尹寶英,朱小甫,鄭紅青,邱存義

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 咸陽市動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西咸陽 712000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西楊凌 712100)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病,其特征是可以引起各日齡的豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和厭食等癥狀,其中由于腹瀉造成的電解質(zhì)大量丟失和酸堿平衡失調(diào)可造成7日齡內(nèi)的哺乳仔豬死亡率高達(dá)80%～100%。自2010年底國內(nèi)PEDV變異毒株不斷被發(fā)現(xiàn),PEDV在長期的變異中已經(jīng)進(jìn)化出不同的策略來逃逸和破壞宿主的天然免疫系統(tǒng)以促進(jìn)病毒的復(fù)制[1]。PEDV編碼的多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒復(fù)制和包裝中具有不同的功能作用,通過影響宿主細(xì)胞的凋亡、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多項(xiàng)生命活動(dòng)過程進(jìn)而抑制宿主對(duì)病毒的免疫應(yīng)答反應(yīng)。以經(jīng)典毒株為免疫原的PEDV商品苗已無法對(duì)流行變異PEDV毒株的感染提供有效保護(hù)[ 2 ]。

天然免疫是抵抗病原微生物入侵的一道重要防線,與獲得性免疫相比,天然免疫具有應(yīng)答迅速和特異性低等特點(diǎn)。模式識(shí)別受體(PRR)是宿主抵抗病原微生物的感應(yīng)器,可識(shí)別具有病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern,DAMPs),從而引發(fā)先天性免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)TRIM56(tripartite motif-containing protein 56)可以通過上調(diào)TLR3(Toll-like receptor 3)和TRAF3(TNF receptor associated factors 3 )通路介導(dǎo)的IFN-β(interferon β)的表達(dá),而限制PEDV在猴胚胎腎上皮細(xì)胞(Marc145)中的復(fù)制;而FUBP3(far upstream element-binding protein 3 )則可通過上調(diào)TRAF3的表達(dá)來激活I(lǐng)FN-Ⅰ(interferon Ⅰ)信號(hào)通路,此外某些抗病毒蛋白在限制PEDV的感染過程中也發(fā)揮了重要的作用,例如PTPN14(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14)在PEDV感染的Vero細(xì)胞中出現(xiàn)明顯上調(diào),PTPN14通過抑制 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)的磷酸化激活過程發(fā)揮作用,STAT3作為多種細(xì)胞因子和生長因子的下游效應(yīng)分子,抑制IFN-Ⅰ的抗病毒活性[3-4]。

闡明病毒的抗免疫逃逸機(jī)制對(duì)了解宿主范圍、嗜性、發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)有效的疫苗和抗病毒藥物以遏制PEDV在豬群中的傳播至關(guān)重要。為了更好地了解PEDV與宿主之間的相互作用,進(jìn)一步揭示PEDV逃逸宿主天然免疫的應(yīng)答機(jī)制,本文就PEDV如何逃逸宿主天然免疫應(yīng)答進(jìn)行綜述,以期為PED的防控和疫苗的研發(fā)提供新思路。

1 PEDV蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用

1.1 PEDV結(jié)構(gòu)蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用

1.1.1 PEDV S蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV S蛋白是一種位于病毒囊膜上的Ⅰ型膜糖蛋白。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)的不同,S蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域分為S1和S2兩個(gè)區(qū)域,N端S1區(qū)域主要負(fù)責(zé)受體的結(jié)合,C端膜錨定的S2區(qū)域主要參與病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合。當(dāng)S1區(qū)域與受體結(jié)合時(shí),S蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化,暴露蛋白酶裂解位點(diǎn),隨后被蛋白酶裂解為S1亞基和S2亞基,這有利于S2亞基中的融合肽插入宿主細(xì)胞膜并啟動(dòng)膜融合過程[5]。而PEDV可以利用宿主的 TMPRSS2(recombinant transmembrane protease serine 2)和MSPL(mosaic seine protease large-form)對(duì)S蛋白進(jìn)行切割,從而促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的膜融合過程,提高病毒復(fù)制水平[6]。PEDV S蛋白還與 EGFRs(epithelial growth factor receptors)相互作用,通過JAK2/STAT3((Janus kinase 2/signal transducer and activator of tranion 3)信號(hào)通路下調(diào) IFN-Ⅰ的表達(dá),從而促進(jìn)PEDV復(fù)制[7]。研究表明PEDV感染時(shí)通過激活線粒體細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)半胱天冬酶非依賴性凋亡,從而促進(jìn)病毒復(fù)制,而PEDV S1蛋白是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑[8]。因此,PEDV可能通過S蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來逃避宿主免疫反應(yīng),但是確切機(jī)制尚待進(jìn)一步證實(shí)。

