仝凱旋，常巧英，謝瑜杰，吳興強，范春林，陳 輝

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品質(zhì)量與安全），北京 100176）

在奶牛養(yǎng)殖過程中，獸藥被用于保護牲畜免受真菌或疾病的侵害［1］。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)，2018 年全球牲畜數(shù)量已達到312 億頭［2］。正確使用獸藥可有效促進牲畜生長，但一些不法分子為追求利益，亂用和濫用藥物使其在動物體內(nèi)積累，對牛奶質(zhì)量、工藝特性、乳制品質(zhì)量有不良影響。而一些獸藥具有熱穩(wěn)定性，很難通過熱處理完全破壞［3］，其可通過牲畜轉(zhuǎn)移到食物鏈中，人們長期食用含獸藥殘留的奶制品會對人體產(chǎn)生潛在毒性作用。為了保障消費者的合法權(quán)益，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定了畜產(chǎn)品中獸藥殘留的嚴(yán)格監(jiān)管制度［4］。但獸藥種類繁多，并且國家制定食品中獸藥最大殘留限量（MRL）越來越低，因此實現(xiàn)不同類別獸藥高通量快速檢測越來越富有挑戰(zhàn)性［5］。

對于獸藥多殘留分析，液相色譜-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS）數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)開發(fā)技術(shù)的進步使其成為篩選各種小分子危害污染物的有力工具。目前已有多種篩查和定量方法被報道，包括使用液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（LC-Q TOF/MS）［2，6-7］和LC-Q Orbitrap/MS［1，8-9］。HRMS 使用高靈敏度的全掃描采集模式，加上高分辨率（＞50 000 FWHM）和高質(zhì)量精度（＜5 ppm），使其在多類化合物分析和回顧性分析上具有獨特的優(yōu)勢［10］。Sun等［1］基于LC-Q Orbitrap/MS 報道了一種集合數(shù)據(jù)依賴采集和數(shù)據(jù)獨立采集的方法，將該方法分別應(yīng)用于牛奶、番茄和玉米中農(nóng)藥、獸藥、真菌毒素的快速測定，對比其他采集方法，該方法具有更高的重現(xiàn)性，并可以有效降低假陽性結(jié)果。在使用強大分析工具的同時，還要開發(fā)高效和廣泛的前處理技術(shù)降低基質(zhì)干擾和儀器的損耗，QuEChERS 方法應(yīng)用范圍廣泛，可用于非極性到強極性目標(biāo)化合物的樣品制備。Desmarchelier 等［11］將QuEChERS 技術(shù)成功應(yīng)用于動物原料中獸藥多殘留的驗證，驗證的105 種獸藥假陰性率和假陽性率均低于5%。Zhang 等［12］報道了改進的QuEChERS 方法提取牛奶中90 種獸藥，并將該方法應(yīng)用于不同類型牛奶樣品。一步式QuEChERS 方法可以通過全自動儀器快速完成樣品前處理，且平行性好，Wang等［13］已將該方法應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留篩查中。目前食品監(jiān)測技術(shù)的趨勢是將各類污染物組合到一個程序中，因此開發(fā)高分辨質(zhì)譜同時篩查和定量多類獸藥的檢測方法具有重要意義。

本研究旨在建立一種改進的QuEChERS 前處理方法，對緩沖液、提取液、萃取鹽和凈化填料進行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上使用一步式QuEChERS 前處理系統(tǒng)結(jié)合LC-Q Orbitrap/MS 實現(xiàn)生牛乳中15 類153種獸藥的快速篩查與確證。對該方法的篩查限、定量下限、基質(zhì)效應(yīng)、回收率和精密度進行驗證，結(jié)果令人滿意，方法已成功應(yīng)用于實際生牛乳樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜-Q-Exactive靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；N-EVAP112 氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates 公司）；SR-2DS 型水平振蕩器（日本TATEC 公司）；KDC-40 低速離心機（中國安徽中佳公司）；SiO-6512 QuEChERS自動樣品制備系統(tǒng)（北京本立科技有限公司）。

