王雪艷,李建飛,曹婷婷,劉曉霞,李沛軒,劉麗萍,王雯慧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

1963年,科學(xué)家首次提出黏膜分泌物中含有免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA),隨后Chodirker W B,Tomasi T B在眼淚、膽汁、唾液、初乳和腸道分泌物中證實了這一觀點。IgA分為血清型和分泌性(secretory immunoglobulin A,SIgA),由于SIgA在胃腸道黏膜層大量產(chǎn)生,有研究發(fā)現(xiàn)SIgA可以明顯地與胃腸道內(nèi)的抗原、毒素、外源性蛋白及微生物結(jié)合,以抑制其透過胃腸道黏膜上皮[1,2], 胃腸道SIgA也是調(diào)節(jié)共生細(xì)菌種群的關(guān)鍵[3]。 SIgA通過抑制和控制微生物種群,阻止它們進入腸道免疫系統(tǒng),從而減少內(nèi)源性細(xì)菌引起的局部炎癥[4]。

近年來有學(xué)者研究了IgA分泌細(xì)胞在雞、黃牛、豬等不同動物呼吸道黏膜的分布特征[5-7],也有人研究了雙峰駝腸道相關(guān)淋巴組織(gut associated lymphoid tissues,GALT)中和家兔鼻腔中IgA分泌細(xì)胞的分布特征[8-9],宋晨等人研究了SIgA在初生牦牛小腸的分布規(guī)律[10],但對于家兔胃腸道黏膜中IgA分泌細(xì)胞的分布規(guī)律未見報道。本文研究IgA分泌細(xì)胞在不同年齡組及同一年齡組不同部位家兔胃腸道黏膜的分布特征,為研究家兔胃腸道黏膜免疫特點提供了相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物福利與倫理委員會批準(zhǔn),于蘭州大學(xué)實驗動物中心購買30只家兔,分為3組,即幼年組(2月齡左右)、青年組(5～7月齡)和老年組(36月齡),每組各10只,雌雄各半。

1.1.2 主要試劑 鼠源多克隆一抗IgA (Gene Tex);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗(Immuno Way);DAB顯色液(Immuno Way);TBS緩沖液 緩沖液(Biosharp);高效切片石蠟,上海華申康復(fù)器械有限公司產(chǎn)品; 30%過氧化氫、甲醛、甲醇、二甲苯、,國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 KD-TS3A自動組織脫水機,浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;HistoCore MULTICUT 輪轉(zhuǎn)式切片機,徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司產(chǎn)品;KD-H烘片機,浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;KD-P攤片機,浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;BX43+SC50正置顯微鏡帶成像系統(tǒng),Olympus Corporation產(chǎn)品;HY-4H振蕩器,常州市金壇大地自動化儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 采樣 實驗動物耳緣靜脈注射0.1 mL/kg戊巴比妥鈉致死,迅速剖檢,分別采取胃底腺區(qū)、幽門腺區(qū)及小腸(十二指腸、空腸、回腸)、大腸(盲腸、結(jié)腸、直腸)等不同部位的組織學(xué)樣品,快速放入50 mL離心管(加30 mL左右的多聚甲醛)中固定12～24 h,期間更換固定液2次。

1.2.2 制作石蠟切片 每只實驗動物同一組織部位(例如:胃底腺)隨機采取3塊組織,置于同一包埋框中,進行梯度脫水,透明、浸蠟、包埋。待蠟塊凝固后修塊,每個蠟塊隨機不連續(xù)切5張(厚度4 μm)、攤片(溫度38℃)、貼片,漓片架控干多于水分放置于烘片機烘片(溫度60℃)備用。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 烘干后的切片梯度脫蠟后蒸餾水洗滌2次×3 min;抗原熱修復(fù)15 min,待自然冷卻后,TBS緩沖液洗滌3次×5 min;滴加5% BSA封閉,37℃孵育40 min,甩去多余液體,不洗;滴加稀釋好的一抗(1∶200),冰箱4℃孵育過夜(約12 h),取出后室溫孵育30 min,TBS緩沖液洗滌3次×5 min;3%過氧化氫室溫孵育30 min,滅活內(nèi)源性生物素酶,TBS緩沖液洗滌3次×5 min;滴加二抗,37℃孵育40 min,TBS緩沖液洗滌3次×5 min;滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC),37℃孵育30 min,TBS緩沖液緩沖液洗滌3次×5 min;室溫避光滴加DAB顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用),在光學(xué)顯微鏡檢測下顯色,以防顯色過度,蒸餾水洗滌2次×3 min;蘇木精輕度復(fù)染(約30 s),酒精逐級脫水及二甲苯透明、中性樹膠封片,并在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

陰性對照組中,用TBS緩沖液代替一抗,其余條件和步驟同陽性組織。

1.2.4 結(jié)果觀察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 將每個組織蠟塊切片共計15張,在BX43+SC50 正置顯微鏡帶成像系統(tǒng)中仔細(xì)觀察,每張切片中隨機選取3個視野照片采集(×100)。用Image-Pro Plus軟件對每個圖片可見視野內(nèi)的IgA分泌細(xì)胞進行數(shù)量統(tǒng)計。然后使用IBM SPSS statistics 20.0軟件對試驗得到的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”,P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。 在Origin Pro 9.1中繪圖。