1.1.2 PEDV N蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV N蛋白是一種與基因組RNA結(jié)合的磷酸化核衣殼蛋白,在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和組裝過程中發(fā)揮重要作用。由于PEDV N蛋白在感染早期能產(chǎn)生高水平的表達(dá),因此可以作為PEDV感染初期診斷的靶標(biāo)。研究表明PEDV N蛋白可以通過豬腸上皮細(xì)胞中的Toll樣受體TLR2、TLR3和TLR9途徑活化NF-κB(nuclear transcription factor-κB ),也可以通過阻斷NF-κB核易位來拮抗INF-λ的產(chǎn)生[9]。此外,PEDV N蛋白還可直接與 TBK1(TANK binding kinase 1)相互作用從而抑制IRF3(interferon regulatory factor 3)的活化和IFN-Ⅰ的產(chǎn)生[10],但TARDBP(TAR DNA binding protein)可以通過蛋白酶體和自噬降解途徑降解N蛋白,上調(diào)Toll樣受體信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子MyD88(myeloid differentiation factor 88)的表達(dá),激活I(lǐng)FN-Ⅰ信號(hào)傳導(dǎo),從而有效抑制PEDV復(fù)制[11]。

1.1.3 PEDV M蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV M蛋白是病毒顆粒外包膜的一種組分,屬于Ⅲ型糖蛋白,由短氨基末端結(jié)構(gòu)域和3個(gè)連續(xù)的跨膜結(jié)構(gòu)域以及長羧基末端結(jié)構(gòu)域組成。M蛋白通過細(xì)胞周期蛋白cyclin A途徑誘導(dǎo)S期細(xì)胞周期停滯,下調(diào)eIF3L(eukaryotic initiation factor 3)的表達(dá),促進(jìn)病毒復(fù)制。Li S等[12]研究表明,PEDV M蛋白與IRF7的抑制結(jié)構(gòu)域相互作用,顯著抑制TBK1/IKKε(TANK-binding kinase-1/IκB kinase-ε)誘導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子IRF7的磷酸化和二聚化,導(dǎo)致IFN-I表達(dá)降低,但該過程不影響TBK1/IKKε與IRF7之間的相互作用。此外,PEDV M蛋白可以與 HSP70(heat shock protein 70)形成復(fù)合物從而影響宿主的天然免疫反應(yīng)和病毒復(fù)制[13]。

1.1.4 PEDV E蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 E蛋白是PEDV中最小的結(jié)構(gòu)蛋白,參與PEDV病毒粒子組裝和出芽等過程。E蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活NF-κB通路,該通路負(fù)責(zé)上調(diào)IL-8(interleukin-8)和抗凋亡蛋白Bcl-2(B-cell CLL/lymphoma 2)的表達(dá)。關(guān)于PEDV E蛋白的研究較少,Zheng L等人[14]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PEDV E蛋白,可以顯著下調(diào)了IFN-β和 ISG(interferon-stimulated genes)的表達(dá),還可直接作用于IRF3,干擾了其核轉(zhuǎn)位。

1.1.5 ORF3蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 ORF3蛋白是PEDV基因組編碼的唯一輔助蛋白,與PEDV毒力有關(guān)。ORF3通過凋亡和自噬途徑影響病毒的復(fù)制,即一面通過直接抑制感染細(xì)胞的凋亡來增強(qiáng)病毒增殖,另一方面通過促進(jìn)自噬標(biāo)記物胞漿型向自噬體膜型的轉(zhuǎn)化來誘導(dǎo)自噬發(fā)生。ORF3蛋白可聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,通過上調(diào)GRP78(glucose regulated protein)表達(dá)和激活PERK-eIF2a(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase-eukaryotic translation initator factor 2)信號(hào)通路來觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),從而激活旨在恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的未折疊蛋白反應(yīng),觸發(fā)細(xì)胞死亡和自噬[15]。Wu Z等[16]發(fā)現(xiàn)PEDV ORF3可通過下調(diào)NF-κB p65蛋白的表達(dá)和磷酸化水平來阻礙其活化和核轉(zhuǎn)位。另外,ORF3蛋白可通過與S蛋白互作,促進(jìn)病毒的復(fù)制,但是其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。

1.2 PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用

1.2.1 nsp1蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 nsp1蛋白通過打斷IRF3和CREB (cAMP response element B )之間的連接結(jié)構(gòu)從而抑制IFN-I表達(dá)的,并不干擾IRF3磷酸化和核易位。線粒體MAVS(mitochondrial antiviral signaling)蛋白主要誘導(dǎo)IFN-I的產(chǎn)生,過氧化物酶體MAVS則主要誘導(dǎo)IFN-λ的產(chǎn)生,而IRF1對(duì)于IFN-λ的過氧化物酶體MAVS依賴性激活途徑具有重要的調(diào)控作用。nsp1可阻斷IRF1的核易位和減少過氧化物酶體的數(shù)量,從而抑制IRF1誘導(dǎo)的Ⅲ型IFN的表達(dá)[17]。Shen Z等[18]研究表明包括PEDV和TGEV在內(nèi)的七種具有代表性的α-冠狀病毒的 nsp1s可以顯著抑制STAT1向S727的磷酸化并干擾IFN-Ⅰ的產(chǎn)生。

