曾振芳,蔡杰慧,黃秋萍,龐華鈺,楊達(dá)欽,黃秋嬋

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,崇左 532200)

0 引 言

銅元素是人體生命活動(dòng)必不可少的主要微量元素之一[1]。以金屬銅為中心絡(luò)合而成的配合物,在氧化還原的環(huán)境中擁有可調(diào)控的配位構(gòu)型,應(yīng)用于催化[2]、磁體[3]、生物醫(yī)藥[4]和抑菌[5]等多領(lǐng)域。不同的配體提供不同的配位環(huán)境,造就了配位化合物的多樣性[6]。

抗腫瘤藥物與蛋白質(zhì)的特異性相互作用及其引起的蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究的目標(biāo)、內(nèi)容和途徑,人血清蛋白(human serum albumin, HSA)是血漿中含量豐富的蛋白質(zhì),由于HSA重要的生理功能和易于分離、提純的特性,因而常被作為模型物質(zhì)用于研究生物大分子與藥物小分子間的相互作用[7]。鉑類配合物已經(jīng)作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床多年[8],順鉑開(kāi)辟了金屬配合物在抗癌領(lǐng)域的研究,順鉑之后,卡鉑、奧沙利鉑等也應(yīng)用于臨床[9-10],但是鉑類配合物因?yàn)槎靖弊饔眉澳退幮缘葐?wèn)題,在臨床使用上受到限制[11]。銅可通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,包括活性氧積累、細(xì)胞凋亡、蛋白酶體抑制和線粒體功能障礙等[12],但是目前報(bào)道的銅配合物的抗腫瘤活性不大。為了開(kāi)發(fā)和發(fā)展新型具有抗腫瘤活性且毒性較小的金屬銅配合物,本文合成了一個(gè)新型配合物{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2},通過(guò)紅外、元素分析及單晶XRD等方法對(duì)配合物進(jìn)行表征,研究了{(lán)[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}的紫外及熒光性質(zhì),與HSA的相互作用方式和其對(duì)胃癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela、肝癌細(xì)胞HepG2和人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞的增殖抑制能力。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器、試劑

實(shí)驗(yàn)儀器:Spectrum 65型傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)PerkinElmer),Smart ApexII CCD X 型X射線單晶衍射儀(德國(guó) Bruker),Multiskan Spectrum型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo),RF-5301 PC型熒光分光光度計(jì)(日本島津),UV-8000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海分析儀器有限公司),VarioEL III元素分析儀(德國(guó)艾樂(lè)曼)。

實(shí)驗(yàn)試劑:三羥甲基氨基甲烷(Tris)、濃鹽酸、對(duì)氯苯甲酸(分析純,上海阿拉丁生化科技),三水合硝酸銅(分析純,天津市光復(fù)科技),甲醇(分析純,成都市科龍化工),HSA(純度99%,Sigma),A549、Hela、HepG2和LO2(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.2 配合物{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}的合成

稱取0.070 5 g(0.45 mmol)對(duì)氯苯甲酸溶于5.0 mL甲醇中。稱取0.024 2 g (0.1 mmol)三水合硝酸銅溶于10.0 mL甲醇中。攪拌下,將硝酸銅甲醇溶液滴入對(duì)氯苯甲酸溶液中,結(jié)束后,溶液為深藍(lán)透明態(tài),室溫下攪拌反應(yīng)30 min后置于燒杯中,用保鮮膜封好,扎3～4個(gè)小孔,室溫放置23 d,有塊狀淡藍(lán)色晶體析出。將晶體過(guò)濾后,在60 ℃干燥箱中烘干。{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}的分子式為C30H22Cl4Cu2O10,相對(duì)分子質(zhì)量MW=811.35。元素分析理論值(%):C 44.41, H 2.73;實(shí)驗(yàn)值(%):C 44.25, H 2.80。

1.3 配合物的表征

1.3.1 紅外光譜

在瑪瑙研缽中將溴化鉀研細(xì),以1∶100(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例,將配合物與溴化鉀研磨至完全混合狀態(tài),壓片。在波長(zhǎng)為4 500～400 cm-1下,使用Spectrum 65型傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)配合物樣品片進(jìn)行紅外掃描。

1.3.2 晶體結(jié)構(gòu)

