楊詩(shī)媛 ，張 昊 ，胡圖強(qiáng)

（1）湖北醫(yī)藥學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000;2）十堰市人民醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，湖北 十堰 442000）

口腔癌，主要為口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），是第八大最常見的癌癥類型，僅在2018 年就有17 萬(wàn)人死亡，新增病例超過(guò)35 萬(wàn)例[1-2]。OSCC 不僅復(fù)發(fā)率高、侵襲性強(qiáng)，還易對(duì)傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[3]。目前手術(shù)切除為主，放射治療和化學(xué)治療聯(lián)合為輔仍然是口腔鱗狀細(xì)胞癌的首要治療策略。盡管存在廣泛的多種治療模式，但是OSCC 5 a 總生存率仍然比較低，僅占50%～60%[4]。近幾年來(lái)，免疫系統(tǒng)在OSCC 的發(fā)展、侵襲、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[5]，因此需要一種新的治療模式，例如免疫靶點(diǎn)以及天然化合物與常規(guī)化療藥聯(lián)合使用等，以獲得最佳治療效果。綜上所述，探索OSCC 發(fā)生的生物分子機(jī)制、找尋新的治療關(guān)鍵、開發(fā)更有效治療方案、提前預(yù)防OSCC 發(fā)生從而降低患者死亡率迫在眉睫。

自噬是介導(dǎo)各種細(xì)胞代謝物遞送到溶酶體進(jìn)行降解和回收的主要機(jī)制，能維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞器的完整性，其功能對(duì)于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞活力至關(guān)重要[6]。許多研究表明，自噬在不同的階段調(diào)控者腫瘤的成長(zhǎng)、發(fā)展，在癌癥發(fā)展的早期階段，它阻止腫瘤啟動(dòng)，但在完全發(fā)育的成熟腫瘤中，它則保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受各種應(yīng)激刺激[7-9]。在癌癥發(fā)展的晚期階段，由于癌細(xì)胞比正常細(xì)胞有更高的生物能量及營(yíng)養(yǎng)需求，癌細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)自噬在低營(yíng)養(yǎng)和缺氧條件下存活[10]。自噬可以同時(shí)起到抑制腫瘤和促進(jìn)腫瘤的作用，通常取決于腫瘤所處階段和突變背景[6]。

近些年來(lái)，草藥、天然化合物等作為單一療法或與常規(guī)化療藥物聯(lián)合使用，目前研究表明其在治療各種癌癥方面發(fā)揮著一定的作用。扁塑藤素是一種從雷公藤科和馬齒莧科中提取的醌甲酰胺類三萜類化合物[11]，可抗氧、抗炎、抗菌[12]，在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等許多癌癥種類中展現(xiàn)了強(qiáng)大的抗癌活性[13-15]。腫瘤相關(guān)抑制機(jī)制包括細(xì)胞周期停滯、蛋白酶體活性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙等[16]。對(duì)于扁塑藤素在OSCC 中的抗癌機(jī)制，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外關(guān)于這個(gè)問(wèn)題的研究相對(duì)較少。

