肖宜容,陳怡夢,龐艷華,陳 新,2,張雨梅,2*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇揚州 225009;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚州 225009)

脫氫乙酸鈉(sodium dehydroacetate,DHA-S)又稱脫氫醋酸鈉,可以有效抑制酵母菌、霉菌、細菌和大腸埃希氏菌等微生物的生長[1,2],常被用作食品和飼料的防霉、防腐添加劑。有關DHA-S的毒性研究表明, 62.0 mg/kg和 124.0 mg/kg DHA-S經口服連續(xù)給予 90 d時,對大鼠有輕微的全身毒性,表現(xiàn)為體重和食物利用率顯著降低,促甲狀腺激素水平顯著升高等[3]。150 mg/kg、200 mg/kg及較高劑量DHA-S可引起鼠出血性傾向和凝血功能異常,并在多個組織器官中可以觀察到嚴重出血[4,5]。

華法林為臨床常用的維生素K拮抗劑類抗凝藥,廣泛用于預防和治療血管栓塞性疾病[6]。華法林為含香豆素類結構的衍生物,在大鼠中具有明確的抗凝血作用[7]。華法林可通過競爭性抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)的活性,進而抑制VK環(huán)氧化物(VKO)還原成VK并還原成氫醌型維生素K(KH2),妨礙VK的循環(huán)再利用,干擾VK依賴性凝血因子II、VII、IX、X的活化,從而產生抗凝作用[8]。目前已知VKOR是VK循環(huán)中的限速酶,也是華法林抗凝作用的作用位點。VKOR在肝臟組織中起主要的活性作用,其亞型維生素K環(huán)氧化物還原酶亞型Ⅰ(VKORC1)在肝組織中還原了90% 以上的VKO,是VKOR的主要活性成分[9]。DHA-S具有與華法林相似的香豆素結構[10],推測長期給予DHA-S 后可能降低大鼠體內VKORC1的表達從而存在出血性傾向。

研究發(fā)現(xiàn)灌胃 200 mg/kg脫氫乙酸鈉后大鼠凝血指標與正常組有顯著性差異[11],但有關DHA-S凝血障礙的機制并不清楚。本文通過給予大鼠 200 mg/kg脫氫乙酸鈉后測定大鼠凝血指標、肝臟中DHA-S含量和VKORC1的表達量,來研究DHA-S在肝臟中的組織濃度、肝臟中VKORC1水平對大鼠凝血功能的影響間的關系,可為DHA-S在畜禽中的安全應用提供參考,為DHA-S致大鼠出血的機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠,200 g±20 g,雌雄各半,購自揚州大學比較醫(yī)學中心,動物生產許可證號SCXK(蘇)2017-0004。動物使用許可證號為SYXK(蘇)2017-0044。自由飲水和采食,飲水為符合城市飲用水標準《GB 5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標準》的自來水。大鼠試驗前在試驗環(huán)境中適應3 d,灌胃前禁食12 h,不限制飲水。

