梁富程,何志強,張偉楠,鞏志丹,范曉棠,魯元剛

（1. 陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院整形美容科，重慶 400042；2. 中國人民解放軍31411部隊，遼寧 沈陽 110020；3. 陸軍軍醫(yī)大學醫(yī)學心理系軍事認知心理學教研室，重慶 400038）

臨床上燒創(chuàng)傷、腫瘤及潰瘍等常導致皮膚創(chuàng)面不能愈合或無愈合傾向，不僅增加了治療難度，還加重了患者的經濟負擔，已成為一個棘手的公共問題[1]。研究發(fā)現，各種致病因素會引起核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號通路的持續(xù)激活，并促進白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素6（interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎癥因子的釋放，進而導致炎癥過程的持續(xù)存在[2]。持續(xù)的炎癥狀態(tài)和異常的炎癥因子分泌會導致傷口愈合停留在炎癥階段，是臨床上皮膚創(chuàng)面遷延不愈的重要原因[3]。目前，針對創(chuàng)面延遲愈合的治療方法仍不能很好地解決炎癥問題，導致病情反復，效果不佳。因此，尋找一種新型主動抗炎藥物促進皮膚創(chuàng)面的愈合，從而實現創(chuàng)面解剖和功能的重建與修復具有重要意義[4-5]。

富勒醇（fullerenol,FUL）作為一種新型的生物材料，是具有多羥基的C60分子，因其具有性質穩(wěn)定、價格低廉、較好的生物相容性等優(yōu)點而被廣泛關注。但其生物合成過程中可能會產生大量的有機溶劑及酸堿，限制了其應用。本研究所采用的富勒醇通過催化劑輔助機械化學方法合成，可提高產量且不需要純化[6]。在抑郁癥及放射性皮炎等動物模型中，富勒醇表現出良好的抗氧化活性和化學抗炎等功能[6-7]；但其對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響目前尚不清楚?；诖耍狙芯拷⑿∈笃つw創(chuàng)面模型，觀察經富勒醇治療的效果并初步探討其機制，以期為臨床皮膚創(chuàng)面修復提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡雄性健康C57BL/6小鼠24只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[生產許可證號：SYXK(渝)2017-0002]，體質量18～23 g，每籠4只飼養(yǎng)，自由飲水、飲食，環(huán)境溫度21～24 ℃，相對濕度50%～60%，維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜交替節(jié)律。所有實驗均在陸軍軍醫(yī)大學軍事認知心理學教研室動物實驗室進行。

1.2 主要試劑

富勒醇根據高能物理研究所和國家納米科學技術中心（中國北京）的報告合成，并溶于0.9%生理鹽水中（10 mg/mL）。RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天公司，ELISA試劑盒購自廈門慧佳科技有限公司，反轉錄試劑盒購自美國賽默飛公司，脫毛膏購自法國薇婷公司，HE染色試劑盒購自上海碧云天公司，Masson染色試劑盒購自上海貝博生物公司。

1.3 實驗分組及模型建立

將24只小鼠隨機分為假手術組（對照組）、模型組+生理鹽水組（NS組）及模型組+富勒醇組（FUL組），每組8只。給予小鼠1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部術區(qū)備皮后，于俯臥位固定，術區(qū)常規(guī)碘伏消毒，乙醇脫碘，脫毛膏脫毛。真手術組建模：通過打孔的方式在小鼠背部作2個直徑6 mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，術后單籠喂養(yǎng)[8-9]。建模成功后，立即給予FUL組小鼠腹腔注射10 mg/kg富勒醇[6]，其余2組注射等體積生理鹽水。各組小鼠每日給藥1次，連續(xù)7 d。干預結束后，麻醉狀態(tài)下處死小鼠，取材制作切片并進行相應檢測。

1.4 皮膚創(chuàng)面愈合率的計算

治療后第3、7天，數碼相機采集小鼠皮膚創(chuàng)面圖片，利用Image J軟件分析圖像，每只小鼠的創(chuàng)面面積取平均值，創(chuàng)面愈合率=（創(chuàng)面初始面積-第n天創(chuàng)面面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.5 HE染色

采用HE染色試劑盒，將創(chuàng)緣石蠟切片放入二甲苯中，梯度乙醇水化后，依次放入蘇木素、伊紅染液進行染色，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片并拍照。分析圖像，計算上皮爬行距離及肉芽組織厚度。