本實(shí)驗(yàn)以口腔鱗狀細(xì)胞OSCC 細(xì)胞系CAL-27 為研究對(duì)象，將OSCC 細(xì)胞用不同濃度梯度的扁塑藤素干預(yù)，通過(guò)CCK-8 細(xì)胞增殖、集落形成實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡法等一系列實(shí)驗(yàn)探究扁塑藤素對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖與自噬機(jī)制的關(guān)系，并探索其生物分子作用機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人口腔鱗癌CAL-27 購(gòu)自中國(guó)豐暉生物；扁塑藤素中國(guó)源葉生物；雷帕霉素購(gòu)自中國(guó)MCE；高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清FBS 購(gòu)自美國(guó)Hyclone；酶標(biāo)儀購(gòu)自中國(guó)雷杜RT-6100；MAP1-LC3B、BECLI1、PCNA、蛋白印跡系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ChemiDocXRS+，BIO-RAD、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自中國(guó)Boster Bio；CCK-8 檢測(cè)試劑盒、RIPA 蛋白裂解液（強(qiáng)）、PMSF（100 mM）、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）、電化學(xué)發(fā)光液（ECL）購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人口腔鱗癌細(xì)胞系CAL-27（培養(yǎng)條件10%胎牛血清、10%FBS、1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基）置于37℃、95%空氣、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底面積80%～90%需進(jìn)行傳代，第1 次傳代比例為1∶2。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)扁塑藤素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖作用在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按8 000 個(gè)細(xì)胞/孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL-27 細(xì)胞，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L（后續(xù)濃度分組相同）濃度扁塑藤素的培養(yǎng)液，每組5 個(gè)平行重復(fù)。設(shè)置扁塑藤素作用于Cal-27 細(xì)胞時(shí)間為24、48、72 h，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)基與CCK-8 溶液比例為9∶1 混合后培養(yǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)各組OD 值，分析處理數(shù)據(jù)，繪制增殖曲線。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，得出扁塑藤素干預(yù)OSCC 細(xì)胞的半抑制濃度IC50，基于此設(shè)置合適的扁塑藤素濃度范疇。

1.2.3 扁塑藤素對(duì)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響在6 孔板中接種CAL-27，以上述濃度扁塑藤素處理24 h，細(xì)胞在RIPA 緩沖液中溶解，并加入蛋白酶抑制劑，在冰上溶解30 min，冰浴、離心、提取、測(cè)濃度、定量、煮沸、變性；轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（PCNA，1∶2 000），4℃過(guò)夜；孵育二抗（羊抗鼠，1∶5 000），內(nèi)參蛋白β-actin。將ECL 顯色試劑A 液與B 液1∶1 充分混合，均勻加于膜上，于凝膠成像系統(tǒng)中顯影，ImageJ 軟件完成數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 細(xì)胞集落形成檢測(cè)不同濃度扁塑藤素處理人鱗狀細(xì)胞的增殖能力在6 孔板中按1 000 個(gè)/孔細(xì)胞接種狀態(tài)良好的CAL-27 單細(xì)胞懸液，與扁塑藤素聯(lián)合處理。按上述扁塑藤素濃度分組每3d 換一次液，待生長(zhǎng)2 周后可見集落時(shí)終止培養(yǎng)，干燥固定、染色，倒置顯微鏡下記錄細(xì)胞集落數(shù)目并拍照留存。

1.2.5 扁塑藤素處理Cal-27 后總蛋白的提取和Western Blot 檢測(cè)相關(guān)自噬通量方法同“1.2.3”，一抗（MAP1LC3B，1∶500；BECLIN1，1∶5 000），二抗（羊抗兔：1∶5 000）。

1.2.6 CCK-8 法檢測(cè)雷帕霉素（RAPA）以及RAPA聯(lián)合扁塑藤素對(duì)Cal-27 細(xì)胞增殖抑制的影響為進(jìn)一步研究自噬對(duì)扁塑藤素調(diào)節(jié)CAL-27 細(xì)胞增殖抑制的影響，本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置0、62.5、125、250、500、1 000 nmol/L RAPA 濃度培養(yǎng)液，方法同“1.2.2”，使雷帕霉素干預(yù)24 h，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算分析雷帕霉素作用于OSCC 細(xì)胞的最小濃度，并根據(jù)最小雷帕霉素濃度設(shè)置后續(xù)實(shí)驗(yàn)雷帕霉素的濃度。

1.2.7 細(xì)胞集落形成檢測(cè)RAPA 聯(lián)合扁塑藤素處理CAL-27 細(xì)胞后的增殖能力方法同“1.2.4”，分別設(shè)置0、0.6 μmol/L pristimerin、0.6 μmol/L Pri +125 nmol/L RAPA、125 nmol/L RAPA 組，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