1.1.2 主要試劑 DHA-S,純度≥98%(批號 20190818),江蘇天成動物保護公司產品;凝血酶原(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)試劑盒(鞣花酸型),南京建成生物科技有限公司產品;熒光定量試劑盒BeyoFastTMProbe qPCR Mix(2x)(批號:D7271),碧云天生物技術有限公司產品;RNA提取試劑盒Fast?Cell/Tissue Toal Isolation Kit V2(批號RC112)、反轉錄試劑盒HiScript?Ⅲ1st strand cDNA Synthesis Lit(批號;R312-01),南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品;兔抗大鼠Vkorc1多克隆抗體(批號GTX47837),美國GENE TEX公司產品;RT-qPCR引物、BCA蛋白濃度測定試劑盒,上海生工生物工程技術服務有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 TRON M4凝血儀,德國TECO Gmbh公司產品;Agilent 1200高效液相色譜儀,四元泵,配VWD檢測器;色譜柱:Agilent C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);進樣針(100 μL),安捷倫科技有限公司產品;水平電泳儀(批號:DYY-6D)、水平電泳槽(批號:DYCP-31DN),北京六一生物科技有限公司產品;Mini PROTEAN?Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng)(批號1658001)(含電泳槽、轉印槽)、凝膠成像系統(tǒng)ChemiDocTmXRS+、快速光學96反應孔密封膜,美國Bio-Rad公司產品;實時熒光定量PCR儀,7500 Fast,美國Applied Biosystems公司產品;酶標儀,美國Bio-Tek公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DHA-S的給予及采樣 Wistar大鼠60只,連續(xù)11 d灌胃給予 200 mg/kg的DHA-S,空白對照組(n=6)給予等量生理鹽水。分別于DHA-S給予后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d時安樂死處死大鼠。各時間點取6只大鼠,雌、雄各半,眼眶后靜脈叢采集靜脈血,按9∶1加入枸櫞酸鈉后,3 000 r/min離心15 min后收集血漿,按PT和APTT檢測試劑盒說明書,在2 h內用TRON M4凝血儀,進行凝血指標PT和APTT的測定;并分別取其肝臟,于-20℃保存,用HPLC法檢測其中DHA-S含量。

1.2.2 HPLC法測定脫氫乙酸鈉含量 HPLC法測定肝臟中DHA-S含量的方法,參照鄧迎春的方法[12]。肝臟樣品前處理方法為:取5 g肝臟組織準確稱量后與4.0 g無水硫酸鎂、16 mL乙腈于50 mL離心管中,11 000 r/min勻漿1～2 min至無明顯可見組織塊,加入200 μL冰醋酸,渦旋混勻3 min,超聲振蕩提取15 min,4 000 r/min離心15 min,將上清液轉移至100 mL雞心瓶。殘渣中加入16 mL乙腈,渦旋混勻3 min,超聲波振蕩15 min重復提取一次,合并上清液。加2.5 mL正丙醇,45℃旋轉蒸發(fā)至近干。殘渣加1.0 mL流動相渦旋復溶后,轉移至1.5 mL離心管中,12 000 r/min離心15 min,上清過0.22 μm有機系濾膜,供HPLC檢測用。

大鼠肝臟DHA-S的HPLC測定條件:Agilent C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm);流動相為甲醇0.02 mol/L乙酸銨(30∶70,v/v);檢測波長293 nm。外標標準曲線法計算樣品中DHA-S的含量。

1.2.3 qRT-PCR法檢測Vkorc1基因的表達 根據(jù)GenBank中大鼠Vkorc1、β-actin基因序列,應用Primer premier5軟件設計qRT-PCR引物,引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下所示:

Vkorc1:F-5′GGACGTTGGGCCTCTATCCT3′

R-5′CAACATCAGGCCCGCATTGA3′

β-actin:F-5′AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG3′

R-5′CGCAGCTCAGTAACAGTCCG3′

提取總RNA后用測定OD260/OD280的比值,檢測制備的總RNA純度。反轉錄合成cDNA后進行RT-qPCR反應。

反轉錄反應體系終體積為20 μL:SYBR Premix ExTaqⅡ(2×)(Tli RNaseH Plus),Bulk 10 μL; 10 μM的上下游引物各0.8 μL;ROX Reference Dye(50×)0.08 μL;DNA 模板(<100 ng)2 μL;ddH2O 6.32 μL。

PCR反應條件如下:95℃ 30 s;95℃ 3 s,60℃ 30 s,共40個循環(huán)。重復3次,用無菌水代替cDNA模板作為陰性對照排除基因組DNA的污染。

1.2.4 Western blot檢測Vkorc1蛋白的表達 將肝組織研磨后提取蛋白并測定蛋白含量,且在沸水浴10 min使蛋白變性。配制SDS-PAGE凝膠;加入待測樣品后進行電泳,電泳結束后轉膜;封閉2 h;加入1 000倍稀釋的Vkorc1一抗,4℃孵育過夜(12～16 h);孵二抗(按1∶2 000稀釋),繼續(xù)室溫孵育2 h后,加ECL顯影、拍照。