2 結(jié)果

2.1 IgA分泌細(xì)胞在胃黏膜中的分布特點

IgA分泌細(xì)胞在胃底腺和幽門腺區(qū)主要散在分布于黏膜固有層腺體周圍,IgA分泌細(xì)胞主要呈橢圓形,細(xì)胞核呈圓形,明顯偏于一側(cè),陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要位于胞質(zhì)內(nèi)(圖1)。

A、B、C.分別為幼年組、青年組和老年組的胃底腺區(qū);D、E、F.分別為幼年組、青年組和老年組的幽門腺區(qū)。(IHC-P×1000)A,B,and C.The fundic gland areas in the juvenile,young,and elderly groups,respectively;D,E and F.The pyloric gland areas in the juvenile,young and elderly groups,respectively.(IHC-P×1000)圖1 IgA分泌細(xì)胞在胃黏膜中的分布特征Fig.1 Distribution characteristics of IgA secreting cells in the gastric mucosa

對胃底腺區(qū)和幽門腺區(qū)IgA分泌細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析可得:青年組胃底腺區(qū)IgA分泌細(xì)胞數(shù)量與幼年組和老年組差異極顯著(P<0.01),幼年組和老年組相比差異不顯著(P>0.05);幽門腺區(qū)青年組、幼年組和老年組相比差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

同一柱形代表同一年齡組,**為差異極顯著(P<0.01)The same bar represents the same age group,and ** is highly significant difference(P<0.01)圖2 不同年齡組胃底腺區(qū)和幽門腺區(qū)IgA分泌細(xì)胞數(shù)量Fig.2 Numbers of IgA-secreting cells in the fundic and pyloric gland regions in different age groups

2.2 IgA分泌細(xì)胞在小腸黏膜中的分布特征

IgA分泌細(xì)胞在小腸中主要呈橢圓形,細(xì)胞核呈圓形,明顯偏于一側(cè),陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要位于胞質(zhì)內(nèi)。在十二指腸和空腸主要成群分布于黏膜固有層的結(jié)締組織,在回腸則散在分布于黏膜下層的腸腺周圍(圖3)。

A、D、G.分別為幼年組十二指腸、空腸、回腸;B、E、H.分別為青年組十二指腸、空腸、回腸;C、F、I.分別為老年組十二指腸、空腸、回腸。(IHC-P×1000)A,D and G.The duodenum,jejunum and ileum of the juvenile group,respectively;B,E,and H.The duodenum,jejunum,and ileum of the youth group,respectively;C,F,and I.The duodenum,jejunum,and ileum of the elderly group,respectively.(IHC-P×1000)圖3 不同年齡組小腸黏膜中IgA分泌細(xì)胞特征Fig.3 Characteristics of IgA-secreting cells in the small intestinal mucosa of different age groups

對小腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析可得:青年組十二指腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量與幼年組和老年組相比差異極顯著(P<0.01),幼年組和老年組相比差異顯著(P<0.05);青年組空腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量顯著高于幼年組和老年組(P<0.05),幼年組和老年組相比差異不顯著(P>0.05);青年組回腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量顯著高于幼年組和老年組(P<0.05),幼年組和老年組相比差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

同一柱形代表同一年齡組,**為差異顯著(P<0.01)*為差異顯著(P<0.05)The same bar represents the same age group,and * * is extremely significant difference(P<0.01),* is significant difference(P<0.05)圖4 不同年齡組小腸黏膜IgA分泌細(xì)胞數(shù)量Fig.4 Numbers of IgA secreting cells in the small intestine in different age groups

2.3 IgA分泌細(xì)胞在大腸黏膜中的分布特征

IgA分泌細(xì)胞在大腸主要呈橢圓形,細(xì)胞核呈圓形,明顯偏于一側(cè),陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要位于胞質(zhì)內(nèi)。IgA分泌細(xì)胞在幼年組和老年組的盲腸和結(jié)腸中主要散在分布于固有層腸腺周圍,而青年組主要成群分布于黏膜固有層的結(jié)締組織中。IgA分泌細(xì)胞在直腸中均散在分布于固有層腸腺周圍(圖5)。

A、D、G.分別為幼年組盲腸、結(jié)腸、直腸;B、E、H.分別為青年組盲腸、結(jié)腸、直腸;C、F、I.分別為老年組盲腸、結(jié)腸、直腸。(IHC-P×1000)A,D,and G.The cecum,colon,and rectum of the juvenile group,respectively;B,E,and H.The cecum,colon,and rectum of the youth group,respectively;C,F,and I.The cecum,colon,and rectum of the elderly group,respectively.(IHC-P×1000)圖5 不同年齡組大腸黏膜IgA分泌細(xì)胞特征Fig.5 Characteristics of IgA-secreting cells in the large intestine mucosa of different age groups

