莊爾俊,陳遠騰,尹雪宇,李海龍,2*

(1.大理大學基礎醫(yī)學院,云南大理 671000;2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室,云南大理 671000)

內(nèi)阿米巴原蟲(Entamoebaspp.)是一種能夠感染人、家畜和野生動物的單細胞原蟲,在全世界范圍均有流行[1-2]。大多數(shù)內(nèi)阿米巴原蟲主要分為包囊和滋養(yǎng)體兩個階段,其在宿主之間的傳播主要通過糞-口途徑來實現(xiàn),感染后主要表現(xiàn)為腸道疾病以及宿主肝臟、大腦和其他器官的損傷[3-4]。阿米巴病是常見的寄生蟲病之一,主要是由溶組織內(nèi)阿米巴引起。我國西南地區(qū)成為人感染阿米巴病的高發(fā)地區(qū)[5-7]。在我國西藏、青海、甘肅、云南、江蘇、湖南、江西、福建等地均已有報道[4,8-9]。

反芻動物?？勺鳛閮?nèi)阿米巴原蟲的宿主,獨龍牛是云南省怒江州的珍貴肉用牛種,內(nèi)阿米巴原蟲作為一種人畜共患寄生蟲,可能對當?shù)鬲汖埮ｐB(yǎng)殖業(yè)造成損失,與獨龍牛密切接觸的牧民可能存在感染的風險。本研究以怒江州獨龍牛為調(diào)查對象,調(diào)查并分析內(nèi)阿米巴原蟲的感染情況和主要蟲種,旨在為當?shù)貎?nèi)阿米巴原蟲的防控提供理論參考,也為云南省內(nèi)阿米巴原蟲進一步的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 2017年9月至2018年9月,從云南省怒江州怒江流域的鳩門當村、亞左洛村、古泉村、茨開鎮(zhèn)及獨龍江流域的獨龍江鄉(xiāng)5個采樣點,在春、夏、秋、冬四個季節(jié)采集到625份新鮮獨龍牛糞便樣本,其中怒江流域557份,獨龍江流域68份,-20 ℃保存。內(nèi)阿米巴原蟲陽性DNA樣本由大理大學病原生物學寄生蟲實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 10×PCR Buffer(AM21651A),MgCl2(AM21652A),dNTPs Mixture(AM21653A),Ex-TaqDNA聚合酶(AM21653A),DL-2 000 Marker(AM11312A),6×DNA Loading Buffer(AGY0007A),寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司產(chǎn)品;DNA提取試劑盒(D4015020000K24U001),美國OMEGA Bio-Tek公司產(chǎn)品;4S Green核酸染色劑(A616694),生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 冷凍離心機(5427R),艾本德中國有限公司產(chǎn)品;PCR儀(Applied Biosystems 2720),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-12)、瓊脂糖水平電泳槽(DYCP-31DN),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;全自動凝膠成像系統(tǒng)(Syngene GeneGenius),美國Syngene公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便DNA提取 獨龍牛糞便樣本DNA的提取按照糞便DNA提取試劑盒所述步驟進行操作,提取的DNA放置于-20 ℃保存。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 擴增內(nèi)阿米巴原蟲18S rRNA基因位點,引物序列參照VERWEIJ J J等的報道[10]進行設計(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。預擴增產(chǎn)物大小約為600 bp。

表1 擴增內(nèi)阿米巴原蟲18S rRNA基因位點的引物序列、目的片段、退火溫度Table 1 Primer sequences,fragment length,annealing temperature for amplification of the 18S rRNA gene of Entamoeba spp.

PCR擴增反應體系:10×PCR buffer 2.5 μL,MgCl21.5 μL,dNTPs Mixture 2 μL,Ex-TaqDNA聚合酶0.25 μL,引物Entam1、Entam2均為0.5 μL,模板DNA 1 μL,加ddH2O補至25 μL。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測 配置10 g/L瓊脂糖凝膠,加入4S Green核酸染色劑混勻,取PCR產(chǎn)物5 μL與1 μL的6×DNA Loading buffer混合上樣,電泳的電壓為120 V,時間約為30 min。PCR陽性樣本送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.4 遺傳進化分析 使用BLAST將測序獲得的樣本序列在GenBank上與內(nèi)阿米巴原蟲參考序列進行相似性比對。參考序列主要包括比利時的猴源Entamoebasp.MG107/BEL(登錄號:GU437825)、中國的牛源Entamoebasp.MG107/BEL(登錄號:MT734309)、中國的牛源E.bovis(登錄號:MT734187)、冰島的鹿源E.bovis(登錄號:FN666252)、瑞典的羊源E.bovis(登錄號:FN666250)、瑞典的牛源E.bovis(登錄號:FN666249)、瑞典的鹿源Entamoebasp.RL1(登錄號:FN666253)、瑞典的牛源Entamoebasp.RL2(登錄號:FN686363)、瑞典的龜源Entamoebasp.RL5(登錄號:FR686365)、德國的猴源Entamoebasp.RL3(登錄號:FN686358)、英國的牛源Entamoebasp.RL8(登錄號:KR025406)和利比亞的牛源Entamoebasp.RL4(登錄號:FR686361)。以Entamoebasp.RL5(登錄號:FR686365)作為外群,使用MEGA-11計算序列之間的遺傳距離,采用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 使用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用卡方檢驗分析內(nèi)阿米巴原蟲感染率的差異,當P<0.05時,差異顯著;當P>0.05時,差異不顯著;當P<0.01時,差異極顯著。