2 結果與分析

2.1 DHA-S對大鼠凝血指標PT和APTT的影響

200 mg/kg DHA-S對大鼠凝血酶原時間PT和APTT的影響見圖1。隨著灌胃給予200 mg/kg DHA-S時間的延長,雄、雌鼠的PT值均明顯延長。雌鼠連續(xù)給予DHA-S后所有時間點的PT值均顯著升高(P<0.05),雄鼠處理 5 d、7 d、9 d、11 d后PT值均顯著增加(P<0.01)。 DHA-S處理7 d和9 d時,雌鼠的PT值均極顯著高于雄鼠。7 d和9 d時雄鼠PT時間較正常組分別延長5.73 s、8.02 s,雌鼠的PT時間較正常組分別延長14.35 s、15.87 s,雌鼠PT延長值分別約為雄鼠的2.5倍和1.9倍;DHA-S處理后,雄鼠PT值最高約為對照組的1.48倍;雌鼠PT值最高約為對照組的2.01倍。

A.200 mg/kg DHA-S對大鼠PT的影響; B.200 mg/kg DHA-S對大鼠APTT的影響A.Effect of 200 mg/kg DHA-S on rat PT; B Effect of 200 mg/kg DHA-S on APTT in ratsn=6;與同一天數(shù)對照組同性別間比較,*P<0.05,**P<0.01n=6;Compared with the control group on the same day,*P<0.05,**P<0.011.給藥3 d;2.給藥5 d;3.給藥7 d;4.給藥9 d;5.給藥11 d;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3.Dose 7 d;4.Dose 9 d;5.Dose 11 d圖1 200 mg/kg DHA-S對大鼠凝血指標的影響Fig.1 Effect of 200 mg/kg DHA-S on coagulation indexes in rats

隨著處理時間的延長APTT值呈增加的趨勢。其中雄鼠經DHA-S處理5 d、7 d后,APTT值顯著升高(P<0.05),9 d、11 d極顯著升高(P<0.01); 9 d、11 d時APTT值約為正常對照組的1.37倍和1.19倍。雌鼠處理 3 d、5 d后,APTT值顯著升高(P<0.05),7 d、9 d后APTT值極顯著升高(P<0.01);7 d、9 d時的APTT值分別為正常對照組的1.47倍和1.71倍。在7 d和9 d時,雌鼠APTT延長值顯著高于雄鼠,分別是雄鼠APTT延長值的1.50倍、1.17倍。

表明DHA-S較長時間給予后,雄或雌大鼠的凝血功能均被抑制,且對雌鼠的抑制大于雄鼠, DHA-S對大鼠凝血功能的抑制存在明顯的性別差異。

2.2 DHA-S對Vkorc1基因mRNA水平的影響

RT-qPCR法對雌、雄鼠肝臟中Vkorc1 mRNA水平的比較結果,如圖2所示。雄、雌大鼠肝臟組織內Vkorc1 mRNA表達水平隨著處理時間的延長逐漸降低。 DHA-S處理3～9 d后,雌鼠肝臟中Vkorc1均顯著降低(P<0.05),在處理后7 d、9 d,Vkorc1 mRNA均顯著低于雄鼠,下降了50%以上。雄鼠在連續(xù)處理5 d后,肝臟中Vkorc1 mRNA表達水平顯著降低;至處理11 d時極顯著降低(P<0.01),下降約45%。DHA-S對雄鼠Vkorc1 mRNA表達水平的抑制少于雌鼠。而肝臟中Vkorc1水平或活性與VK依賴性凝血因子的活化(凝血功能)呈正相關。

*P<0.05,**P<0.01,DHA-S與正常對照組比較。#P<0.05,同時間與雄鼠比較*P<0.05,**P<0.01,compared with the normal control group# P<0.05,comparison of male rats at the same timeM.正常對照組;1.給藥3 d;2.給藥5 d;3.給藥7 d;4.給藥9 d;5.給藥11 dM.Control;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3.Dose 7 d;4.Dose 9 d;5.Dose 11 d圖2 RT-qPCR檢測DHA-S處理組大鼠肝臟Vkorc1基因表達量Fig.2 Detection of Vkorc1 gene expression in liver of rats treated with DHA-S by RT-qPCR