1.2.8 RAPA 聯(lián)合扁塑藤素處理CAL-27 細(xì)胞后總蛋白的提取和Western blot 檢測(cè)相關(guān)自噬通量的表達(dá)情況方法同“1.2.3”，分組同“1.2.7”，加入一抗（MAP1LC3B，1∶500；BECLNI1，1∶5 000；PCNA，1∶2 000），二抗（羊抗兔，1∶5 000；羊抗鼠：1∶5 000）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 扁塑藤素對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖活性的影響

2.1.1 不同濃度的扁塑藤素對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖活性的影響檢測(cè)扁塑藤素對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌系CAL-27 作用的結(jié)果，CCK-8 結(jié)果顯示：扁塑藤素抑制CAL-27 細(xì)胞的增殖，并且這種抑制呈時(shí)間-濃度依賴作用，相同時(shí)間段內(nèi)，當(dāng)扁塑藤素濃度的升高，扁塑藤素對(duì)CAL-27 細(xì)胞系的抑制率也在不斷增強(qiáng)，見圖1A。且在同一濃度處理后，培養(yǎng)時(shí)間增加，CAL-27 細(xì)胞系的細(xì)胞抑制也更加顯著（P<0.05），見圖1B。根據(jù)結(jié)果計(jì)算得出CAL-27 的半抑制濃度約為（0.69±0.16）μmmol/L。根據(jù)半抑制濃度分設(shè)各組扁塑藤素濃度：0 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L。

圖1 扁塑藤素抑制口腔鱗狀癌Cal-27 細(xì)胞增殖Fig.1 Pristimerin suppresses proliferation of oral squamous cell carcinoma cell

2.1.2 不同濃度的扁塑藤素對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖能力的影響通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度扁塑藤素處理CAL-27 細(xì)胞24 h 后培養(yǎng)14 d 增殖的長(zhǎng)期毒性作用。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，CAL-27 各實(shí)驗(yàn)組的的細(xì)胞集落形成逐漸減少，并且抑制作用隨著扁塑藤素濃度增加而受到增強(qiáng)，1.0 μmol/L 組的抑制作用更為明顯，見圖2。提示扁塑藤素對(duì)人口腔鱗癌CAL-27 細(xì)胞系的長(zhǎng)期細(xì)胞抑制同上述結(jié)果相一致，存在劑量-時(shí)間關(guān)系。

圖2 扁塑藤素對(duì)口腔鱗狀癌CAL-27 細(xì)胞克隆形成的影響Fig.2 The effect of Pristimerin on clonal formation of oral squamous cell carcinoma cell

2.1.3 扁塑藤素對(duì)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響PCNA是增殖相關(guān)蛋白。為進(jìn)一步說(shuō)明扁塑藤素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)按2.1.1 分組的扁塑藤素分別處理CAL-27 細(xì)胞24 h，收取細(xì)胞蛋白后進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：當(dāng)扁塑藤素濃度升高時(shí)，細(xì)胞增殖蛋白指標(biāo)PCNA 蛋白相較于對(duì)照組表達(dá)量下調(diào)，但0.4 μmol/L 組蛋白表達(dá)量相較于0.2 μmol/L 組有所上調(diào)，提示扁塑藤素可以明顯抑制CAL-27 細(xì)胞增殖（P<0.05），促使細(xì)胞活性下降，見圖3。

圖3 扁塑藤素抑制相關(guān)增殖指標(biāo)PCNAFig.3 Effect of Pristimerin on PCNA expression

2.2 扁塑藤素誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生自噬

運(yùn)用Western blot 檢測(cè)不同濃度扁塑藤素處理CAL-27 細(xì)胞24 h 后，自噬相關(guān)蛋白BECLIN1、LC3B-II、LC3B-I 的表達(dá)量。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組顯示出，BECLIN1 蛋白的表達(dá)水平整體低于對(duì)照組，但0.4 μmol/L 組相較于對(duì)照組略有上升，LC3B-II/LC3B-I 蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組，且隨著扁塑藤素濃度的升高，BECLIN1 和LC3BII/LC3B-I 蛋白的表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），提示扁塑藤素通過(guò)抑制CAL-27 細(xì)胞的自噬來(lái)抑制細(xì)胞的增殖，見圖4，說(shuō)明CAL-27 的自噬可以被扁塑藤素激活，提示扁塑藤素抑制CAL-27 細(xì)胞的自噬。