在光學(xué)顯微鏡下,挑選大小為0.30 mm×0.26 mm×0.18 mm、表面光滑的晶體,293(2) K下,于Smart ApexII CCD X 型X射線單晶衍射儀上,用Cu-Kα(λ=0.154 184 nm)光源進(jìn)行衍射掃描,角度范圍為7.033°<θ<76.314°,在-8≤h≤7,-13≤k≤13,-15≤l≤15的衍射區(qū)中收集數(shù)據(jù),對(duì)配合物晶體進(jìn)行X單晶衍射。利用SHELXL 97和SHELXS 97[13]程序解析晶體結(jié)構(gòu),氫原子均為理論加氫。配合物的晶體學(xué)、主要鍵長(zhǎng)與鍵角數(shù)據(jù)分別列于表1、表2。CCDC: 2104588。R(int)=0.021 0,R1=0.040 0,wR2=0.114 5。

表1 配合物的主要晶體學(xué)參數(shù)Table 1 Crystallographic data of complex

表2 配合物的主要鍵長(zhǎng)和鍵角Table 2 Selected bond lengths and bond angles of complex

1.4 配合物晶體的紫外和熒光性質(zhì)

1.4.1 紫外光譜

稱取0.016 2 g (20.0 μmol)樣品溶解于20.0 mL DMSO溶液中,配置成濃度為1.0×10-3mol·L-1的溶液。對(duì)半稀釋成5.0×10-4、2.5×10-4、1.25×10-4、6.25×10-5、3.125×10-5、1.562 5×10-5、7.812 5×10-6mol·L-1。在波長(zhǎng)為200～700 cm-1下,用UV-8000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)配制的8個(gè)濃度的樣品溶液進(jìn)行紫外吸收掃描。

1.4.2 熒光光譜

室溫下,設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為326 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為343 nm,在波長(zhǎng)為320～400 cm-1下,用RF-5301 PC型熒光分光光度計(jì)(日本島津)對(duì)上述配制的8個(gè)濃度配合物溶液進(jìn)行熒光掃描。

1.5 配合物晶體與HSA的相互作用

1.5.1 溶液配制

Tris-HCl/NaCl(pH=7.4)緩沖溶液[14-15]:稱取0.605 7 g(5 mmol)的Tris和2.910 2 g(0.05 mol)的NaCl加入燒杯中,加入適量雙蒸水,攪拌至完全溶解,轉(zhuǎn)移至容量瓶(1.0 L)中,用濃鹽酸調(diào)節(jié)至所需pH值,定容,備用。HSA(2.0 mmol·L-1)溶液[16-17]:將適量HSA用上述緩沖溶液溶解,測(cè)定其在280 nm處的吸光度值A(chǔ)280,按照式HSA=K×A280/35 700(mol/L)計(jì)算出稀釋倍數(shù),K為稀釋所需濃度的倍數(shù),用緩沖溶液稀釋,備用。配制好的溶液存放于4 ℃下,3 d內(nèi)使用。

1.5.2 紫外光譜

樣品池和空白池中各放入2.5 mL緩沖溶液,進(jìn)行系統(tǒng)基線校準(zhǔn)。緩沖溶液換成溶劑,去除溶劑影響。樣品池中溶劑換成2.5 mL的HSA (2.0 mmol·L-1)溶液,在波長(zhǎng)為190～450 nm下進(jìn)行紫外光譜掃描。使用移液槍將40 μL的配合物(50.0 μmol·L-1)分別加入到樣品池和空白池中,每次滴加后,吹打混勻,充分與HSA反應(yīng)5 min,進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.5.3 熒光光譜

樣品池中加入2.5 mL的 HSA(5 μmol·L-1)溶液,尋找到最優(yōu)激發(fā)波長(zhǎng)(λex=295 nm)。在波長(zhǎng)范圍 220～450 nm中掃描。用移液槍向樣品池中加20 μL的配合物(1.2 mmol·L-1)溶液,與HSA充分反應(yīng)5 min后,進(jìn)行熒光光譜掃描。

1.6 Cell Counting Kit-8(CCK-8)實(shí)驗(yàn)

將LO2、HepG2、Hela和A549細(xì)胞復(fù)蘇、傳代后,配制成細(xì)胞懸液,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入5×103個(gè)細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h,每孔加入100 μL配合物溶液,培養(yǎng)48 h,棄上清液,用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞后用CCK-8染色,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(λ=450 nm),每種濃度設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的結(jié)構(gòu)

2.1.1 紅外光譜分析

2.1.2 晶體結(jié)構(gòu)分析

配合物部分鍵長(zhǎng)、鍵角列于表2,分子晶體結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 配合物的晶體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Crystal structure of complex

2.2 配合物的紫外與熒光性質(zhì)

2.2.1 紫外光譜分析

由圖3紫外吸收譜圖顯示,在200～700 nm,當(dāng)配合物濃度減小,紫外吸收強(qiáng)度降低,且最大吸收峰有藍(lán)移現(xiàn)象。圖4顯示波長(zhǎng)308 nm處為配合物的最大吸收峰,261 nm處為對(duì)氯苯甲酸的最大吸收峰,251 nm處為三水硝酸銅的最大吸收峰。從圖中可以看出,配合物的最大吸收峰出現(xiàn)在不同于原料的位置,可以推斷合成了新物質(zhì)。