1.6 Masson染色

采用Masson染色試劑盒，將創(chuàng)緣切片脫蠟（方法同HE染色），依次加入蘇木素、麗春紅、苯胺藍等進行染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后拍照。分析圖像，統(tǒng)計膠原容積分數。

1.7 Western blot檢測相關蛋白表達

每組分離3只小鼠皮膚創(chuàng)面樣本，在4 ℃的RIPA裂解緩沖液中研磨勻漿，4 ℃下以15 000 r/min離心裂解產物10 min，使用二辛可寧酸試劑盒測定蛋白濃度。將樣品（每泳道10 μL）在10% SDS-PAGE上以80 V分離120 min，然后以220 mA轉移到PVDF膜上120 min。5%脫脂牛奶室溫封閉3 h。然后將膜與IL-1β（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、NF-κB（1∶1 000）、β-actin (1∶10 000）一抗孵育，再與辣根過氧化物酶結合的二抗孵育。通過增強化學發(fā)光法觀察膜上的特異性蛋白條帶。使用Image Lab軟件計算條帶的灰度值。

1.8 RT-qPCR檢測相關mRNA表達

每組分離3只小鼠皮膚創(chuàng)面樣本，研磨勻漿后置于4 ℃ TRIzol試劑中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，4 ℃下以12 000 r/min離心裂解產物10 min。取水相溶液，添加200 μL 70%乙醇(無RNase水配制)到吸附柱。離心后，使用Nano Drop 2000分光光度計測定RNA濃度，按照說明書逆轉錄為cDNA，PCR儀進行RT-qPCR，采用比較周期閾值方法定量RNA的相對量。引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.9 ELISA檢測血清炎癥因子水平及氧化應激水平

干預結束后，每組取6只小鼠血液常溫放置2 h后離心，得到血清樣本；取創(chuàng)緣組織采用預冷的PBS清洗，去除血跡及多余筋膜，剪碎并稱重。組織和PBS（含蛋白酶抑制劑）按照質量體積比1∶9混勻，充分研磨后，以3 000 r/min離心10 min，獲取組織勻漿。按照說明書操作，使用比色法分別計算血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量及創(chuàng)緣組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。

1.1 0 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以均數±標準差（）表示，2組間比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量變化

各組小鼠每天的體質量無明顯變化（P＞0.05），見圖1，說明富勒醇對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響。

圖1 小鼠每日體質量變化圖

2.2 小鼠創(chuàng)面愈合情況

NS組和FUL組小鼠的創(chuàng)面均隨著時間推移不斷變小，在同一時間點，FUL組小鼠的愈合率均高于NS組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 小鼠創(chuàng)面愈合情況

2.3 小鼠創(chuàng)面HE染色及Masson染色

HE染色結果顯示，治療后第7天，與NS組相比，FUL組上皮結構連續(xù)、完整，上皮爬行距離遠，肉芽組織更厚，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Masson染色結果顯示，治療后第7天，FUL組的膠原纖維更加密集且排列整齊，膠原容積分數高于NS組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，見圖3。

圖3 小鼠創(chuàng)面組織HE染色及Masson染色

2.4 各組小鼠創(chuàng)面組織IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB的蛋白表達水平比較

治療后第7天，FUL組小鼠皮膚創(chuàng)面組織的IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB的蛋白表達水平均低于NS組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但FUL組以上蛋白表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子的蛋白表達

2.5 各組小鼠創(chuàng)面組織IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達水平比較

RT-qPCR結果顯示，治療后第7天，FUL組的創(chuàng)面組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達均低于NS組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但FUL組以上炎癥因子mRNA的表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子的mRNA表達

2.6 各組小鼠血清炎癥因子及創(chuàng)面組織氧化應激水平比較

ELISA結果顯示，治療后第7天，FUL組的血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于NS組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），FUL組以上血清炎癥因子水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與NS組相比，FUL組創(chuàng)面組織的MDA含量明顯下降，SOD活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但FUL組氧化應激水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 小鼠血清炎癥因子及創(chuàng)面組織氧化應激水平