2.3 DHA-S對Vkorc1蛋白水平的影響

以 200 mg/kg的DHA-S劑量灌胃給予大鼠后,其肝臟中的Vkorc1蛋白表達情況如圖3和圖4所示。DHA-S給予3 d后,雄鼠肝臟中Vkorc1蛋白的表達量較正常對照有顯著下降(P<0.05),在連續(xù)灌胃給予 DHA-S 5 d后,肝臟中的Vkorc1蛋白表達量與正常對照組相比有極顯著的降低(P<0.01)。 連續(xù)灌胃5 d后,雌鼠肝臟中的Vkorc1蛋白表達較正常組顯著降低(P<0.05),在連續(xù)灌胃DHA-S 9 d時,肝臟中Vkorc1蛋白表達量較正常對照組極顯著降低(P<0.01),雌鼠9 d處理組肝臟中Vkorc1蛋白的表達量不及正常對照組的一半。表明脫氫乙酸鈉抑制雌鼠凝血功能可能與抑制Vkorc1蛋白表達相關。

A.雄鼠肝臟中WB條帶;B.雌鼠肝臟中WB條帶A.WB bands in male rat liver; B.WB band in female rat liverM.正常對照組;1.給藥3 d;2.給藥5 d;3.給藥7 d;4.給藥9 d;5.給藥11 dM.Control;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3:Dose 7 d;4:Dose 9 d;5:Dose 11 d圖3 雌、雄鼠肝臟中Vkorc1蛋白條帶Fig.3 Vkorc1 protein bands in the liver of female and male rats

*P<0.05,**P<0.01,與正常對照組相比*P<0.05,**P<0.01,compared with the normal control groupM.正常對照組;1.給藥3 d;2.給藥5 d;3.給藥7 d;4.給藥9 d;5.給藥11 dM.Control;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3.Dose 7 d;4.Dose 9 d;5.Dose 11 d圖4 雌雄鼠肝臟中Vkorc1蛋白條帶灰度值分析統(tǒng)計圖Fig.4 Statistical diagram of gray value analysis of Vkorc1 protein bands in the liver of male and female rats

2.4 大鼠肝臟中DHA-S的測定

2.4.1 測定肝臟中DHA-S HPLC法測定肝臟中DHA-S,本方法的LOD為0.08 mg/kg,LOQ為0.2 mg/kg。0.2 mg/kg DHA-S空白添加樣品的平均添加回收率在81.94%～88.21%范圍內,日內變異系數(shù)為2.39%～5.42%,日間變異系數(shù)為2.74%～6.09%。

2.4.2 DHA-S在大鼠肝臟中濃度 200 mg/kg連續(xù)灌胃大鼠后,給藥11天后雄鼠肝臟內DHA-S含量達到最高為(28.52±0.84)mg/kg;給藥3天后雌鼠肝臟內DHA-S含量達到最高為(37.57±4.18)mg/kg,分析雄、雌鼠肝臟內DHA-S含量見得知在同一時間點雄鼠肝臟中DHA-S濃度明顯低于雌鼠,差異具顯著性(P<0.01)。

2.5 肝臟中VKORC1及DHA-S濃度與凝血指標的相關性分析結果

2.5.1 DHA-S肝臟濃度與PT、APTT間的相關性分析結果 DHA-S處理后,PT、APTT與DHA-S肝臟濃度間的相關性分析發(fā)現(xiàn)雄鼠肝臟中DHA-S含量與其PT、APTT值相關性較低,雌鼠肝臟中DHA-S含量與其PT、APTT值相關系數(shù)高于0.795,具有較好的相關性。