153 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（天津阿爾塔科技有限公司），純度均大于95%，其中磺胺類獸藥27 種，喹諾酮類25種，皮質(zhì)類固醇類22種，咪唑類16種，受體激動劑類14種，殺蟲劑類10種，大環(huán)內(nèi)酯類7種，生物堿類5種，酰胺醇類5種，四環(huán)素類3種，丁酰苯類2種，吩噻嗪類2種，喹喔啉類1種，苯二氮卓類1 種，其他類獸藥13 種；甲醇、乙腈、甲苯（色譜級，上海安譜實驗科技有限公司）；甲酸、乙酸銨（質(zhì)譜級，美國Honeywell公司）；C18、PSA、Z-sep（美國Agilent Technologies）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

購買的標(biāo)準(zhǔn)品有粉末或標(biāo)準(zhǔn)溶液，固體標(biāo)準(zhǔn)品需稱取適當(dāng)質(zhì)量，根據(jù)各類獸藥的性質(zhì)用不同溶劑超聲溶解后配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃冷藏避光保存。移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇、乙腈或水稀釋成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃冷藏避光保存。

1.3 提取與凈化

一步式QuEChERS 樣品制備過程如下：稱取樣品2 g（精確至±0.01 g），置于整合套管中，加入6 mL Na2EDTA-McIlvaine 緩沖溶液、10 顆鋯珠、10 mL 1%乙酸乙腈、4 g 無水硫酸鈉、1 g 氯化鈉，將含900 mg無水硫酸鈉、30 mg PSA和90 mg C18的整合套管內(nèi)管擰好后，按重量對稱放入QuEChERS自動樣品制備系統(tǒng)中，設(shè)置振蕩轉(zhuǎn)速4 000 r/min，離心轉(zhuǎn)速4 500 r/min，時間300 s，重復(fù)2次。程序運行完畢后取內(nèi)管2 mL 上清液于干凈試管中，氮吹至近干，加入1 mL 乙腈-水溶液（50∶50，體積比）定容，超聲混勻，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后，待測。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

Agilent Eclipse plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm，Agilent Technologies）色譜柱；柱溫30 °C，進樣量5 μL；流動相A 為0.1%甲酸水溶液；B 相為乙腈；梯度洗脫程序： 0 min：2% B；0～1.8 min：2%～15% B；1.8～3.5 min：15%～20% B；3.5～6 min：20%～25% B；6～7 min：25%～30% B；7～11 min：30%～35% B；11～13.5 min：35%～55% B；13.5～16 min：55%～85% B；16～20 min：85%～100% B；20～25.1 min：100%～2% B；25.1～28 min：2%～0% B；流速為0.5 mL/min。

正離子模式：噴霧電壓：3 kV；毛細管溫度：325 ℃；加熱器溫度：350 ℃；鞘氣：40 arb；輔助氣：10 arb；負離子模式：噴霧電壓：-2.5 kV；毛細管溫度：325 ℃；加熱器溫度：350 ℃；鞘氣：40 arb；輔助氣：10 arb。

掃描模式：Full MS/dd-MS2；掃描范圍：m/z80～1 100；一級全掃描：分辨率70 000 FWHM，C-trap最大容量（AGC target）為1×106，C-trap最大注入時間為200 ms；數(shù)據(jù)依賴二級子離子掃描（dd-MS2）：分辨率：17 500 FWHM，C-trap 最大容量（AGC target）為2×105，C-trap 最大注入時間為100 ms；循環(huán)次數(shù)：5；歸一化碰撞能量：20%、40%、60%；動態(tài)排除：8 s。153 種獸藥的名稱、保留時間（tR）、CAS號、加和離子形式、定量及定性離子精確質(zhì)量數(shù)等信息見表1。

表1 生牛乳中153種獸藥的質(zhì)譜特性及驗證結(jié)果Table 1MS characteristics and validation results of 153 veterinary drugs in raw milk

1.5 方法驗證

使用TraceFinder 軟件對樣品的加合離子和二級碎片離子的精確質(zhì)量和保留時間與自建精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫進行匹配，保留時間偏差介于±0.5 min，離子質(zhì)量數(shù)偏差介于±5 ppm，需至少加合離子和1 個碎片離子檢出，方滿足定性篩查要求；使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進行定量分析。根據(jù)EU/2021/808歐盟法規(guī)對篩查和定量方法進行驗證［14］。對于篩查方法，可基于定性方法中的SDL 建立一定濃度水平上目標(biāo)分析物的置信度，基本的驗證應(yīng)該包括對20個加標(biāo)樣品進行分析，其中至少95%的樣品中檢測到分析物的最低添加水平即為該分析物的篩查限（SDL）。定量下限（LOQ）是回收率和精密度均令人滿意時的最小加標(biāo)濃度。通過對空白基質(zhì)做10 點標(biāo)準(zhǔn)曲線，涵蓋所有化合物線性范圍，最終選取5 點標(biāo)準(zhǔn)曲線以線性系數(shù)（r2）評估其線性關(guān)系。為評估方法的準(zhǔn)確度和精密度，在1倍LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ 3個加標(biāo)水平下進行6組回收率實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液pH值優(yōu)化

