張申平，周 靜

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院 國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（乳及乳制品檢測與監(jiān)控技術(shù)），上海 200233）

牛奶是鈣和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的良好來源，重視牛奶在飲食中的健康促進(jìn)作用已成為全球共識(shí)，人們在關(guān)注牛奶營養(yǎng)的同時(shí)對(duì)牛奶中農(nóng)藥殘留等有害物質(zhì)的關(guān)注度也越來越高。農(nóng)藥通過食物鏈蓄積，可能會(huì)對(duì)生物體的生理、免疫功能產(chǎn)生影響，并可能致畸、致癌、致基因突變［1-3］。牛奶中殘留的農(nóng)藥主要來自飼草料、飲水、圈舍消毒、奶牛寄生蟲、真菌、細(xì)菌防治用藥，尤其在圈舍中使用的農(nóng)藥易污染擠奶設(shè)備，導(dǎo)致殘留的農(nóng)藥進(jìn)入牛奶原料乳。歐盟、日本、美國、澳大利亞等國家或地區(qū)持續(xù)關(guān)注牛奶中的農(nóng)藥殘留情況，并不定期修訂牛奶中農(nóng)藥的最大殘留限量值（MRLs），限量值愈發(fā)嚴(yán)格［4-5］。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》GB 2763 標(biāo)準(zhǔn)歷經(jīng)5 次修訂，對(duì)牛乳中農(nóng)藥殘留的限量種類逐步增加，2014 版僅規(guī)定了奶中狄氏劑的殘留限量，2019 版制定了牛乳中116 種農(nóng)藥的最大殘留限量值，2021 版將牛乳中農(nóng)藥殘留限量擴(kuò)展至139 種。同時(shí)GB 2763-2021［6］對(duì)牛乳中滅線磷的限量值低至0.01 mg/kg，特丁硫磷低至0.01 mg/kg，氯丹低至0.002 mg/kg，限量值的嚴(yán)格程度逐步趨向發(fā)達(dá)國家和地區(qū)。但GB 2763-2021規(guī)定的牛乳中139種農(nóng)藥殘留，僅67種農(nóng)藥指定了檢測方法，50%以上的農(nóng)藥缺乏標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。

我國發(fā)布的測定牛乳中農(nóng)藥多殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法是GB/T 23210-2008［7］《牛奶和奶粉中511種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》，但由于GC-MS 的靈敏度較低，加之基質(zhì)效應(yīng)的影響導(dǎo)致部分農(nóng)藥的檢出限難以滿足GB 2763-2021的限量值要求。文獻(xiàn)報(bào)道的牛乳中農(nóng)藥殘留檢測主要采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，結(jié)合固相萃取小柱凈化［8-9］、低溫冷凍液液萃?。?0-11］、分散固相萃?。?2］、凝膠滲透［13］和QuEChERS［14-16］等前處理方法。其中QuEChERS法具有操作簡單、快速高效等優(yōu)點(diǎn)，適用于快速處理大批量農(nóng)藥多殘留樣品。雖然現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)中多采用乙腈處理牛乳樣品，在沉淀蛋白質(zhì)的同時(shí)可降低提取液中的脂肪含量，但牛乳富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、磷脂，且農(nóng)藥殘留量低，進(jìn)入提取液中的少量脂肪仍會(huì)影響測定，導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。因此，開發(fā)牛乳中農(nóng)藥多殘留的檢測方法，明確各種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)于研究牛乳中農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜可以區(qū)分基質(zhì)中的雜質(zhì)和色譜共流物，有利于痕量化合物的分析，降低了對(duì)樣品前處理的要求，利用全掃描（Full MS）模式采集的數(shù)據(jù)文件可開展回顧性數(shù)據(jù)分析。本文在前期研究的基礎(chǔ)上［17］，針對(duì)GB 2763-2021對(duì)牛乳中農(nóng)藥殘留的限量情況，選取在毛細(xì)管色譜柱上有較好保留能力的71 種農(nóng)藥（包括吡唑萘菌胺、氟啶蟲胺腈等未指定檢測方法的農(nóng)藥），采用改進(jìn)的QuEChERS 凈化結(jié)合氣相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜（GC-Exactive Orbitrap MS）法對(duì)牛乳中上述71 種農(nóng)藥進(jìn)行定量篩查，為保障乳品質(zhì)量安全提供了技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜、TG-5Sil MS 氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Thermo Fisher公司）；PL2002電子天平（精度0.01 g，瑞士Metter Toledo 公司）；MS104S電子天平（精度0.000 1 g，瑞士Metter Toledo 公司）；Reax Control 渦旋振蕩器（德國Heidolph 公司）；Centrifuge 5804 離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