2 結果

2.1 常規(guī)PCR擴增結果

利用常規(guī)PCR方法對內(nèi)阿米巴原蟲18S rRNA基因位點進行擴增,625份樣本中共有61份樣本擴增出陽性條帶,條帶大小約為600 bp(圖1)。

M.DNA標準DL 2 000;1～4.陽性樣品;5.陽性對照;6.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000; 1-4.Positive samples; 5.Positive control; 6.Negative control圖1 內(nèi)阿米巴原蟲18S rRNA基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of 18S rRNA gene of Entamoeba spp.

2.2 測序與分子鑒定結果

對本研究獲得的61份內(nèi)阿米巴原蟲陽性樣本測序結果進行比對分析,其中51份鑒定為E.bovis,與瑞典的牛源E.bovis(FN666249)序列相似性為95.19%～99.26%;10份鑒定為Entamoebasp.MG107/BEL,與比利時的猴源Entamoebasp.MG107/BEL(GU437825)序列相似性為95.45%～98.83%,兩者均不屬于人畜共患寄生蟲。E.bovis在5個采樣點的獨龍牛中均有感染,是當?shù)鬲汖埮８腥緝?nèi)阿米巴原蟲的優(yōu)勢蟲種,所占比例為83.61%(51/61),以茨開鎮(zhèn)獨龍牛的E.bovis感染數(shù)量最多。獨龍江流域未檢測到Entamoebasp.MG107/BEL,怒江流域范圍內(nèi)除鳩門當村,其余采樣地點均檢測到Entamoebasp.MG107/BEL,所占比例為16.39%(10/61),以茨開鎮(zhèn)獨龍牛的Entamoebasp.MG107/BEL感染數(shù)量最多(表2)。將陽性序列上傳至GenBank獲得登錄號為:OP563753～OP563813,基于內(nèi)阿米巴原蟲18S rRNA構建系統(tǒng)進化樹,本研究中的E.bovis序列OP563782與冰島的鹿源E.bovis(FN666252)位于同一進化分支,E.bovis序列OP563771與瑞典的羊源E.bovis(FN666250)位于同一進化分支,E.bovis序列OP563778與瑞典的牛源E.bovis(FN666249)位于同一進化分支;Entamoebasp.MG107/BEL序列OP563811和OP563805與比利時的猴源Entamoebasp.MG107/BEL(GU437825)位于同一進化分支(圖2)。

▲為本研究中鑒定的部分Entamoeba bovis;●為本研究中鑒定的部分Entamoeba sp.MG107/BEL▲Part of Entamoeba bovis identified in this study;●part of Entamoeba sp.MG107/BEL identified in this study圖2 內(nèi)阿米巴原蟲系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Entamoeba spp.

表2 云南省怒江州獨龍牛內(nèi)阿米巴原蟲分布情況Table 2 Distribution of Entamoeba spp.in Bos frontalis in Nujiang prefecture,Yunnan province

2.3 獨龍牛內(nèi)阿米巴原蟲感染情況

625份獨龍牛糞便樣本中共檢測出61份內(nèi)阿米巴原蟲陽性樣本,總感染率為9.76%。5個采樣點中,鳩門當村、亞左洛村、古泉村、茨開鎮(zhèn)、獨龍江鄉(xiāng)獨龍牛的內(nèi)阿米巴原蟲感染率分別為4.12%(4/97)、7.59%(6/79)、11.18%(17/152)、13.54%(31/229)和4.41%(3/68),不同地點之間,其感染率差異顯著(P<0.05)。怒江流域與獨龍江流域獨龍牛的內(nèi)阿米巴原蟲感染率分別為10.41%(58/557)和4.41%(3/68),兩流域之間,其感染率差異不顯著(P>0.05)(表3)。春、夏、秋、冬4個季節(jié)中,獨龍牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率分別為11.93%(26/218)、23.66%(22/93),3.33%(4/120)和4.64%(9/194),不同季節(jié)之間,其感染率差異極顯著(P<0.01)(表4)。

表3 不同采樣點和流域內(nèi)阿米巴原蟲的感染情況Table 3 The infections of Entamoeba spp.in different sampling sites and basins