油水分配系數(shù)（logP）是表征化合物溶解度的重要參數(shù)，是基于土壤吸附系數(shù)歸一化到有機碳含量（logKoc）的模擬值［15］，logP值越小表明該化合物極性越強，水溶性越好，各類獸藥化合物的logP值從Chemispider 網(wǎng)站查詢（圖1）。結(jié)果顯示，超過90%的磺胺類和喹諾酮類獸藥的logP＜2，因此考慮加入適量水提高各類獸藥的提取效率。加入緩沖溶液不僅可以引入水體系，還可通過調(diào)節(jié)pH 值改變獸藥的電離狀態(tài)，影響其在有機相中的分配，因此緩沖溶液是更優(yōu)的選擇。Na2EDTA-McIlvaine作為緩沖溶液時可阻止四環(huán)素、喹諾酮類藥物與金屬離子的絡(luò)合作用，從而提高獸藥回收率［16］。本研究采用Na2EDTA-McIlvaine作為緩沖液，并優(yōu)化了pH 值為4.0、7.0、9.0時的提取效率。如圖2所示，緩沖液pH 4.0時目標(biāo)獸藥符合回收率（REC）要求的個數(shù)最多，其中吩噻嗪類藥物中的異丙嗪、氯丙嗪，磺胺類藥物中的酞磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶等，喹諾酮類藥物中的沙拉沙星、司帕沙星等獸藥在低pH 值下的回收率效果更好，而其他幾類獸藥的回收率受pH 值的影響不明顯。方法的精密度在3 個pH 值下符合要求（RSD≤20%）的獸藥個數(shù)相當(dāng)，綜合考慮選擇pH 4.0為最優(yōu)酸堿度。

圖1 153種獸藥化合物的logP值Fig.1 logP values of 153 veterinary drug compounds

圖2 不同緩沖液pH值對獸藥回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的影響Fig.2 Effects of different buffer pH values on recoveries and RSDs of veterinary drugs

2.2 萃取溶劑體積優(yōu)化

由于前處理過程中需要同時萃取不同理化性質(zhì)的獸藥化合物，因此萃取溶液需具有通用性。Abdallah 等［17］對一系列獸藥殘留萃取溶劑進行萃取實驗，發(fā)現(xiàn)乙腈對多類獸藥的萃取效果最好，甲醇的萃取效果最差。在乙酸等改性劑的作用下，乙腈有良好的親水親脂性，同時還有沉淀蛋白的作用，不加入乙酸會提高樣品中游離磺胺類藥物的提取效率，但會導(dǎo)致喹諾酮類藥物的回收率降低［18］。Zhang 等［12］研究發(fā)現(xiàn)萃取溶劑加入乙酸后會通過影響多類獸藥的電離，從而影響萃取效率，且以乙腈中加入1%乙酸酸化后的萃取效果最好。因此，本研究使用1%乙酸酸化乙腈作為萃取溶劑，并對比不同萃取溶劑體積（10、16、20 mL）對獸藥回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶劑體積為10 mL 時效果最佳，符合回收率要求的獸藥占比為83.7%，高于其余兩種溶劑體積（73.2%和76.5%），并且在50 μg/kg 的加標(biāo)水平下，萃取溶劑體積降低會使單位體積獸藥濃度增大，上機濃度隨之增大，出峰峰形更佳，從綠色環(huán)保的角度最終選擇10 mL的1%乙酸酸化乙腈作為最佳萃取溶劑。