2.5.2 肝臟中VKORC1與PT、APTT間的相關性分析結果 大鼠組織中Vkorc1與PT、APTT間的相關性分析見發(fā)現(xiàn)雄鼠肝臟中Vkorc1的表達量與其PT、APTT間相關系數(shù)在0.74～0.89,雌鼠肝臟中Vkorc1表達量與其PT、APTT間相關系數(shù)在0.85～0.89之間,均呈顯著相關(P<0.05)。

3 討論

凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)是常用檢測抗凝活性的指標,PT常用于檢測外源性凝血途徑,是凝血酶原轉化為凝血酶的時間,當PT延長時,常反應凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ 及纖維蛋白原缺乏,APTT是外源性凝血指標,APTT延長常見于內源性凝血因子(因子Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ)缺乏或一些免疫學疾病和抗凝藥物的使用[13-14]。長期給藥后與正常對照組相比,隨著給藥時間的延長,雌雄大鼠的APTT、PT值都顯著增加;且雌雄鼠處理組間存在顯著性差異,雌雄大鼠肝臟中DHA-S的含量與PT、APTT的相關性較好,提示DHA-S會抑制大鼠的凝血功能,其抗凝作用與給藥時間呈正相關,且雌性大鼠比雄性大鼠更加敏感。

DHA-S與華法林具有相似的雙香豆素結構,華法林通過抑制VKOR的活性來發(fā)揮抗凝血作用,其亞型Vkorc1被鑒定為香豆素藥物的分子靶點,Vkorc1還是維生素K循環(huán)中的關鍵酶[15-16]。本試驗測定了DHA-S不同天數(shù)處理組Vkorc1蛋白和mRNA表達水平的測定,結果顯示隨著DHA-S處理天數(shù)的增加,不同性別大鼠200 mg/kg DHA-S處理組肝臟內Vkorc1mRNA及蛋白表達水平均呈下降趨勢,雌性大鼠Vkorc1的表達低于雄性大鼠,且雌雄大鼠肝臟中Vkorc1的表達量與PT、APTT的相關性都較好。表明DHA-S通過抑制大鼠肝臟中Vkorc1 mRNA及蛋白的表達,繼而導致大鼠出血,與華法林的誘導出血的作用機制相似[17],同時DHA-S對Vkorc1表達的抑制作用存在性別差異,對雌性大鼠抑制作用更強。

由于脫氫乙酸鈉的防霉抗菌特性,隨著其作為飼料添加劑的廣泛應用,其不良反應的相關報道越來越多[18-19],但關于凝血障礙的報道有限。本試驗通過連續(xù)給與大鼠200 mg/kg的DHA-S 11 d,發(fā)現(xiàn)雌性大鼠給藥9 d后出現(xiàn)死亡,雄性大鼠連續(xù)給藥11 d無影響,且隨著給藥時間的增加,DHA-S在大鼠肝臟內蓄積,雌性大鼠肝臟內含量顯著高于雄性大鼠,由此表明在高劑量長期給藥的條件下,雌性大鼠對DHA-S更加敏感。Vkorc1在肝臟中表達量較高,在凝血因子Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ、Ⅹ合成過程中谷氨酸殘基的γ羧化中起重要作用[20],長期給藥后雄性大鼠對DHA-S的吸收比雌性大鼠慢,雌性大鼠肝臟中DHA-S濃度較高,PT及APTT也較雄性大鼠更為延長,表明高劑量長期給藥下,DHA-S對雌性大鼠的抗凝作用更強,這可能是大劑量長期給藥下雌性大鼠更易致死的原因。雌性大鼠肝臟中DHA-S濃度高于雄鼠,可能與不同性別對DHA-S的吸收、分布有關,也可能與不同性別大鼠對DHA-S的代謝存在差異有關,還有待進一步研究。

結果表明200 mg/kg DHA-S灌胃給予大鼠后,PT和APTT的顯著延長,可致大鼠凝血異常。雌性大鼠對DHA-S致凝血功能障礙的敏感性高于雄鼠,與DHA-S在不同性別大鼠肝臟中的濃度及對肝臟中VKORC1的抑制有關。