1.2.2 nsp2蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 nsp2是PEDV高變區(qū), 研究發(fā)現(xiàn)其可通過作用于泛素連接酶FBXW7,增強(qiáng)RIG-I和TBK1表達(dá)和誘導(dǎo)ISGs的表達(dá)促進(jìn)宿主細(xì)胞的抗病毒天然免疫,還可促進(jìn)FBXW7通過K48連接的泛素-蛋白酶體途徑降解,從而下調(diào)宿主的抗病毒水平[19]。

1.2.3 nsp3蛋白和nsp5蛋白在逃逸宿主天然免疫中的作用 PEDV nsp3編碼具有去泛素化酶活性的PLP2(papain-like protease 2),通過去泛素酶活性來拮抗RIG-I(retinoic acid-inducible gene 1)和STING(stimulator of interferon genes)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)IFN-β的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。同為冠狀病毒的SARS-CoV2也具有去泛素酶活性。當(dāng)機(jī)體感染后SARS-CoV2,SARS-CoV2-Plpro可以通過降解ISG15的靶蛋白IRF3,從而削弱INF-Ⅰ應(yīng)答,同時(shí)SARS-CoV2-Plpro對(duì)于TBK1和IRF3磷酸化及IRF3的核易位也具有較強(qiáng)的抑制作用,通過去除TRAF3和TRAF6的Lys63連接的多聚泛素化,抑制 TLR7 信號(hào)通路[20]。nsp5編碼的3C樣蛋白酶特異性靶向NEMO谷氨酸231以切割NEMO殘基,從而拮抗IFN-I的產(chǎn)生和下游RIG-I/MDA5信號(hào)通路的激活[21]。

1.2.4 nsp7蛋白在拮抗宿主抗病毒天然免疫中的作用 核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白KPNA1(karyopherin α1)作為核定位信號(hào)蛋白,參與STAT1和STAT2的核易位過程。而PEDV nsp7可與STAT1 / STAT2的DNA結(jié)合域相互作用,競爭性抑制KPNA1與STAT1的結(jié)合,但nsp7不影響JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2等蛋白的磷酸化水平及ISGF3(interferon-stimulated gene factor 3)復(fù)合物的形成[22]。

1.2.5 nsp15蛋白在拮抗宿主抗病毒天然免疫中的作用 2020年Wu 等[23]研究發(fā)現(xiàn)PEDV nsp15可直接依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性降解TBK1和IRF3的mRNA水平以下調(diào)TBK1和IRF3的表達(dá),從而抑制IFN的產(chǎn)生并限制ISGs的誘導(dǎo),協(xié)助PEDV逃逸宿主的天然免疫。2021年Gao 等人[24]證明IBV nsp15通過減少dsRNA積累逃避蛋白激酶的識(shí)別從而抑制應(yīng)激顆粒SGs(stress sranules)的形成,并且nsp15的EndoU活性是抑制 SGs 形成所必需的。而在過表達(dá)PEDV nsp15的豬腎細(xì)胞(LLC-PK1)中同樣檢測(cè)到eIF2α依賴性和非依賴性SGs的形成受到抑制。在多種過表達(dá)冠狀病毒nsp15的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了PKR-eIF2α-SGs信號(hào)傳導(dǎo)阻滯的現(xiàn)象,這表明具有高度保守的催化核心結(jié)構(gòu)域的nsp15可能在拮抗冠狀病毒的整體反應(yīng)中起重要作用。

1.2.6 PEDV其他非結(jié)構(gòu)蛋白在拮抗宿主抗病毒天然免疫中的作用 PEDV nsp6可以誘導(dǎo)自噬,并通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)PEDV在豬小腸上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制[25]。PEDV nsp16下調(diào)RIG-I和MDA5(melanoma-diffentiation-associatedgene5)介導(dǎo)的IFN-β及ISGs的表達(dá)。此外,在過表達(dá)nsp16的細(xì)胞中IFIT(interferon induced proteins tetratricopeptiderepeats)家族成員IFIT1、IFIT2和IFIT3的mRNA水平受到抑制。另發(fā)現(xiàn)nsp10可增強(qiáng)了nsp16對(duì)IFN-β的抑制作用[26]。