表4 不同季度內(nèi)阿米巴原蟲的感染情況Table 4 The infections of Entamoeba spp.in different seasons

3 討論

獨龍牛是印度野牛的亞種,除了分布在我國云南省怒江州,還分布在孟加拉國、印度、緬甸和不丹[11]。近年來印度和不丹已報道的研究顯示,獨龍牛感染的寄生蟲包括指形長刺線蟲、牛弓首蛔蟲、弓形蟲和絳蟲[12-14],國內(nèi)已報道的研究顯示,獨龍牛感染了環(huán)孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲等[15-17]。國內(nèi)外尚未有獨龍牛內(nèi)阿米巴原蟲的相關調(diào)查研究,故本研究對云南省怒江州獨龍牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染情況進行調(diào)查,結果顯示內(nèi)阿米巴原蟲的感染率為9.76%,茨開鎮(zhèn)的感染率最高,鳩門當村的感染率最低,不同地點之間差異顯著(P<0.05),分析其原因可能與各個地點獨龍牛的養(yǎng)殖模式有關,集體管理模式可能導致內(nèi)阿米巴原蟲更加容易傳播,而將獨龍牛散養(yǎng)在深山中,牛群活動范圍更大,聚集的規(guī)模更小,不容易互相傳播,怒江流域的茨開鎮(zhèn)和古泉村應加強對其內(nèi)阿米巴原蟲的防治。國外的研究報道顯示,日本奶牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率為72%,但該研究牛糞便樣本數(shù)為25份[3];烏干達牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率為80%,采集樣本數(shù)為45份[18],國外感染率比本試驗感染率高的原因可能是樣本采集數(shù)量、地理位置、氣候條件不同造成的。國內(nèi)青海省牦牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率為36.32%[19],云南大理奶牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率為30.09%[20],河北和天津地區(qū)奶牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率為33.27%[21],均高于云南省獨龍牛的感染率,其差異可能與樣本采集數(shù)量、地理位置、生態(tài)環(huán)境、品種、自身免疫狀況等因素有關。本調(diào)查結果還顯示,4個季節(jié)中獨龍牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率在夏季最高,春季和冬季次之,秋季最低,差異顯著(P<0.05)。青海省牦牛內(nèi)阿米巴原蟲的感染率在夏季也是最高的[19],夏季可能是牛感染內(nèi)阿米巴原蟲的高危季節(jié),夏季應特別加強對內(nèi)阿米巴原蟲的檢測。

本研究基于內(nèi)阿米巴原蟲18S rRNA基因,鑒定出E.bovis和Entamoebasp.MG107/BEL兩個種的內(nèi)阿米巴原蟲,均不屬于人畜共患寄生蟲種類,其中,E.bovis是獨龍牛感染的優(yōu)勢蟲種。國外的研究顯示,Stensvold C R等建立了一種新的內(nèi)阿米巴原蟲命名方式——核糖體譜系(RL)[22]。反芻動物可感染的內(nèi)阿米巴原蟲主要有E.bovis、Entamoebasp.RL1、Entamoebasp.RL2、Entamoebasp.RL4(靈長類動物的Entamoebasp.RL3)和Entamoebasp.RL8[3,23]。本研究結果中未鑒定出核糖體譜系的內(nèi)阿米巴原蟲,Entamoebasp.MG107/BEL目前可能被認為是內(nèi)阿米巴原蟲的暫定型,并未正式歸為某一個譜系之中,通過進化樹分析推測其與E.bovis具有較高的同源性。Entamoebasp.MG107/BEL的發(fā)現(xiàn)也是繼衡昭君和Ren M等之后再一次從牛中鑒定出該內(nèi)阿米巴原蟲[19-20]。

獨龍牛作為怒江州獨龍族牧民長期馴養(yǎng)的一種半野生畜種,具有很好的經(jīng)濟前景,但因分布于偏遠山區(qū),增加了防治其人畜共患寄生蟲工作的難度。E.bovis在牛中據(jù)有普遍傳染性,但其致病性很低[3],Matsubayashi M等研究發(fā)現(xiàn),波列基內(nèi)阿米巴(Entamoebapolecki)在豬體內(nèi)具有較低的致病性,當其與胞內(nèi)勞森菌混合感染時能夠誘導引發(fā)回腸炎[24]。當牛內(nèi)阿米巴原蟲和其他病原體混合感染時,是否會加重疾病嚴重程度尚未可知,還需進一步的研究來證實。當?shù)啬撩駪纳起B(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生條件,做好牛糞便的無害化處理,建議當?shù)赜嘘P部門加強對獨龍牛內(nèi)阿米巴原蟲感染的檢測檢疫,加強對內(nèi)阿米巴原蟲病的防治宣傳教育。