71 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L，乙腈或甲醇）購自天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、丙酮、正己烷、甲酸（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）（40～60 μm，美國Dikma 公司）；正構(gòu)烷烴（1 000 mg/L，C7～C40，北京曼哈格生物科技有限公司），微孔濾膜（0.22 μm，上海普譽(yù)科貿(mào)有限公司）。

供試樣品：巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、高溫殺菌乳、調(diào)制乳購于上海市徐匯區(qū)的多個(gè)超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：將71 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分為Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，移取一定量各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮-正己烷（體積比1∶1，下同）定容成2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存于-20 ℃冰箱中。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取外環(huán)氧七氯，用丙酮-正己烷溶解定容并逐級(jí)稀釋為10 mg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液，保存于-20 ℃冰箱中。

空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白樣品的提取液配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）牛乳樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 1.0%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈、4.0 g 無水硫酸鎂、1.0 g 氯化鈉及1 顆陶瓷均質(zhì)子，以300 r/min 振搖10 min，在-20 ℃冰箱中冷凍20 min，以4 000 r/min 離心2 min，轉(zhuǎn)移全部上清液至含有1.0 g無水硫酸鎂、400 mg C18和100 mg PSA 的離心管中，渦旋混勻5 min，以4 000 r/min 離心2 min。準(zhǔn)確吸取2 mL 凈化后的上清液至15 mL 離心管中，40 ℃下氮吹至近干，用丙酮-正己烷溶解定容至1 mL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后測定。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：TG-5Sil MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min 升至90 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min 升至180 ℃，保持1.5 min，以5 ℃/min 升至280 ℃，再以10 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速：1.20 mL/min；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.4.2 質(zhì)譜條件電子轟擊源：70 eV；傳輸線溫度：260 ℃；離子源溫度：280 ℃；溶劑延遲：5 min；掃描模式：Full MS。每個(gè)農(nóng)藥選取3 個(gè)特征碎片離子，選取其中信號(hào)最強(qiáng)的離子作為定量離子，其余作為定性離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

GB 2763-2021規(guī)定了牛乳中有機(jī)氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、雜環(huán)類等極性和溶解度差異較大的多種類農(nóng)藥的最大殘留限量值，因此提取溶劑需能兼顧對(duì)多種農(nóng)藥的提取效果。比較了乙腈［18-19］、丙酮［20］、正己烷［21］、乙酸乙酯［22-23］、甲醇［24］、酸化乙腈［14］、酸化甲醇［25］、乙腈-水［10］等提取溶劑對(duì)多種農(nóng)藥的提取效果，正己烷、丙酮多用于有機(jī)氯農(nóng)藥的提取，乙酸乙酯對(duì)滴滴涕（59.1%）、聯(lián)苯菊酯（62.5%）的提取效率較低［20］，甲醇對(duì)六六六（57.4%）的提取效率較低［24］。相比而言，乙腈對(duì)滴滴涕（88.1%）和六六六（93.7%）的提取效率較高［17］，同時(shí)乙腈可充分沉淀牛乳中的蛋白質(zhì)，且對(duì)牛乳中脂質(zhì)等雜質(zhì)的溶解度低，可有效地降低樣品雜質(zhì)對(duì)儀器的污染。雖然大部分研究中以乙腈或酸化乙腈作為提取溶劑，但根據(jù)待測農(nóng)藥種類的不同，乙腈中加入甲酸、乙酸、三氯乙酸［7］的體積分?jǐn)?shù)有所不同。實(shí)驗(yàn)考察了甲酸（FA）體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%的乙腈（ACN）溶液對(duì)牛乳中71種農(nóng)藥的提取效果（表1）。結(jié)果顯示：當(dāng)甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1%和0.5%時(shí)，農(nóng)藥的回收率均較低，當(dāng)甲酸的體積分?jǐn)?shù)增至1.0%時(shí)，農(nóng)藥的回收率明顯增加，回收率在80%～120%之間的農(nóng)藥達(dá)到57個(gè)。但當(dāng)甲酸的體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，牛乳中其他雜質(zhì)的質(zhì)子化幾率也隨之增加，導(dǎo)致基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)較強(qiáng)，當(dāng)甲酸的體積分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，回收率大于120%的農(nóng)藥達(dá)到23 個(gè)。根據(jù)王敬等［4］的報(bào)道，在提取過程中加入斜切面柱狀陶瓷均質(zhì)子能有效防止樣品結(jié)塊，增加提取溶劑與樣品的接觸面積。本實(shí)驗(yàn)最終采用1.0% 甲酸-乙腈為提取溶劑，同時(shí)加入1顆陶瓷均質(zhì)子以提高農(nóng)藥的提取效果。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸-乙腈對(duì)牛乳中71種農(nóng)藥的提取效果（n=3）Table 1 Spiked recoveries of 71 pesticides in milk extract with different volume fraction formic acid-acetonitrile solvents（n=3）