圖4 扁塑藤素抑制自噬相關(guān)自噬蛋白BECLIN1、LC3B-IILC3B-IFig.4 Pristimerin inhibits apoptosis：BECLIN1and LC3B-II/LC3B-I protein expression

2.3 自噬激活劑雷帕霉素可激活扁塑藤素誘導(dǎo)的自噬機(jī)制

2.3.1 扁塑藤素聯(lián)合RAPA 對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27 增殖活性的影響為進(jìn)一步研究自噬對(duì)扁塑藤素調(diào)節(jié)CAL-27 細(xì)胞增殖抑制的關(guān)系，通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)RAPA 各濃度組62.5、125、250、500、1 000 nmol/L 以及0.6 μmol/L 扁塑藤素聯(lián)合RAPA 處理CAL-27 細(xì)胞24 h 后的OD 值。結(jié)果顯示:不同濃度自噬激活劑RAPA 的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比（未加入RAPA 組），RAPA 各分組的抑制率相較于空白組來(lái)說(shuō)都呈出現(xiàn)了減低，提示RAPA 對(duì)CAL-27 細(xì)胞存在一定的影響，RAPA 可抑制CAL-27 細(xì)胞增殖，而且其抑制率隨RAPA濃度上升稍有增加（P<0.001），見圖5A。隨后，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)0.6 μmol/L 扁塑藤素聯(lián)合各濃度的自噬激活劑RAPA 處理CAL-27 細(xì)胞24 h 后的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示：與0.6 μmol/L 扁塑藤素組相比，62.5 nmol/L RAPA 聯(lián)合0.6 μmol/L扁塑藤素組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5B，說(shuō)明加入自噬激活劑RAPA 可明顯提高細(xì)胞活力。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)也與上述一致，見圖6。提示RAPA 能夠激活細(xì)胞自噬，從而減小扁塑藤素對(duì)細(xì)胞的抑制作用，本研究選擇對(duì)CAL-27 細(xì)胞影響小的62.5 nmol/L RAPA 濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 自噬激活劑RAPA 對(duì)口腔鱗狀癌細(xì)胞的影響Fig.5 Effect of autophagy activator RAPA on oral squamous carcinoma cells

圖6 扁塑藤素聯(lián)合雷帕霉素處理對(duì)口腔鱗狀癌CAL-27 細(xì)胞克隆形成的影響Fig.6 The effect of Pristimerin combined with RAPA on clonal formation of oral squamous carcinoma cells

2.3.2 扁塑藤素聯(lián)合RAPA 處理CAL-27 細(xì)胞24h 后細(xì)胞自噬的作用WB 結(jié)果顯示在CAL-27 細(xì)胞中，聯(lián)合處理組均顯示出BECLIN1 和LC3B 蛋白的表達(dá)水平高于對(duì)照組，扁塑藤素聯(lián)合RAPA 組相較于單純使用扁塑藤素組，BECLIN1 和LC3B 蛋白的表達(dá)水平均有上調(diào)（P<0.05），見圖7。提示RAPA 激活了CAL-27 的自噬，扁塑藤素通過(guò)抑制CAL-27 細(xì)胞的自噬來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。

圖7 雷帕霉素可激活扁塑藤素誘導(dǎo)的自噬機(jī)制Fig.7 RAPA can activate the autophagy mechanism induced by Pristimerin

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中常見的類型之一，它起源于口腔黏膜上皮，由暴露于煙草致癌物、感染人乳頭瘤病毒和飲酒過(guò)度誘發(fā)。目前包括局部及全身治療，局部有手術(shù)、放射治療；全身有靶向、生物、免疫治療等。但其5 a 生存率較低，對(duì)于患者來(lái)說(shuō)存在經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與面部畸形的雙重風(fēng)險(xiǎn)。