對大腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析可得:青年組盲腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量顯著高于幼年組和老年組(P<0.05),幼年組和老年組相比差異不顯著(P>0.05);青年組結(jié)腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量與幼年組和老年組相比差異極顯著(P<0.01),幼年組和老年組相比差異顯著(P<0.05);青年組直腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量與幼年組差異極顯著 (P<0.01),和老年組差異顯著(P<0.05),幼年組和老年組相比差異顯著(P<0.05)(圖6)。

同一柱形代表同一年齡組,**為差異極顯著(P<0.01)*為差異顯著(P<0.05)The same bar represents the same age group,and * * is extremely significant difference(P<0.01),* is significant difference(P<0.05)圖6 不同年齡組大腸黏膜IgA分泌細(xì)胞數(shù)量Fig.6 Numbers of IgA secreting cells in the large intestinal mucosa in different age groups

2.4 不同年齡組胃、小腸、大腸黏膜IgA分泌細(xì)胞數(shù)量趨勢

在不同年齡組胃、小腸、大腸黏膜等不同部位中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量以十二指腸部位最多,整體呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(圖7)。

同一線形代表同一年齡組The same line represents the same age group圖7 不同年齡組胃、小腸、大腸黏膜中IgA分泌細(xì)胞趨勢Fig.7 Trends of IgA-secreting cells in the mucosa of the stomach,small and large intestines in different age groups

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn):IgA分泌細(xì)胞數(shù)量在幼年組、青年組和老年組均呈現(xiàn)出小腸黏膜分布最多的特點,而小腸中主要分布在十二指腸。Pabst,Oliver等人研究得出:腸道是機體內(nèi)黏膜漿細(xì)胞數(shù)量分布最多的部位[11]。Seikrit C,Pabst O等人研究發(fā)現(xiàn)IgA是小鼠和人體內(nèi)產(chǎn)生最多的抗體[12],大多數(shù)分泌IgA的漿細(xì)胞局限于黏膜組織,尤其是腸道[2]。Brandtzaeg P,Johansen FE等人研究發(fā)現(xiàn)人體中大約80%的漿細(xì)胞來源于腸道相關(guān)淋巴組織(Gut associated lymphoid tissues,GALT),它們所產(chǎn)生的SIgA比所有其他免疫球蛋白的總和還要多[13]。我們的研究結(jié)果和以上研究基本一致。SIgA是位于腸道的主要免疫效應(yīng)產(chǎn)物之一,不僅可以影響腸內(nèi)微生物種群的組成,并且還可以抵御輪狀病毒等腸道病原體。SIgA作為腸黏膜的一線保護屏障,其在調(diào)節(jié)宿主免疫生理穩(wěn)態(tài)中也起著關(guān)鍵作用[14]。根據(jù)以上研究我們可以推測SIgA在家兔小腸中也可以發(fā)揮同樣作用。

本研究發(fā)現(xiàn)家兔青年組胃、小腸、大腸黏膜中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量高于幼年組和老年組,其可能原因有以下幾個觀點:第一,與胃腸道相關(guān)淋巴組織的發(fā)育有關(guān),因為胃腸道相關(guān)淋巴組織是IgA分泌細(xì)胞產(chǎn)生的主要場所[15];第二,外界抗原的誘導(dǎo)。宿主的免疫系統(tǒng)會相互影響微生物種群的組成[16],這樣一個過程可能被認(rèn)為是宿主的SIgA與其腸道微生物種群的相互影響。第三,T細(xì)胞非依賴性途徑。 因為青年組胃腸道相關(guān)淋巴組織已經(jīng)發(fā)育成熟,幼年組處于正發(fā)育階段,而老年組機能處于退化階段。青年組和幼年組比較,抗原侵襲的頻率和種類更多。但這一觀點不能合理的解釋青年組IgA分泌細(xì)胞數(shù)量高于老年組的原因。至于胃黏膜中各年齡段IgA分泌細(xì)胞數(shù)量均表現(xiàn)為幽門腺區(qū)高于胃底腺區(qū),推測可能是受到胃PH值及微生物數(shù)量及種類的影響。而大腸中盲腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量最多的原因可能是由兔子特有的圓小囊結(jié)構(gòu)所決定的。

4 結(jié)論

本研究采用石蠟組織切片和免疫組織化學(xué)方法對健康家兔的幼年組(2月齡)、青年組(5～7月齡)及老年組(36月齡)胃腸道黏膜中中IgA分泌細(xì)胞分布特征進行染色觀察,并對分泌細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計分析。IgA分泌細(xì)胞數(shù)量在3個不同年齡組中均呈現(xiàn)出十二指腸分布最多。青年組胃腸道中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量高于幼年組和老年組。同一年齡組中胃、小腸、大腸呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。本試驗結(jié)果將為研究胃腸道相關(guān)淋巴組織IgA分泌細(xì)胞提供理論性支持。