2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS 法利用吸附劑與樣品提取液中雜質(zhì)的相互作用除去提取液中的雜質(zhì)，達(dá)到減弱基質(zhì)效應(yīng)的目的［26］。常用的凈化劑有C18、PSA、石墨化碳黑（GCB）、無水MgSO4。PSA 和C18可除去牛乳中的脂肪、有機(jī)酸、糖類等物質(zhì)，GCB 對(duì)色素和某些平面結(jié)構(gòu)化合物具有吸附作用，無水MgSO4可降低提取液中水的含量，減少水分對(duì)毛細(xì)管色譜柱的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)存在較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，導(dǎo)致部分農(nóng)藥的回收率大于120%，因此考慮使用C18、PSA 降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。當(dāng)僅使用C18時(shí)，農(nóng)藥的回收率見圖1，C18用量由200 mg 增至400 mg 時(shí)，回收率大于120%的農(nóng)藥個(gè)數(shù)明顯減少，回收率為80%～120%的農(nóng)藥增至61個(gè)；但當(dāng)C18用量進(jìn)一步增至500 mg時(shí)，可能由于過量的C18會(huì)吸附農(nóng)藥，使得32個(gè)農(nóng)藥的回收率低于80%。因此確定C18的用量為400 mg，在此基礎(chǔ)上考察了PSA 用量對(duì)農(nóng)藥回收率的影響（圖2）。發(fā)現(xiàn)當(dāng)PSA 的用量為100 mg 時(shí)，回收率處于80%～120%之間的農(nóng)藥個(gè)數(shù)最多，達(dá)到60個(gè)；當(dāng)進(jìn)一步增加PSA 的用量時(shí)，會(huì)出現(xiàn)與C18相同的過度吸附情況。無水MgSO4的用量參考GB/T 23210-2008［7］，當(dāng)稱樣量為5.0 g 時(shí)，無水MgSO4的用量為1.0 g。因此，實(shí)驗(yàn)確定向提取液中加入400 mg C18、100 mg PSA、1.0 g無水MgSO4，并立即渦旋混勻。

圖1 C18用量對(duì)71種農(nóng)藥回收率的影響（n=3）Fig.1 Effect of C18 dosage on recoveries of 71 pesticides （n=3）

圖2 C18用量為400 mg時(shí)PSA用量對(duì)71種農(nóng)藥回收率的影響（n=3）Fig.2 Effect of PSA dosage on recoveries of 71 pesticides with 400 mg C18（n=3）

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的確定

信息完善的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物定性至關(guān)重要。歐盟EC/657/2002 關(guān)于質(zhì)譜定性要求每個(gè)化合物必須具有4 個(gè)確證點(diǎn)（IP），高分辨質(zhì)譜對(duì)精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行全掃描測定，每個(gè)離子可被定義為2 個(gè)確證點(diǎn)，1 個(gè)定量離子和1 個(gè)輔助定性離子的確證點(diǎn)即可達(dá)到4 個(gè)，從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)定量和定性確證［27-28］。

靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜Full MS 模式采集的數(shù)據(jù)文件具有可回顧性，在儀器方法中無需預(yù)先設(shè)定待測農(nóng)藥的碎片離子等信息，適合進(jìn)行農(nóng)藥多殘留分析。本文對(duì)100 μg/L的71種農(nóng)藥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行Full MS 掃描，同步采集正構(gòu)烷烴（C7～C40）的保留時(shí)間。利用解卷積技術(shù)獲得質(zhì)譜圖，選擇強(qiáng)度最強(qiáng)的離子作為定量離子，選擇2～5 個(gè)碎片離子作為特征碎片離子，確保每個(gè)農(nóng)藥至少有6 個(gè)確證點(diǎn)，同時(shí)將保留時(shí)間和碎片離子信息導(dǎo)出至database 文件，獲得農(nóng)藥的高分辨質(zhì)譜信息庫。數(shù)據(jù)庫還包含同位素信息［29］，如氯元素有35Cl 和37Cl 兩種形式，豐度比約為3∶1，原子量相差1.997 05 Da，其比例關(guān)系也可用于定性分析。圖3 為71 種農(nóng)藥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/L）的總離子流（TIC）圖。

圖3 71種農(nóng)藥混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/L）的總離子流圖Fig.3 TIC chromatogram of 71 pesticides in mixed matrix standard solution （100 μg/L）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛乳提取液不凈化時(shí)，有61種農(nóng)藥的回收率大于120%，存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)很難徹底消除，現(xiàn)有研究中通過進(jìn)樣前稀釋、同位素內(nèi)標(biāo)校正、內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正、加入分析保護(hù)劑等方法［30-33］減弱基質(zhì)效應(yīng)。本研究利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以外環(huán)氧七氯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測定，可以很好地解決基質(zhì)干擾。

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

定性測定中，目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)色譜峰保留時(shí)間的相對(duì)誤差在±2.5%以內(nèi)，特征碎片離子的質(zhì)量數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的相對(duì)誤差在±5×10-6以內(nèi)。在基于精確質(zhì)量數(shù)定量的高分辨質(zhì)譜分析中，由于提取的色譜圖基線噪音極低，因此采用信噪比方法無法定義檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）［28］。本文采用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至儀器所能檢出的最低濃度，將該濃度確定為方法的檢出限，以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)作為定量下限。利用空白牛奶提取液對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，配制成質(zhì)量濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 μL 外環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)溶液，采用本方法進(jìn)行測定。以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積與外環(huán)氧七氯峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，甲萘威、滅蠅胺、2 甲4 氯鈉、氧樂果、咪鮮胺的線性范圍為10.0～200.0μg/L，其余66 種農(nóng)藥的線性范圍均為5.0～200.0 μg/L。71 種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)（r）均不低于0.99，精確質(zhì)量數(shù)偏差均不大于2.55×10-6，檢出限為1.0～2.0 μg/kg，定量下限為5.0～10 μg/kg。

2.6 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

利用空白牛乳樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為0.01、0.02、0.10 mg/kg，渦旋混勻后靜置1 h，按照“1.3”方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。71種農(nóng)藥的平均回收率為59.6%～117%，RSD為1.9%～13%，除甲萘威（59.6%）的回收率較低外，其余農(nóng)藥滿足GB/T 27404-2008［34］《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》對(duì)回收率的要求。

表2 71種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限、定量下限、平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 MS parameters，correlation coefficients（r），LODs，LOQs，average recoveries and RSDs（n=6）of the 71 kinds of pesticides and internal standard compound

2.7 實(shí)際樣品檢測

采用本方法分析122份牛乳樣品中71種農(nóng)藥的殘留情況，牛乳樣品包括27份巴氏殺菌乳、81份超高溫滅菌乳、4 份調(diào)制乳、10 份高溫殺菌乳。在2 份超高溫滅菌乳中檢出4，4'-DDE，檢出率為1.6%，檢出值均低于方法定量下限，其他農(nóng)藥均未檢出。

3 結(jié) 論

本文采用QuEChERS 凈化結(jié)合GC-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)，建立了牛乳中71 種農(nóng)藥的快速篩查和定量檢測方法。該方法操作簡單，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性好，已用于大批量實(shí)際樣品檢測，為確保乳品質(zhì)量安全提供了準(zhǔn)確可靠的檢測手段。