抗癌研究熱點(diǎn)之一的中草藥在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及人類健康保健中持續(xù)發(fā)揮著重大作用。有較多研究表明扁塑藤素可對(duì)多種惡性腫瘤發(fā)揮發(fā)病、進(jìn)展發(fā)揮抑制作用。扁塑藤素對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期有抑制作用并且能引發(fā)細(xì)胞凋亡和自噬，可降低乳腺癌細(xì)胞在體外和異種移植物在體內(nèi)的生長(zhǎng)[18]；肺癌易發(fā)生化療耐藥，當(dāng)順鉑聯(lián)合扁塑藤素時(shí)，其可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞敏感性[19]；扁塑藤素可能通過(guò)調(diào)控 MEK/ERK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。因此，探討扁塑藤素對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖潛力的影響及相關(guān)作用機(jī)制，是本研究的重點(diǎn)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)扁塑藤素抑制口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27 增殖，CCK-8 結(jié)果分析扁塑藤素與CAL-27 細(xì)胞呈時(shí)間-濃度依賴關(guān)系，細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與上述一致。

迄今為止，有研究指出自噬參與了以下幾種疾病，包括肌病、神經(jīng)退行性疾病、傳染病、自身免疫性疾病、心臟病、細(xì)胞死亡、衰老和癌癥[21]。其中，自噬蛋白水平在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和進(jìn)展方面起著重要作用[22]。LC3 屬于ATG8 家族，通過(guò)ATG3B 轉(zhuǎn)化為其胞質(zhì)亞型LC1，再與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合形式LC3 II[23]，故LC3 蛋白可以直接監(jiān)測(cè)自噬活性[24]；VPS34 及其結(jié)合物Beclin1 和VPS15 可靶向調(diào)節(jié)自噬，可促進(jìn)自噬小體形成[25]，因此LC3 與Beclin1 蛋白都是自噬相關(guān)特異性指標(biāo)。為了探尋扁塑藤素對(duì)OSCC 中Cal-27 細(xì)胞自噬機(jī)制的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用扁塑藤素分別在調(diào)控相關(guān)自噬通量，激活自噬對(duì)扁塑藤素調(diào)控OSCC 中CAL-27 細(xì)胞發(fā)生增殖抑制作用以及對(duì)相關(guān)自噬通量的影響等3 個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，扁塑藤素可顯著減少CAL-27 的LC3-Ⅱ等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量。這提示扁塑藤素調(diào)節(jié)CAL-27 細(xì)胞自噬是其抑制OSCC 增殖的關(guān)鍵機(jī)制之一。

目前各種合成的自噬調(diào)節(jié)劑，如絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)雷帕霉素（mTOR），已被確定為治療癌癥的首選藥物，包含mTORC1、mTORC2 兩種復(fù)合物，而mTORC1 被雷帕霉素（RAPA）抑制后從而啟動(dòng)自噬，是自噬的強(qiáng)誘導(dǎo)劑[26]。本文檢測(cè)了相關(guān)自噬通量BECLIN1、LC3B-II/LC3B-I 表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)扁塑藤素聯(lián)合RAPA 相較于僅用扁塑藤素處理CAL-27 細(xì)胞其表達(dá)量有所上調(diào)，表明RAPA 可以逆轉(zhuǎn)扁塑藤素對(duì)CAL-27 細(xì)胞的增殖抑制，即激活CAL-27 自噬，且自噬流通暢。最后檢測(cè)了增殖指標(biāo)PCNA，這與上述結(jié)果也是一致的。進(jìn)而證明，扁塑藤素通過(guò)抑制OSCC 自噬導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性減弱。

綜上所述，扁塑藤素可以抑制CAL-27 細(xì)胞的增殖，且隨著扁塑藤素濃度的升高，抑制作用越明顯，這可能與其下調(diào)自噬相關(guān)基因BECLIN1、LC3B-II、LC3B-I 的表達(dá)相關(guān)。本研究初步探討了扁塑藤素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的抑制作用及其自噬機(jī)制，這可能是一種潛在的抗癌策略，但本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系單一、缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)佐證，還需大量的自噬檢測(cè)技術(shù)支持驗(yàn)證。