2 其他因素對(duì)于PEDV拮抗天然免疫的影響

2.1 自噬對(duì)于PEDV感染的影響

病毒自噬一方面增強(qiáng)宿主的抗病毒天然免疫,另一方面促進(jìn)病毒復(fù)制。病毒自噬對(duì)病毒復(fù)制的影響可能取決于病毒本身的特性。Guo X等人[27]運(yùn)用自噬調(diào)節(jié)藥物研究自噬對(duì)PEDV感染的具體影響,發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3-MA(3-methyladenine)在 PEDV感染早期階段能夠抑制病毒的復(fù)制,而CQ(chloroquine)則在PEDV感染后期階段抑制病毒的復(fù)制。此外,雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬提高了病毒滴度。為進(jìn)一步評(píng)估自噬對(duì)PEDV復(fù)制的影響。通過沉默兩種自噬必需的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Beclin1和ATG5(autophagy 5)抑制了PEDV的復(fù)制。這些結(jié)果表明,自噬誘導(dǎo)可能有益于PEDV復(fù)制。但有研究表明雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬抑制了IPEC-J2中的PEDV感染[28]。Kong N等人[29]發(fā)現(xiàn)BST2(bone marrow stromal cell antigen 2)通過募集泛素連接酶泛素化PEDV N蛋白,泛素化的N蛋白被CALCOCO2/NDP52( calcium-binding and coiled-coil domain 2/nuclear dot protein 52)識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬小體,通過自噬-溶酶體途徑降解,從而抑制PEDV的復(fù)制。因此,自噬對(duì)于PEDV復(fù)制的影響仍需進(jìn)一步探索。

圖1 PEDV蛋白與部分PRR信號(hào)通路互作網(wǎng)絡(luò)示意圖Fig.1 Diagram of interaction network between PEDV protein and partial PRR signaling pathway

2.2 PEDV通過隱藏PAMPs逃避宿主天然免疫

病毒某些結(jié)構(gòu)的內(nèi)切核糖核酸酶活性及5' Cap結(jié)構(gòu)有助于病毒避免自身的 RNA 被識(shí)別和降解。PEDV nsp15具有內(nèi)切核糖核酸酶活性,可以通過減少dsRNA的積累,逃避MDA5、PKR(protein kinase R )等PRRs的識(shí)別。PEDV nsp16是一種甲基轉(zhuǎn)移酶,參與病毒RNA的加帽。這種修飾使病毒RNA與宿主細(xì)胞mRNA無法被區(qū)分,從而避免被MDA5識(shí)別。RNA病毒在復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA和 5'-三磷酸RNA可以被PRRs識(shí)別。但是如SARS-CoV-2等冠狀病毒可以將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)化為雙膜囊泡,為病毒RNA的復(fù)制提供一個(gè)安全的場(chǎng)所,從而逃避宿主模式識(shí)別受體的識(shí)別。而雙膜囊泡是否在PEDV的感染過程中對(duì)其提供同樣的保護(hù),仍有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.3 其他途徑介導(dǎo)PEDV逃避宿主天然免疫

Guo等人[30]發(fā)現(xiàn)PEDV通過泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)p-STAT1的降解,抑制干擾素信號(hào)傳導(dǎo)。PEDV的感染誘導(dǎo)半胱天冬酶-8介導(dǎo)的Ras-GTPase激活蛋白結(jié)合蛋白1裂解并破壞應(yīng)激顆粒的形成以促進(jìn)病毒復(fù)制[31]。PARD3(partitioning defective 3),一種結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員,作用是建立和維持上皮細(xì)胞間的緊密連接,PEDV可通過蛋白酶體依賴途徑降解PARD3,從而促進(jìn)完成自身增殖[32]。

3 展望

PEDV在長期演變中已經(jīng)進(jìn)化出多種拮抗宿主天然免疫反應(yīng)的策略,如抑制IFN的產(chǎn)生,包括阻礙RIG-I/TLR信號(hào)傳導(dǎo)、抑制dsRNA與RIG-I/MDA5結(jié)合或直接下調(diào)IFN啟動(dòng)子活性。PEDV的E蛋白、N蛋白和ORF3蛋白都可以通過PERK和IRE1(inositol-requiring enzyme 1)信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)ER 應(yīng)激,上調(diào)炎癥因子的表達(dá)。此外,PEDV還通過靶向NF-κB信號(hào)通路來減弱炎癥反應(yīng)。除上述途徑外,宿主細(xì)胞的生理過程如自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡可能也參與了PEDV逃避天然免疫反應(yīng)的過程,如PEDV nsp6 通過PI3K/Akt/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬,以促進(jìn)病毒的復(fù)制[25]。但自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡等生理過程對(duì)于PEDV感染的確切影響及具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。