中，DL-纈氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸的表達量較低。在生長前期，精氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸大量表達，分別是生長后期的22.02、2.10、2.02、2.49倍；在后期，賴氨酸、苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-絡氨酸的表達量顯著升高，分別是前期的1.48、1.53、1.19、1.88倍（圖10-A）。因此，認為精氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸在菌株DZY6715生長前期起著主導作用，更側重于參與細胞生長、能量代謝等過程，而賴氨酸、苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-絡氨酸可能主要對后期階段中的脅迫因素起緩解作用。

有機酸在生長后期的總表達量明顯高于生長前期。前期，鄰苯二甲酸和丙酸的表達量明顯高，分別是后期的3.64、8.46倍，而異戊酸、2-氨基己二酸、丁酸在后期的表達量顯著高于前期，分別是前期的3.00、3.18、13.66倍（圖10-B）。這說明有機酸都參與了細胞的不同生長階段，并且后期階段累積的有機酸更多，這對緩解后期營養(yǎng)、空間不足等的壓力有重要作用。

諾氟沙星、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、腺苷、苯酚、高檸檬酸鹽的后期表達量遠高于前期，分別是前期的1.67、45.39、5.97、49.35、5.61倍，而硫胺素前期的表達量比后期高117.23倍（圖10-C），說明不同生長階段中，各代謝物的表達量存在差異，抑或是代謝物表達量的高低因不同生長階段而異。

3 討論

本文生物學試驗發(fā)現(xiàn)，與生長前期（t=24 h）相比，生長后期（t=72 h）的菌株DZY6715處理油茶炭疽菌后的菌絲細胞畸形現(xiàn)象更明顯，說明經生長后期（t=72 h）處理的病原菌絲生長受限更嚴重［12］，同時也表明了菌株DZY6715生長后期（t=72 h）的抑菌活性更強。

氨基酸是許多細胞生物合成和代謝過程中的主要代謝產物，不僅作為前體物質參與細胞構建，還通過形成催化酶調節(jié)細胞代謝［13］。本文發(fā)現(xiàn)菌株DZY6715在生長后期和前期的差異代謝物中氨基酸占比最高，并且前期氨基酸的表達量顯著高于后期，這可能是在細胞開始生長繁殖的階段，需要大量氨基酸提供能量以維持正常的生命活動，而隨著生長期的后移，積累和表達的氨基酸更側重于緩解生活環(huán)境中營養(yǎng)、空間等不足的壓力。這與本研究中生物學試驗部分的結果相吻合，進一步說明氨基酸既有構建細胞結構的功能，又能發(fā)揮抑菌作用，但是前者可能占主導地位。氨基酸及其衍生物具有較好的抗菌效果，氨基酸的積累有利于細胞對氧化脅迫、不利因素的抵抗［14］。例如，甘氨酸是抗菌活性較強的自由氨基酸，不僅能抑制病菌的生長繁殖，還可以參與谷胱甘肽抗氧化過程［15］。賴氨酸的生物合成為蛋白質的合成和細菌肽聚糖細胞壁的構建提供了必要的成分，這對于細胞的生長繁殖來說是必不可少的［16］。也有研究表明，色氨酸在細胞體內具有多種代謝功能，通常整合到酶和蛋白質的多肽鏈中，待完全分解后參與代謝過程，B.megaterium 和Rhodococcus erythropolis可以用色氨酸作為生長過程中所需的碳源和氮源［17］。芳香族氨基酸（苯丙氨酸、絡氨酸、色氨酸）和支鏈氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸）等可以通過形成疏水區(qū)域來保護蛋白質免受膽汁壓力［18］，苯丙氨酸和色氨酸可以增強水稻根系的耐受性，有效減少逆境下活性氧的大量產生［19］。學者研究表明，一氧化氮對植物炭疽菌分生孢子的萌發(fā)和附著胞的形成具有調控作用，而精氨酸作為一氧化氮的前體在此過程中起著關鍵作用［20］。Takagi等［21］發(fā)現(xiàn)脯氨酸以及谷氨酸、精氨酸、賴氨酸等有助于提高細胞對低溫的耐受性。精氨酸在脅迫下可以通過維持細胞的完整性、穩(wěn)固細胞壁和細胞質膜來防止細胞受損傷，參與調控活性氧的動態(tài)平衡，保護細胞在脅迫下的正常生長［22］。氨基酸的匱乏會降低細胞應對脅迫的能力，還會使蛋白質合成缺少原料，即便與蛋白質合成相關的氨酰-tRNA生物合成途徑被激活，也不足以完全解除蛋白質的合成阻礙，導致細胞生長受限，而酵母細胞通過減少氨基酸代謝途徑降低了能量的需求，維持碳、氮代謝平衡，使其在逆境中得以存活［23］。因此，認為氨基酸既是維持細胞生長和代謝平衡的重要物質，也是細胞抵抗脅迫的重要調節(jié)劑。