3 討論

創(chuàng)面修復是一個復雜而有序的生物學過程，大致可以分為出血炎癥期、細胞增殖期、組織重塑期，三個時期相互獨立又彼此緊密聯系。皮膚傷口修復的關鍵因素是傷口炎癥、傷口收縮和上皮再形成[10]。皮膚創(chuàng)面難治愈的主要原因在于其不遵循正常有序的愈合過程，可能出現角化細胞遷移障礙、創(chuàng)面上皮化困難、炎癥因子持續(xù)釋放、巨噬細胞比例失調等。既往研究發(fā)現，創(chuàng)面難愈合與氧化應激和炎癥過程持續(xù)存在有關，炎癥和氧化應激之間相互作用，互為因果[11]。目前，藥物治療均無法達到理想效果，精準調節(jié)炎癥過程，并解決傷口過度氧化應激問題是促進皮膚創(chuàng)面愈合的關鍵。

出血炎癥期作為創(chuàng)面愈合的初期，也是傷口的第一道防御機制，對整個愈合過程至關重要[12]。炎癥反應中的抗炎和促炎因子是一把雙刃劍，適度炎癥對組織修復有益，但過度炎癥不利于傷口愈合[13]。適度炎癥可以激活中性粒細胞，釋放炎癥因子，同時激活機體釋放轉化生長因子、血小板衍生生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子等，這些生長因子會吸引更多的免疫細胞參與創(chuàng)面的愈合過程。NF-κB是一種參與先天和適應性免疫反應的轉錄因子，其適度活化對于機體抵御創(chuàng)傷、感染等具有重要意義，過度活化又可誘導IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的過度表達；TNF-α也可以激活NF-κB通路的轉錄和表達，NF-κB通路的激活又可以誘導多種炎癥介質的表達，形成一個自分泌增強的回路，加劇炎癥反應。本研究中，FUL組IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB的表達水平較NS組均有不同程度下降，說明富勒醇具有調節(jié)傷口炎癥的能力，其可以調控創(chuàng)緣NF-κB的水平，從而減少創(chuàng)面周圍組織及血液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達，有助于創(chuàng)面正常愈合。

皮膚創(chuàng)面的局部微環(huán)境被破壞，如氧化應激水平升高、血液灌注不良等，會導致創(chuàng)面愈合困難[14-15]。因此，調節(jié)創(chuàng)面氧化應激水平也極為重要。MDA是脂質與氧自由基反應形成的產物之一，其與皮膚創(chuàng)面不愈合密切相關[16]。氧自由基可加快巨噬細胞遷移，引起炎癥和促纖維化細胞因子的釋放，進一步刺激活性氧產生。過量的活性氧可通過激活對氧化還原狀態(tài)敏感的轉錄因子NF-κB從而促進促炎因子的表達，進一步上調血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1及單核細胞趨化蛋白-1等與炎癥相關的基因產物的表達，加劇炎癥反應；此外，自由基所致的氧化應激與炎癥通過調控轉錄水平進而相互影響，形成自由基-氧化應激-炎癥-氧化應激-自由基的惡性循環(huán)。氧化應激通過氧化加重炎癥反應，炎癥通過炎癥介質促進氧化。本研究結果顯示，與NS組相比，FUL組小鼠創(chuàng)面組織中MDA水平顯著降低，而SOD水平顯著升高，說明經富勒醇治療后，傷口周圍的氧化應激水平下降，表明富勒醇在抑制炎癥反應的同時，可降低傷口周圍組織中的氧化應激水平，協(xié)同降低炎癥水平，共同促進皮膚創(chuàng)面的愈合。

再上皮化和傷口收縮是影響傷口愈合的另一重要因素。急性損傷的治療需要快速有效的上皮化過程以恢復皮膚完整性。皮膚愈合需要新生上皮在傷口床上擴張[17-19]。本研究HE染色結果顯示，與NS組相比，FUL組新生上皮更長，肉芽組織更厚，說明富勒醇可促進再上皮化。有效的傷口收縮有利于縮短愈合時間，而膠原纖維的沉積與有序排列對于提高傷口組織重塑也有不可或缺的作用[20-21]。本研究Masson染色結果顯示，FUL組較NS組有更多的膠原纖維沉積，膠原結構排列更密集，膠原容積分數更高，說明富勒醇可加快傷口收縮，從而促進傷口愈合。

綜上，富勒醇可有效促進小鼠皮膚創(chuàng)面愈合，其機制可能與富勒醇抑制NF-κB信號通路及下游炎癥因子表達，從而減輕炎癥、氧化應激，促進傷口再上皮化和增強傷口收縮有關。本研究結果可為臨床上創(chuàng)面的相關治療提供參考和實驗依據。但本研究為動物實驗，其臨床有效性和實用性仍有待進一步證實。