圖3 不同濃度配合物的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)DFig.3 UV-Vis absorption spectra of complexes with different concentrations

圖4 原料與配合物的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)DFig.4 UV-Vis absorption spectra of raw material and complex

2.2.2 熒光光譜分析

從圖5可以看出,配合物的最大吸收峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)266 nm處,三水合硝酸銅最大吸收峰在波長(zhǎng)290 nm處,對(duì)氯苯甲酸最大吸收峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)294 nm處。配合物跟原料的最大吸收峰波長(zhǎng)所處位置及峰型不同,進(jìn)一步說(shuō)明合成了新物質(zhì)。從圖6中可以看出,配合物濃度越小,在最大吸收峰處的熒光強(qiáng)度越大。

圖5 原料與配合物的熒光圖Fig.5 Fluorescence spectra of raw material and complex

2.3 配合物對(duì)HSA的互相作用

2.3.1 紫外光譜分析

HSA含有α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲,會(huì)產(chǎn)生紫外吸收。α-螺旋發(fā)生變化與酪氨酸殘基、色氨酸殘基和苯并氨酸殘基中的共軛雙鍵發(fā)生π-π*躍遷,使金屬配合物與HSA作用后紫外光譜發(fā)生峰位移動(dòng)、強(qiáng)度變化等,可以根據(jù)該現(xiàn)象來(lái)判斷配合物是否與HSA發(fā)生相互作用[18]。由圖7可知,強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在267 nm處,當(dāng)配合物的濃度增大時(shí),紫外吸收強(qiáng)度降低,由此可見(jiàn),配合物與HSA發(fā)生了相互作用。

圖7 不同濃度配合物與HSA作用的紫外可見(jiàn)吸收?qǐng)DFig.7 UV-Vis absorption spectra of the interaction between the complex with different concentrations and HSA

2.3.2 熒光光譜分析

HSA的熒光性源于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基,當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為 295 nm 時(shí),HSA 的熒光全部來(lái)源于色氨酸殘基[19]。由圖8可以看到,HSA在強(qiáng)吸收峰326 nm處。吸收強(qiáng)度隨著配合物濃度增大而降低。如圖9所示,在不同的r值下,初始熒光強(qiáng)度為90.64%,配合物加了400 μL后,體系中的熒光強(qiáng)度為60.03%,HSA的熒光強(qiáng)度減弱值為30.61%。根據(jù)公式(1)和(2)[20-21]:

圖8 不同濃度配合物與HSA作用的熒光圖Fig.8 Fluorescence spectra of the interaction between the complex with different concntrations and HSA

圖9 (F/F0×100%)-r的關(guān)系圖Fig.9 Relationship of (F/F0×100%) and r

F0/F=1+Kqτ0[C]=1+Ksv[C]

(1)

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[C]

(2)

式中:F0和F分別表示未加入和加入配合物時(shí)EB-CT-DNA體系的熒光強(qiáng)度,[C]表示配合物濃度,Ka是結(jié)合常數(shù),n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù),τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子的平均壽命,猝滅常數(shù)Ksv=5.78×103L·mol-1,猝滅速率常數(shù)Kq=Ksv×108=5.78×1011L·mol-1·s-1,Kq>2×1010L·mol-1·s-1,可知配合物能夠靜態(tài)猝滅HSA熒光的熒光強(qiáng)度。如圖8所示,得出配合物和HSA的結(jié)合常數(shù)Ka=1.38×102L·mol-1,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=0.592。

2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

配合物{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}對(duì)A549、Hela、HepG2和LO2細(xì)胞作用48 h后細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)值見(jiàn)表3。從表中可以看出,配合物對(duì)4種細(xì)胞都具有抗增殖作用,相同條件下,{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}對(duì)3種癌細(xì)胞的抗增殖效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于配體pcba,抗癌效果跟順鉑相當(dāng),對(duì)人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞毒性比順鉑小,對(duì)Hela、A549、HepG2的細(xì)胞抑制毒性效果比文獻(xiàn)報(bào)道的同類銅配合物好[19]。{[Cu(pcba)2]2·(MeOH)2}對(duì)4種細(xì)胞的毒性作用順序?yàn)镠ela>A549>HepG2>LO2。

表3 配合物的對(duì)LO2、HepG2、Hela和A549細(xì)胞的IC50Table 3 IC50 of complex against LO2, HepG2, Hela, and A549 cells

3 結(jié) 論