多方研究已證實有機酸可以抑制病原菌生長，增強有機體抗性，其主要是通過能量競爭、改變細胞膜通透性、改變滲透壓、抑制大分子合成和誘導抗菌肽產生等發(fā)揮抑菌作用。有機酸通過刺激宿主植物產生抗菌肽物質作用于磷脂雙分子層，增大病原菌細胞膜的通透性，導致細胞內容物外泄，殺死病原菌，但是相比之下，有機酸在細胞內解離出質子和酸根離子而發(fā)揮抑菌作用的效果更為顯著，并且抑菌效果與質子和酸根離子呈正相關［24］。另外，有機酸通過影響細胞內的酸堿性而抑制病原菌菌絲的生長［25］。研究表明，烏梅有機酸提取液對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和四聯(lián)球菌都具有較好的抑制作用［26］。乳酸菌發(fā)酵產生的丁酸對霉菌起抑菌作用［27］。Wang等［28］通過半制備分離獲得了對有害菌具有顯著抑菌作用的物質苯乳酸。本文研究也發(fā)現(xiàn)在細胞生長的不同階段，都涉及有機酸的參與，尤其是生長后期有機酸大量積累和表達，推測有機酸在細胞抵抗逆境中發(fā)揮著重要作用，這可能也是菌液在生長后期（t=72 h）的抑菌效果高于生長前期（t=24 h）的又一重要因素。

硫胺素（又名維生素B1）在生長前期的表達量遠遠高于后期，推斷硫胺素可能有助于細胞的生長繁殖。同時，B族維生素對于菌體的生長過程來說是極其重要的一個生長因子，還是生物體內多種酶的輔酶［29-30］，硫胺素的大量表達能夠增強酶的活性，進而加速菌體的生長繁殖速度。腺苷能夠間接參與細胞內的能量轉移、信號轉導等過程［31］，而本文發(fā)現(xiàn)菌株DZY6715生長的后期腺苷的表達量明顯高于前期，認為腺苷在前期階段主要是參與能量代謝的過程，而后期階段大量表達的腺苷可能是在響應壓力過程中傳遞重要信號的。此外，菌株DZY6715在生長后期苯酚、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、諾氟沙星、高檸檬酸鹽等差異代謝物高表達，推測這些代謝物質更主要的是參與調控細胞的抗逆生長過程，這些物質在響應脅迫中的重要地位已被學者所證實，N-乙酰-d-氨基葡萄糖是一種特殊的單糖，是生物體內絕大部分多糖的組成單位，不僅甜度較高，還有消炎、抗氧化等的功能［32-33］。苯酚是一種芳香族化合物，屬于酚類，有毒性，會對生物體的生長造成不良影響［34-35］。諾氟沙星是第3代氟喹諾酮類的一種抗生素，會阻礙消化道內致病細菌的DNA旋轉酶的作用，阻礙細菌DNA復制［36-37］。所以，本研究認為后期階段這些代謝物質高表達的原因，不僅是為有限空間內營養(yǎng)的不足提供能量，更偏向于利用這些代謝物來抵抗脅迫，這也印證了本文生物學試驗部分的結果，即菌株DZY6715在生長后期（t=72 h）抑菌活性較生長前期（t=24 h）高。

綜上，本文通過非靶向代謝組學技術對菌株DZY6715在不同生長時期的差異代謝物及差異代謝物的表達量進行了研究，剖析了該菌株在兩個不同的生長時期抑菌活性存在差異的原因，這為后續(xù)這些重要差異代謝物的靶向分析奠定了基礎，同時有利于該菌株有效抑菌物質的提取，使該菌株能更有效的應用到農林業(yè)生產的生物防治中。

4 結論

本文基于菌株生長曲線和生物學試驗得出，菌株DZY6715生長后期的抑菌活性高于生長前期，并且隨著培養(yǎng)時間的遞增，效果越明顯，結合非靶向代謝組學技術探討了該菌株生長前期和生長后期的差異代謝物及其調控機制，綜合分析認為，氨基酸主要是參與細胞的生長繁殖、能量代謝等，同時具有抑菌的作用；有機酸、硫胺素、腺苷、高檸檬酸鹽等差異代謝物是抵抗壓力的重要調節(jié)劑，是該菌株表現(xiàn)高抑菌活性的關鍵因子。