2.3 緩沖鹽種類優(yōu)化

用乙腈萃取時可能會在水相和有機相之間產(chǎn)生二元相［19］，需加入萃取鹽使兩相分層并盡可能除去有機相中的水分。在最初的QuEChERS 方法中使用MgSO4和NaCl，但鎂鹽會誘導(dǎo)喹諾酮類藥物的鰲合作用，因此采用Na2SO4代替MgSO4，同時對比了3 類常用萃取鹽組合：傳統(tǒng)QuEChERS組合（4 g Na2SO4+1 g NaCl），AOAC 組合（6 g Na2SO4+1.5 g 乙 酸 鈉），EN 鹽 組 合（4 g Na2SO4+1 g NaCl+1 g 檸檬酸三鈉+0.5 g 檸檬酸二鈉）的萃取效果（見圖3）。結(jié)果顯示，EN 鹽組合對于各類獸藥的回收效果最好，128 種獸藥的回收率在70%～120%范圍內(nèi)，這是由于引入檸檬酸鹽后進一步提高了緩沖作用。Desmarchelier 等［11］的研究也表明不加入檸檬酸鹽的情況下，奶粉提取液中的乙腈相會形成凝膠，不利于下一步操作，實驗最終選擇EN鹽組合作為萃取鹽。

圖3 不同萃取鹽組合對獸藥回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的影響Fig.3 Effects of different extraction salting-out agents on recoveries and RSDs of veterinary drugs

2.4 凈化填料優(yōu)化

生牛乳是較為復(fù)雜的基質(zhì)，含有大量脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及其他干擾物質(zhì)，因此在儀器分析前需進行凈化，降低基質(zhì)對儀器的損耗［20］。一些傳統(tǒng)的吸附劑對各種基質(zhì)的凈化效果很明顯，例如PSA 可有效去除有機酸和糖類，C18可去除脂類，Z-sep 是一種基于氧化鋯基的新型吸附劑，可用于去除脂肪基質(zhì)中的疏水化合物。本實驗主要針對上述3種凈化填料的組合進行優(yōu)化。首先對Z-sep的量進行優(yōu)化，比較了Z-sep 用量為0、15、30、60 mg時獸藥的回收率（如圖4）。結(jié)果顯示，不使用Z-sep 作凈化填料時獸藥的回收效果最好，有131 種獸藥回收率在70%～120%范圍內(nèi)，隨著Z-sep 用量的逐漸增加，回收率合格的獸藥數(shù)量逐漸減少，這是由于Z-sep 在吸附雜質(zhì)的同時對部分獸藥也有一定的吸附效果。對于不同取代基的目標(biāo)化合物，Z-sep 吸附劑的親和能力不同，取代基和吸附劑相互作用強弱可按如下排序：氯化物＜甲酸鹽＜乙酸鹽＜硫酸鹽＜檸檬酸鹽＜氟化物＜磷酸鹽＜氫氧化物［21］。圖5A 和B 分別為Zsep 使用量為0、30 mg 時馬波沙星和沙拉沙星的提取離子流色譜圖（EIC）圖，結(jié)果顯示隨著Z-sep 的加入，兩種獸藥的響應(yīng)強度明顯降低。這是由于這兩種喹諾酮類藥物含有多個—F 和—OH 鍵，使得Z-sep 對此類藥物的吸附性過強，導(dǎo)致回收率降低。隨著Z-sep 用量的增加，馬波沙星的回收率從82.7%降至23.4%，沙拉沙星從90.8%降至26.0%。為提高整體獸藥的回收率，最終考慮不使用Z-sep作為凈化填料。

圖4 不同Z-sep用量對獸藥回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的影響Fig.4 Effects of different Z-sep dosages on the recoveries and RSDs of veterinary drugs

圖5 未使用Z-sep（A）及使用30 mg Z-sep（B）時馬波沙星和沙拉沙星的EIC圖Fig.5 EIC diagrams of marbofloxacin and sarafloxacin without Z-sep（A） and with 30 mg Z-sep（B）

進一步優(yōu)化不同PSA（0、30、60、90 mg）和C18（30、90、150、200 mg）用量對生牛乳的凈化效果和獸藥加標(biāo)回收率情況（圖6）。結(jié)果顯示，PSA 為30 mg 時可使132 種獸藥的回收率在70%～120%范圍內(nèi)，減少或增加PSA 用量均會降低獸藥滿意回收率的數(shù)量；回收率在70%～120%范圍內(nèi)的獸藥數(shù)量則隨C18用量的增加而增多，當(dāng)C18為90 mg 時達到峰值。溶劑樣品和提取后加標(biāo)樣品之間的響應(yīng)差異被稱為絕對基質(zhì)效應(yīng)。進一步考察方法的絕對基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示，生牛乳主要表現(xiàn)為基質(zhì)抑制，不同PSA 用量中，30 mg PSA 的效果最佳，有73.6%的獸藥基質(zhì)效應(yīng)在±20%以內(nèi)；不同C18的用量中，90 mg C18效果最佳，有78.9%的獸藥基質(zhì)效應(yīng)在±20%以內(nèi)，回收率與基質(zhì)效應(yīng)規(guī)律一致，表明該凈化填料組合的凈化效果最優(yōu)。因此，實驗最終選用30 mg PSA 和90 mg C18用于后續(xù)實驗。

圖6 PSA（A）及C18（B）用量對獸藥回收率及基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.6 PSA（A） and C18（B） amounts on recoveries and matrix effects of veterinary drugs

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是由共萃取物對目標(biāo)化合物的電離作用引起，對于各類化合物基質(zhì)效應(yīng)的研究表明，基質(zhì)抑制或增強常常伴隨著分析方法的精密度顯著下降［22］，如果不采取抵消措施，基質(zhì)效應(yīng)會影響方法的準(zhǔn)確性。基質(zhì)效應(yīng)的評價公式為：- 1)×100%，當(dāng)|ME|≤20%時表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，20%＜|ME|≤50%時表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)，|ME|＞50%時表現(xiàn)為強基質(zhì)效應(yīng)［23］。本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行基質(zhì)效應(yīng)評價，磺胺類、皮質(zhì)類固醇類獸藥主要表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，喹諾酮類則主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)。所考察的獸藥中，84.8%的獸藥表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，10.5%的獸藥表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)，其中主要包括磺胺二甲嘧啶、磺胺異唑等磺胺類藥物，另有4.7%的獸藥表現(xiàn)為強基質(zhì)效應(yīng)，表明本方法可有效降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾，增強分析方法的精密度。

2.6 方法學(xué)驗證

在優(yōu)化條件下，按“1.5”考察生牛乳中153 種獸藥的SDL 和LOQ。結(jié)果顯示，153 種獸藥的SDL在0.1～20 μg/kg 范圍內(nèi)，其中超過87.6%的獸藥SDL 小于5 μg/kg；153 種獸藥的LOQ 在0.1～20 μg/kg范圍內(nèi)，其中86.9%的獸藥LOQ 小于5 μg/kg。Chen 等［24］結(jié)合LC-MS/MS 建立了SPE 方法測定生牛乳等基質(zhì)中120種獸藥殘留，所有藥物的LOD 和LOQ 分別為0.5～3.0 μg/kg和1.5～10.0 μg/kg；Deng等［25］使用LC-Q TOF/MS 建立了牛奶中105 種獸藥的篩查和定量方法，其LOD 和LOQ 分別為0.01～5.96 μg/kg和0.04～18.45 μg/kg。本研究所建立的篩查和定量方法限量較低，有著令人滿意的靈敏度，且全部化合物的靈敏度滿足GB 31650-2019中奶類靶組織的最大殘留限量要求（見表1）。

通過對生牛乳樣品在0.1～200 μg/kg 范圍內(nèi)進行加標(biāo)，利用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線方法計算線性關(guān)系，各化合物線性范圍見表1，結(jié)果表明全部獸藥的r2均在0.99 以上。以1 倍LOQ、2 倍LOQ 和10 倍LOQ的加標(biāo)水平對生牛乳基質(zhì)進行6 次重復(fù)驗證，得到回收率和重復(fù)性結(jié)果，3 個加標(biāo)水平下的回收率在70%～120%范圍內(nèi)獸藥占比分別為92.8%、94.1%和94.8%，且RSD 均在20%以下，表明該方法有令人滿意的準(zhǔn)確度和精密度。

2.7 實際樣品檢測

為進一步驗證該方法的實用性，使用最優(yōu)方法對中國不同省份的32 批生牛乳真實樣本進行檢測，有12批次生乳樣品檢出孕酮，含量范圍為10.5～21.3 μg/kg。

3 結(jié) 論

采用一步式QuEChERS 樣品前處理技術(shù)結(jié)合LC-Q Orbitrap HRMS 建立了生牛乳中15 類153 種獸藥的快速篩查與定量的高通量方法。該方法可在一個套管中完成樣品的提取和凈化，縮短了前處理時間，提高了樣品前處理的平行性。對樣品前處理條件進行優(yōu)化，并在最優(yōu)條件下對方法的篩查限、定量下限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進行驗證。本研究最大限度地減少了人工參與，方法簡單直接，具有很強的實際應(yīng)用價值。